马鞭草科药用植物的ITS2序列分析与鉴定

马鞭草科药用植物的ITS2序列分析与鉴定
张兵锋
【摘要】本文利用DNA条形码ITS2序列探讨马鞭草科药用植物的分子鉴定和遗传特点.采用ITS2序列通用引物对样品进行PCR扩增、测序,MEGA6.0软件进行数据分析,结果表明:马鞭草科植物ITS2的平均长度为368.4bp,G+C含量为
61.9％,变异位点占32.85％;马鞭草科植物样品间的分化系数为0.757;UPGMA法对马鞭草科属间的系统发育进行聚类分析,成功鉴别供试样本.可见,ITS2片段可作为马鞭草科属间物种DNA条形码分子鉴别序列.
【期刊名称】《宜春学院学报》
【年(卷),期】2016(038)012
【总页数】6页(P12-17)
【关键词】马鞭草科;药用植物;DNA条形码;ITS2
【作者】张兵锋
【作者单位】宜春学院化学与生物工程学院,江西宜春336000
【正文语种】中文
【中图分类】R93
马鞭草科 (Verbenaceae)植物分布全世界，大约有75属3000多种，我国目前发现25个属75个种［1］，其中作为中药药用的植物有14属67种。

该科作为药用的植物多数具有清热解毒、止痛止血、清热镇咳的功效，如马鞭草科紫珠属植物广东紫珠 (CallicarpakwangtungensisChun)，主要用于妇科出血性疾病治疗，主
产于江西，是妇科抗宫炎片的原料药，市场需求量较大［2］;马鞭属植物马鞭草(VerbenaofficinalisL.)性味苦凉，具有解毒、活血化瘀的疗效，民间主要用于治疗感冒引起的咽喉肿痛、清热泻火;牡荆属植物黄荆 (VitexnegundoL.)性味温辛，具有祛风解表，行气止痛的功效，主要用于感冒咳嗽、痔漏、脚气病的治疗。

［3］此外，马鞭草科的大青(ClerodendrumcyrtophyllumTurcz)、臭牡丹(ClerodendrumbungeiSteud)都是常用的药用植物。

随着马鞭草科药用植物的研究与开发越发深入，我国已有江西心正、济民可信、广东白云山等数十家大中型中药企业均以马鞭草科药材为主要原料生产开发相关的中成药，年消耗紫珠资源为50吨左右，药材的使用量日益增加，加速野生资源的耗竭。

因此，对马鞭草科药用植物进行资源普查、鉴定和保护显得非常紧迫。

对药用植物的鉴别和分类上，传统的方法是形态学鉴别，该法需要长期的实践积累从而制约药用植物鉴别的准确性和高效性，随着分子生物学和生物技术的发展，新的分子标记技术应用于药用植物的甄别和分类中，如第一代分子标记技术随机扩增多态性DNA(RAPD)分子标记方法成功鉴别出瓜楼和绞股蓝［4，5］。

随着分子标记技术在物种鉴定方面的深入应用，Heber提出“DNA条形码”概念，期望以一段标准的DNA序列将物种之间区别出来，犹如商品的条形码一般［6］。

目前对植物物种鉴定的有trnK－rps16、psbA－trnH、rp136－rps8、ITS/ ITS2等8个DNA条形码候选热点序列［7］，其中ITS2序列属于核基因，位于26S和5.8SrRNA基因之间，片段较短，易扩增和测序［8］，目前ITS2序列成功鉴别如黄芪属［9］、芸香科［10］、葫芦科［11］等科的物种，鉴别成功率高，因此本试验采用ITS2序列对来源于江西宜春地区马鞭草科多种药用植物进行分子鉴定，分析马鞭草科ITS2序列特征、遗传特性并鉴定物种之间的亲缘关系，为马鞭草科药用植物在资源和种源的研究方面提供实验依据。

1.1 实验材料
本实验所用材料有黄荆VitexnegundoL.、牡荆VitexnegundoL.var.、大青Clerodendrumcyrtophyllum-Turcz.、臭牡丹 ClerodendrumbungeiSteud.、马鞭草VerbenaofficinalisL.、广东紫珠 CallicarpakwangtungensisChun，于2015年3月采集于江西省宜春市周边地区，由周秀玲副教授作植物学形态鉴定。

除此外，其他马鞭草科物种来源于GENEBANK，如表1所示。

1.2 试剂
DNA提取试剂盒 (Plant Genomic DNA Kit， TIANGEN)、DNA回收试剂盒(TIANGEN Midi Purefication Kit)、氯仿、乙醇 (分析纯)、Taq酶购于大连宝生物公司，引物由上海生物 (工程)有限公司合成。

1.3 仪器
超低温冰箱 (7010702，Thermo)、水浴锅(HH－4)、离心机 (Eppendorf－G 5415 R)、PCR扩增仪 (BIO RAD T100 Thermal Cycler)、双稳定时电泳仪 (DYY －6 C)、凝胶检测系统 (Gel Doc XB)等。

2.1 马鞭草科样本DNA提取
采用植物基因组DNA提取试剂盒 (Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)来提取马鞭草科样品的总DNA，具体操作依据说明书进行。

并采用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA样本的纯度和相对浓度，合格样本于－20°C保存备用。

2.2 马鞭草科样本DNA条形码的PCR扩增及产物纯化
2.2.1 PCR方法步骤
本实验采用ITS2序列DNA条形码通用引物序列:ITS2－F，5’－CCTTGTTACGACTTTTACTTCC －3’;ITS2－R，5’－GCATATCAATAAGCGGAGGA－3’。

PCR反应体系:10×buffer:2μL;
MgCl2(25mmol/L):2μL;dNTPmix(2mmol/L): 2μL;Primer－F:1μL;Primer－R:1μL;模板溶液:1μL;Taq酶:0.9μL;ddH2O:10.1μL，总反应体积20μL，每个反应
2管。

PCR反应程序94°C预变性5min，94°C变性30s，55°C退火30s，72°C
延伸30s，35次循环，72°C延伸10min，反应结束4°C保存。

2.2.2 PCR扩增产物纯化
PCR产物用TIANGEN的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒 (TIANGEN Midi Purefication Kit)进行纯化。

2.3 PCR扩增产物序列的测定
将纯化回收后的产物委托上海生物 (工程)有限公司测序。

2.4 序列数据的处理
经过上海生工测序的纯化产物DNA序列用Snapgene Viewer软件打开，拷贝的序列使用软件MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis) 6.0进行序列
分析，采用pair wise distance(PW)法计算遗传距离，邻接法 (neighbor joining method)构建NJ系统发育树;系统树的分支置信度采用自举检验法 (bootstrap test)检验［11］。

3.1 马鞭草科物种的ITS2序列变异分析
28个马鞭草科样本的ITS2序列通过MEGA6.0软件进行序列比对分析，碱基组成如表2所示，28个马鞭草科植物ITS2核酸序列长度波动在267～458bp的范围，平均长度为368.4bp，其中A平均占19.5%，T18.7%，C31.8%，G30.1%;A+C
占比G+C平均占比61.9%，可见马鞭草科植物样本的ITS2片段中G+C的含量较高，其中牡荆属 (Vitex) 的G+C平均含量64.3%，大青属 (Clerodendrum)的为57.8%，马鞭草属 (Verbena)62.3%，紫珠属(Callicarpa)67.9%，G+C含量特征
是紫珠属(Callicarpa) ＞牡荆属 (Vitex) ＞马鞭草属 (Verbena) ＞大青属(Clerodendrum)。

通过MEGA6.0进行序列比对后，间并序列长度为481bp，变异位点如图1所示，共158个，占位点数32.85%;简约信息位点113个，占位点数23.49%。

3.2 马鞭草科物种的ITS2序列遗传特征分析
采用MEGA6.0软件计算属内的平均遗传距离，结果如表3所示，牡荆属 (Vitex)属内平均遗传距离为 0.0418，大青属 (Clerodendrum) 0.0708，马鞭草属(Verbena)0.0141，紫珠属(Callicarpa)0.0267，ITS2序列而言，大青属的种间变异比较大，其次是牡荆属，最小为马鞭草属;属间的遗传距离如表4所示，大青属(Clerodendrum)与马鞭草属 (Verbena)的遗传关系较远，遗传距离为 0.215，牡荆属 (Vitex)与紫珠属(Callicarpa)遗传关系比较近，为0.083;28个马鞭草科植物样本的分化系数为0.757。

本实验采用UPGMA法对28个马鞭草科植物样本的ITS2序列构建系统发育树，结果如图2所示:牡荆属 (Vitex)与紫珠属 (Callicarpa)聚为一支，再与马鞭草属(Verbena)聚为一大亚支，最后与大青属 (Clerodendrum)聚集在一起。

可见，马鞭草科属间遗传关系的亲疏关系为牡荆属 (Vitex)与紫珠属 (Callicarpa)遗传关系最近，其次是马鞭草属(Verbena)，最后是大青属 (Clerodendrum)，聚类分析结果与遗传距离分析结果一致。

加拿大学者Hebert在2003年提出DNA条形码概念以来，DNA条形码这一种分子诊断技术已成为物种鉴定的研究热点。

DNA条形码是以一段标准的DNA短序列一级结构对物种进行分类和鉴定。

目前，动物研究上广泛采用线粒体COI基因一个标准DNA片段进行物种系统分类，而在植物界，还没有一个统一的DNA片段对物种进行鉴定和分类。

当前有多个DNA条形码候选序列如matK、psbA－trnH、rbcL、rpoB、rpoCI等质体基因片段和核基因 ITS、ITS2基因片段用于物种的分类鉴定［12］。

由于各DNA条形码候选序列在不同物种的鉴定中有各自优势，本论文研究的马鞭草科植物，属于有花植物，根据文献调研结果，采用了matK、psbA－trnH、rbcL、ITS2四个DAN条形码候选序列对样本进行扩增;前期实验结果表明:matK、rbcL扩增成功率很低，多个样本在相同PCR扩增条件下
未出现目标条带。

就位于叶绿体上的matK基因而言，在葫芦科植物中PCR扩增
结果与本试验结果一致［11］，这可能与matK基因的引物重复性不好有关系。

psbA－trnH片段，位于叶绿体上，基因两段有保守序列，约长75bp，有利于DNA条形码通用引物的设计，而此片段在本试验中鉴定成功率不高，同时在葫芦科、重楼属物种的表现亦如此。

而ITS2DAN条形码候选序列成功地应用到许多药用植物 (如:黄柏、王不留行、桔梗等)［13，14，15］物种鉴定和分类方面，在本试验中对样本的PCR扩增成功率和样本鉴定率均达到100%，属于较适宜于马鞭
草科植物鉴定的DNA条形码候选序列。

ITS2DNA条形码序列在不同的物种中，长度不一致，G+C含量存在变异，黄柏植物的ITS2长度为226bp，G+C含量平均含量为36.3%，变异位点6个［13］，桔梗属植物的 TIS2序列长平均为500bp，G+C含量为56.6%［15］，本试验中所有马鞭草科植物样本共28个，ITS2序列长度在267～458bp，平均长度为368.4bp，G+C平均含量61.9%，可见马鞭草科在ITS2序列上长度和G+C含量的变异方便约大。

牡荆属 (Vitex)属样本的ITS2序列可发现，在5’－端出现能形成颈环结构的序列:5’－cccccccTCCTGCGCATCGCGCTCGCGA Tggggggg－3’，其他属样本间在5’－端在此结构中出现变异，此序列结构不明显。

从遗传
距离指标和系统聚类分析发现，ITS2序列对于马鞭草的药用植物的鉴定是可靠的，因为ITS2序列能将样本间区别出来，所以ITS2是马鞭草科药用植物鉴定的潜在
优质DNA条形码序列。

马鞭草科药用植物多用于止痛止血、清热镇咳、祛风活血等方面，同时有些药用植物还有观赏价值，如紫珠属植物，秋天火红的果实挂满树枝，非常美丽，寓意吉祥，可作为较好的盆景植物来培育。

可见马鞭草科药用植物种源是潜在开发利用的天然资源，对其进行种源调查和鉴定对于马鞭草科药用植物的研究与开发非常有意义。

本论文因为采集样本不多，初步研究表明通过ITS2序列特征可以将马鞭草科共四
个属28个样本成功鉴定，而马鞭草科是一个大科，其中具有药用价值的植物有
14属67种8变种2变型，本研究仅收集小部分，对马鞭草科药用植物种源的研
究有待于采集更多样本进行深入研究，更有利于其研究与开发。

【相关文献】
［1］吴征镒，周太炎，肖培根，等.新华本草纲要(第一册) ［M］.上海:上海科学技术出版社，1988:397－416
［2］谷陟欣，刘宇婧，颜冬兰，等.裸花紫珠、大叶紫珠和广东紫珠的研究进展［J］.中国医药导报，2011，8(29):11 －12
［3］萧成纹.侗族医药探秘［M］.长沙:岳麓书社，2004: 129－138.
［4］孙稚颖，周凤琴.山东产瓜蒌不同农家品种的RAPD研究［J］.中草药，2006，37(3):426－429.
［5］庞敏，邹芳平，肖娅萍，等.应用RAPD技术构建绞股蓝DNA指纹图谱［J］.陕西师范大学
学报，2006，34(3): 87－91.
［6］HebeP D N，Cywinska A，Ball S L，et a1.Biological identifications through DNA barcodes［J］.Proceedings of the RoyalSociety B:Biological Sciences，2003，(270):313－321.
［7］Chase M W，Cowan R S，Hollingsworth P M，et al.A proposal for standardised protocol to barcode all land plants ［J］.Taxon，2007，56(2):295－299.
［8］Chiou S J，Yen J H，Fang C L，et a1.Authentication of medicinalherbs using PCR－amplified ITS2 with specific primers［J］.PlantaMedica，2007，73(13):1421－1426
［9］高婷，姚辉，马新业，等.中国黄芪属药用植物DNA条形码(ITS2)鉴定［J］.世界科学技术—中医药现代化，2010，12(2):222－227.
［10］罗焜，陈士林，陈科力，等.基于芸香科的植物通用DNA条形码研究［J］.中国科学:生命科学，2010，40 (4):342－358.
［11］李妮，陈士林，刘义梅，等.葫芦科植物通用DNA条形码的筛选［J］.中草药，2011，
42(7):1396－1401.
［12］Kress W J，Wurdack K J，Zimmer E A，et e of DNA-barcodes to identify flowering plants［J］.Proc Natl AcadSci USA，2005，(102):8369－8374.
［13］汤欢，向丽，赵莎，等.应用DNA条形码ITS2序列对市售药材黄柏的鉴定研究［J］.2016，18(2):184－190.
［14］马双姣、周建国，金钺，等.王不留行种子的ITS2序列分子鉴定研究［J］.世界科学技术一
中医药现代化，2016，18(1):29－34.
［15］吴波，李永波，饶建波，等.基于ITS2条形码的桔梗药材遗传多样性研究［J］.中国中药杂志，2015，40(6): 1075－1078.。