阻断白介素12 p40功能的新型治疗性单克隆抗体的开发

阻断白介素12 p40功能的新型治疗性单克隆抗体的开发
李百勇;刁思娴;张鹏;夏瑜;王忠民;王谦;詹建军;黄昭亮;庞醒华;刘志兵;叶才果;李钊明【摘要】Objective To design and produce a new sequence antibody MAB1 that binds to the p40 subunit of IL12 and blocks IL12 function, for treating autoimmune diseases mediated by IL-12 activity. Methods A monoclonal antibody MAB1 which specifically bond to IL-12 p40 was designed and constructed based on the crystal structure of IL-12 p40. The affinity of
MAB1 directed p40 was assessed by indirect ELISA and inhibition of IL-12 induced cutaneous lymphocyte associated antigen (CLA) up-regulation
was assessed by FACS analysis. Results In the present study, monoclonal antibody MAB1 was successfully generated. It possessed high binding affinity to p40 and potent inhibitory effect of IL-12 induced CLA up-regulation. These activities were comparible or equivalent to the properties of ustekinumab. Conclusion Monoclonal antibody MAB1 is a high affinity
IL-12 antagonist and has potential to be developed for autoimmune diseases such as plaque psoriasis.%目的：设计并利用抗体工程方法构建并制备全新序列的阻断白介素12（IL-12）p40功能的单克隆抗体 MAB1，并对其生物
学活性进行鉴定，以制备可应用于治疗多种自身免疫病的 IL-12通路的阻断剂。

方法根据已有的 IL-12 p40蛋白序列，设计、构建并制备了全新的单克隆抗体
MAB1，利用间接 ELISA 测定其与抗原结合的亲和力，并用细胞学方法鉴定它的
生物学活性。

结果抗体 MAB1与 p40抗原的结合亲和力为0.0399 nmol/L，并能明显抑制 IL-12诱导的人皮肤淋巴细胞相关抗原（CLA）水平上调。

其抗原结合能力以及抑制IL-12生物学活性能力与美国强生公司抗体药 Stelara （ustekinumab）
相当或更优。

结论全新构建的单克隆抗体 MAB1可作为 IL-12通路的高亲和力阻
断剂，从而成为自身免疫疾病（例如斑块型银屑病）治疗用新药的临床候选药物。

【期刊名称】《中国医药生物技术》
【年(卷),期】2014(000)004
【总页数】5页(P283-287)
【关键词】细胞因子类;白细胞介素 12 亚单位 p40;抗体,单克隆;自身免疫疾病
【作者】李百勇;刁思娴;张鹏;夏瑜;王忠民;王谦;詹建军;黄昭亮;庞醒华;刘志兵;叶才果;李钊明
【作者单位】528437 广东省中山市，中山康方生物医药有限公司;528437 广东省中山市，中山康方生物医药有限公司;528437 广东省中山市，中山康方生物医药
有限公司;528437 广东省中山市，中山康方生物医药有限公司;528437 广东省中
山市，中山康方生物医药有限公司;528437 广东省中山市，中山康方生物医药有
限公司;528437 广东省中山市，中山康方生物医药有限公司;528437 广东省中山市，中山康方生物医药有限公司;528437 广东省中山市，中山康方生物医药有限
公司;528437 广东省中山市，中山康方生物医药有限公司;528437 广东省中山市，中山康方生物医药有限公司;528437 广东省中山市，中山康方生物医药有限公司【正文语种】中文
方法根据已有的 IL-12 p40 蛋白序列，设计、构建并制备了全新的单克隆抗体MAB1，利用间接 ELISA 测定其与抗原结合的亲和力，并用细胞学方法鉴定它的
生物学活性。

结果抗体 MAB1 与 p40 抗原的结合亲和力为0.0399 nmol/L，并能明显抑制
IL-12 诱导的人皮肤淋巴细胞相关抗原（CLA）水平上调。

其抗原结合能力以及抑制 IL-12 生物学活性能力与美国强生公司抗体药 Stelara（ustekinumab）相当或更优。

结论全新构建的单克隆抗体 MAB1 可作为 IL-12 通路的高亲和力阻断剂，从而成为自身免疫疾病（例如斑块型银屑病）治疗用新药的临床候选药物。

白介素 12（interleukin-12，IL-12），又名细胞毒淋巴细胞成熟因子（cytotoxic lymphocyte maturation factor，CLMF），或者 NK 细胞刺激因子（natural killer cell stimulation factor，NKSF），是白介素家族中的一员。

IL-12 具有独特的异源二聚体结构，是由 p40 和 p35 两个亚基通过二硫键共价连接形成。

IL-12 参与机体的抗肿瘤[1-3]、抗过敏、抗感染[4]过程，但其过量又造成机体免疫调节失衡导致自身免疫病。

由IL-12 诱导并促进细胞介导的自身免疫已在非肥胖性糖尿病（NOD）小鼠动物模型[5]、实验性结肠炎[6]、胶原性关节炎（CIA）以及实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）[7]和实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）[8]动物模型中得到证实。

还有许多研究报道 IL-12 参与狼疮性肾炎的发病机制[9]。

本文应用以晶体结构为基础的单克隆抗体技术构建特异性阻断 IL-12 p40 抗体，作为 IL-12 通路的阻断剂，为自身免疫疾病（例如斑块型银屑病）治疗用新药的临床研究提供候选药物。

1.1.1 细胞与主要试剂 293f 细胞、载体 pcDNA3.1/myc-his(-)A 购自美国Invitrogen 公司，质粒 DNA 经 Invitrogen 进行测序验证；p40 的 cDNA 购自北京傲锐东源公司[SC124116，IL12B （NM_002187）人cDNA 克隆]；大肠杆菌感受态细胞 DH5a、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；DNA ligation kit 购自 Takara（Ver.
2.0 D6022S）；限制性内切酶EcoR I、Hind III 购自美国 NEB 公司；HRP 标记的羊抗人 IgG 购自 Jackson Immuno Research 公司；淋巴细胞分离液购自美国 GE 公司。

1.1.2 仪器 Multiskan FC 型酶标仪、分光光度计 NanoDrop-2000 和 CO2培养箱均购自美国 Thermo 公司；JY600C 型电泳仪为君意东方公司产品；C-1000 touch 型 PCR 仪购自美国 Biorad 公司；AKTA Purifier 10 蛋白纯化液相色谱系统购自美国 GE 公司；Avanti J-E 型高速落地离心机购自美国 Beckman 公司；FACS Calibur 型流式细胞仪购自美国 BD 公司。

1.2.1 p40 筛选抗原表达载体的构建以购买的 p40 cDNA（SC124116）为模板扩增 p40 基因，并在其后加上 his6 纯化标签，两端引入Xba I、BamH I 两个限制性酶切位点，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收 PCR 产物。

将回收后的PCR扩增产物和空载体pcDNA3.1/ myc-his(-)A 分别经限制性内切酶Xba I、BamH I 酶切，再用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收酶切产物，利用 DNA ligation kit Ver.2.0 进行连接反应，然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，涂布于含有 AMP 的 LB 培养基平板上。

挑取平板上的单克隆在 LB 液体培养基进行小量培养并进行菌落 PCR 验证，抽提阳性克隆的质粒 DNA，并送Invitrogen 进行测序验证。

1.2.2 p40 筛选抗原（p40-his6）的表达及纯化将测序鉴定正确的 his 融合表达载体转染 293f 细胞，于37 ℃，8% CO2，130 r/min 环境下培养 7 d 后，离心收集上清。

将上清于 6000 r/min 离心 20 min，再用0.2 μm 滤膜过滤；滤液经超滤浓缩换液至 Buffer A（50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，10 mmol/L 咪唑，pH 8.0）中，0.2 μm 滤膜再过滤，上样至已用 PBS 平衡好的 1 ml HisTrap HP 柱；待样品上完后用 Buffer A 冲洗，流速1 ml/min。

然后用 0% ~ 60% Buffer B（50 mmol/L Tris，300 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪唑，pH 8.0）15 柱体积线性洗脱，流速 1 ml/min，收集流出峰，并进行 SDS-PAGE 检测；合并相应洗脱峰，并用超滤浓缩管浓缩换液至 PBS 中，由此得到抗原 p40-his。

1.2.3 p40 抗体 MAB1 序列的设计 p40 抗体 MAB1 的序列是根据 p40 蛋白的
三维晶体结构[10]设计。

其重链氨基酸序列如下：EVQLVQSGAEVKK PGESLKISCQSSGYSFTTYWIGWVRQMPGQGLEWIGIMSPVDSDIRYNPMFRGQ VTMSVDKSSSTAYLQWSSLKASDTAMYYCARRRPGQGYFDFWGQGTMVTVSSA STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVL QSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVH NAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKG QPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK；其轻链氨基酸序列如下：EIVLTQSPATLS ASPGERATISCRASQSVSSWLAWYQQKPGQAPRSLIYAASNLQSGIPARFSGSGS GTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQYNIYPYTFEGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQL KSGTASVVCLINNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLT LSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

1.2.4 p40 抗体 MAB1 表达载体的构建合成抗体 MAB1 的轻链和重链 cDNA 片段（包括Xba I 酶切位点、Kozak 序列、信号肽、轻/重链的编码区和Hind III 酶切位点，cDNA 序列及扩增引物均由中山康方生物医药有限公司设计），将带有
酶切位点的轻链和重链 cDNA 片段以及空载体pcDNA3.1/myc-his(-)A 分别经限制性内切酶Xba I，Hind III 双酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒分别回收酶切产物，利用 DNA ligation kit Ver.2.0 进行连接反应，将重链的 cDNA 插入载体
pcDNA3.1/ myc-his(-)A 的Xba I，Hind III 酶切位点之间。

然后将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5a，涂布于含有 AMP 的 LB 平板上。

挑取 LB 平板上的
转化感受态细胞 DH5a 的单克隆用 LB培养基进行小量培养并进行菌落 PCR 验证，
将含有插入片段的克隆作为阳性克隆，抽提阳性克隆的质粒 DNA，并送Invitrogen 进行测序验证。

1.2.5 p40 抗体 MAB1 的表达及纯化将测序鉴定正确的 MAB1 重链表达载体和轻链表达载体（1:1）共转染293f细胞，37 ℃，8% CO2，130 r/min 培养 7 d 后，离心收集上清。

将上清 6000 r/min 离心 20 min，并用0.2 μm 滤膜过滤，收集滤液；滤液上样至已用 PBS 平衡好的 1 ml HiTrap protein A HP柱中；待样品上完后用 PBS 冲洗，流速1 ml/min，紫外监测为基线；改用 0.1 mol/L 柠檬酸（pH 3.5）洗脱，流速 1 ml/min，收集流出峰，并进行 SDS-PAGE 检测；合并相应洗脱峰，并用超滤浓缩管浓缩换液至 PBS 中。

1.2.6 间接 ELISA 测定p40 抗体 MAB1 的半数有效浓度 EC50 酶标板用抗原
p40-his（0.125 μg/ml）包被，37 ℃孵育 2 h。

加入封闭液4 ℃孵育过夜。

加入梯度浓度的抗体 MAB1 为一抗，37 ℃温育 30 min。

用 HRP 标记的羊抗人 IgG 作二抗（0.08 μg/ml），37 ℃孵育 30 min。

TMB 显色剂，用酶标仪测 450 nm 处OD值。

1.2.7 CLA 蛋白表达水平检测将新鲜血液与淋巴细胞分离液按 3:4 的比例混合均匀，离心后取中间白膜状细胞层即外周血单核细胞（PBMC）层，用血液缓冲液清洗 PBMC 后加入含 15%胎牛血清，25 mmol/L β-巯基乙醇，1%双抗的 RPMI 1640 完全培养基并置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。

将获得的 PBMC 按 2 × 106个/ml 密度接种于 6 孔板，加入植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）（50 μl/ml）培养 3 d 后收集细胞。

按1 ×105个/孔接种于 96 孔板，加入 IL-12（1 ng/ml）和（或）不同浓度的 MAB1 培养 3 d 后收集细胞。

用 APC （1%）标记的抗人皮肤淋巴细胞相关抗原（CLA）抗体孵育 1 h 后，用流式细胞仪 FL4 通道（APC）检测 CLA 蛋白表达情况。

p40 抗原的 cDNA 插入载体 pcDNA3.1/myc- his(-)A 的EcoR I、Hind III 酶切
位点之间，经转化大肠杆菌 DH5a 后的菌落 PCR 验证电泳结果显示含有插入片段的克隆（克隆 4、克隆 5 及克隆 8）为阳性克隆（图 1）。

阳性克隆的质粒 DNA 测序结果显示 C 端带his6 标签的 p40 基因插入了载体pcDNA3.1/myc- his(-)A 中，融合表达载体转染 293f 细胞经纯化后，得到抗原p40-his 融合蛋白。

SDS-PAGE 可见清晰蛋白条带，分子量约 40 kD，与预计一致（图 2）。

p40 抗体 MAB1 的序列是根据 p40 蛋白的三维晶体结构设计。

抗体 MAB1 的cDNA 人工合成后，将轻链和重链 cDNA 插入载体 pcDNA3.1/ myc-his(-)A 的Xba I、Hind III 酶切位点之间，转化大肠杆菌 DH5a。

然后经菌落 PCR 验证，电泳结果显示所有克隆均含插入片段，均为阳性克隆（图 3），抽提出阳性克隆的质粒 DNA，经测序验证，测序结果显示插入序列正确。

MAB1 重链和轻链表达载体经转染 293f 细胞纯化后，对得到的抗体 MAB1 进行SDS-PAGE 检测。

如图 4 所示，SDS-PAGE 检测纯化后的MAB1 目标蛋白大约在 50 kD 和 25 kD。

采用间接 ELISA 方法检测p40 抗体 MAB1的半数有效浓度 EC50，用酶标仪检测在 450 nm 处OD值并与野生型阳性对照抗体 ustekinumab 进行对比。

用软件softmax pro 6.2 进行数据分析，计算出抗体 MAB1 半数有效浓度 EC50为
0.0399 nmol/L，ustekinumab 的 EC50为 0.0935 nmol/L（图 5）。

采用流式细胞技术检测经过抗体处理过的PBMC 细胞的 CLA 水平，结果显示加入了 MAB1 及 ustekinumab 的 PBMC 细胞的 CLA 明显减少（图 6）。

由于 CLA 的上调是由 IL-12 诱导产生，因此证明这两个抗体能抑制 IL-12 诱导CLA 上调的细胞学活性，且 MAB1 与 ustekinumab 相当或更优（图 6）。

IL12是一种促进炎症反应的细胞因子，通过与其受体 IL-12R 的相互作用，能够激活 NK 细胞，增强 NK 细胞的细胞毒作用，也能促进 IFN-r 的分泌，从而促进巨
噬细胞的活化。

IL-12 在肿瘤免疫、感染免疫及自身免疫中都发挥着重要作用。

研究表明系统性红斑狼疮（SLE）患者的 IL-12 的过量表达会促进狼疮性肾炎（LN）的发展[9]。

节段性回肠炎（CD）[6]、变应性哮喘[11]、实验性关节炎（experimental arthritis）[12]、银屑病[13]等炎症疾病的发生也被证实与 IL-12 的过量表达相关。

IL-12 是由两个亚单位 p35 和 p40 构成的异二聚体。

只有当两个亚基形成二聚体时，IL-12 才具有生物学活性。

因此，应用单克隆抗体封闭其 p40 亚基可以起到
抑制 IL-12 活性的作用，从而达到治疗或者缓解炎症疾病的目的。

目前已经证实
IL-23 与IL-12 共用p40 亚基，而IL-23 的过量表达与多种免疫疾病有关，所以，选择 p40 亚基作为阻断的靶标，能够同时抑制 IL-12 及 IL-23 的活性，对相关疾
病的治疗起到更好的作用。

相关研究已证实 p40 单克隆抗体对于多种炎症疾病能
够达到良好治疗效果[14-16]。

目前美国强生公司的IL-12 p40 单克隆抗体ustekinumab 已在美国、英国等多个国家上市，适应证为银屑病。

本研究用的
p40 单克隆抗体 MAB1 采用与 ustekinumab 相同的作用靶点，并且试验证明MAB1 具有更高的亲和力及阻断 IL-12 活性的能力。

MAB1 的开发为包括银屑病
在内的多种免疫性疾病的治疗提供了新的选择。

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Methods A monoclonal antibody MAB1 which specifically bond to IL-12 p40 was designed and constructed based on the crystal structure of IL-12 p40. The affinity of MAB1 directed p40 was assessed by indirect ELISA and inhibition of IL-12 induced cutaneous lymphocyte associated antigen (CLA) up-regulation was assessed by FACS analysis.
Results In the present study, monoclonal antibodyMAB1 was successfully generated. It possessed high binding affinity to p40 and potent inhibitory effect of IL-12 induced CLA up-regulation. These activities were comparible or equivalent to the properties of ustekinumab.
Conclusion Monoclonal antibody MAB1 is a high affinity IL-12 antagonist and has potential to be developed for autoimmune diseases such as plaque psoriasis.。