特殊医学用途婴儿配方食品中乳铁蛋白的检测

特殊医学用途婴儿配方食品中乳铁蛋白的检测
管 乐，代江华，江 杏，章肇敏*
（江西金薄金生态科技有限公司，江西 高安 330812）
摘 要：建立特殊医学用途婴儿配方食品中乳铁蛋白的高效液相色谱（high performance liquid chromatography ，HPLC ） 检测方法。

试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取，肝素亲和柱净化后，用反相-HPLC 分离，以0.1%三氟乙酸和乙腈 作为流动相进行梯度洗脱，HPLC 仪紫外检测器检测，外标法定量。

结果表明：在乳铁蛋白质量浓度50～500 μg /mL 范围内，检测结果呈现良好线性关系；该方法的检出限为5 mg /100 g ，定量限为15 mg /100 g ，平均回收率为93.9%；同一质量浓度乳铁蛋白标准溶液的测定相对标准偏差（relative standard deviation ，RSD ）为0.12%，稳定性实验中平行实验检测结果的RSD 为0.96%；能力验证结果表明可靠性好。

此方法方便、快捷、准确、可靠、重复性好，能够有效检测特殊医学用途婴儿配方食品中乳铁蛋白的含量。

关键词：特殊医学用途婴儿配方食品；乳铁蛋白；高效液相色谱
Detection of Lactoferrin in Formulas for Special Medical Purposes Intended for Infants
GUAN Yue, DAI Jianghua, JIANG Xing, ZHANG Zhaomin *(Jiangxi Jinbojin Eco-technology Co. Ltd., Gao ’an 330812, China)
Abstract: In this study, a high performance liquid chromatography (HPLC) method was developed for the determination of lactoferrin in formulas for special medical purposes intended for infants. Lactoferrin from samples was extracted with phosphate buffer. After being purified on a heparin affinity column, the analyte was separated by reversed-phase HPLC using gradient elution with 0.1% trifluoroacetic acid and acetonitrile mixture as the mobile phase, detected by a UV detector and quantitated by the external standard method. Results showed that good linearity was observed for lactoferrin in the concentration range of 50–500 μg /mL. The detection limit of the method was 5 mg /100 g, and the quantitation limit was 15 mg /100 g. The average recovery was 93.9%. The precision expressed as relative standard deviation (RSD) was 0.12%, and the stability RSD was 0.96%. Proficiency testing confirmed the reliability of the method. This method was convenient, fast, accurate, reliable and reproducible, and could effectively detect lactoferrin in formulas for special medical purposes intended for infants.
Keywords: formulas for special medical purposes intended for infants; lactoferrin; high performance liquid chromatography DOI:10.15922/ki.jdst.2018.04.005
中图分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1671-5187（2018）04-0021-04
引文格式：
管乐, 代江华, 江杏, 等. 特殊医学用途婴儿配方食品中乳铁蛋白的检测[J]. 乳业科学与技术, 2018, 41(4): 21-24. DOI:10.15922/ki.jdst.2018.04.005.
GUAN Yue, DAI Jianghua, JIANG Xing, et al. Detection of lactoferrin in formulas for special medical purposes intended for infants[J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2018, 41(4): 21-24. DOI:10.15922/ki.jdst.2018.04.005.
收稿日期：2018-03-25
第一作者简介：管乐（1990—），男，助理工程师，学士，研究方向为营养素检测及其方法学。

E-mail ：853560617@ *通信作者简介：章肇敏（1981—），男，高级工程师，硕士，研究方向为特殊膳食人群营养及特殊医学用途配方食品的研究
与开发。

E-mail ：fooder2004@
乳铁蛋白是乳汁中一种重要的非血红素铁结合糖蛋白，是人体免疫系统的组分之一，具有广谱抗菌[1]、抗氧化[2]、抗癌、调节免疫系统等生物功能[3]。

作为一种新兴的功能性食品营养强化剂，乳铁蛋白近年来在国内外研
究广泛，其提取、纯化工艺和应用研究不断增多，目前已成功应用于酸乳、婴幼儿配方乳粉等产品中[4]。

为了更好地研究乳铁蛋白及其功能，需要建立有效的检测方法。

目前，乳铁蛋白的测定方法主要有分光光度法[5]、高
效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）法[6-8]、酶联免疫吸附法[9-10]、毛细管电泳法[11-13]及表面等离子共振技术[14]等。

分光光度法测定乳铁蛋白含量时的准确性较差，酶联免疫吸附法和高效毛细管电泳法的样品前处理操作比较繁琐，预处理时间也较长。

相对而言，HPLC的测定准确性好，亲和柱处理后目标峰明确，干扰峰少，且具有前处理简单、用时短等优点。

特殊医学用途婴儿配方食品对于具有特定医学状况的婴儿来说是唯一或主要的食物来源，由于其营养全面但组成复杂，目前尚未有国家标准检测方法。

本研究采用肝素亲和柱处理净化样品，采用紫外HPLC柱分离及测定，旨在建立一种准确、高效、便捷的特殊医学用途婴儿配方食品中乳铁蛋白含量测定方法，为相关产品的研发和实践提供参考。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
特殊医学用途婴儿配方食品自制；乳铁蛋白标准品（纯度≥95%）北京美正检测技术有限公司；乙腈（色谱纯，含量≥99.8%）、磷酸氢二钠（含量≥99.0%）、磷酸二氢钠（含量≥99.0%）、氯化钠（含量≥99.5%）国药集团化学试剂有限公司；三氟乙酸（含量≥99.0%）阿拉丁试剂（上海）有限公司。

1.2 仪器与设备
1260高效液相色谱仪美国安捷伦公司；ME104E 分析天平瑞士梅特勒-托利多公司；TGL-16冷冻离心机湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；X W-80A涡旋混合器上海沪西分析仪器厂有限公司；C
4
色谱柱上海安谱实验科技股份有限公司；乳铁蛋白肝素免疫亲和柱北京美正检测技术有限公司；PHS-3C雷磁pH计上海仪电科学仪器股份有限公司；0.45 μm水相微孔滤膜天津市津腾实验设备有限公司。

1.3 方法
1.3.1 实验原理
试样中的乳铁蛋白经磷酸盐缓冲液提取，肝素亲和柱净化后，用反相-HPLC柱分离，二极管阵列检测器于280 nm波长处检测，外标法定量。

1.3.2 试剂配制
0.1%三氟乙酸溶液：吸取1 mL三氟乙酸，加水定容至1 000 mL，经0.45 μm滤膜加压过滤，超声后备用。

0.1m o l/L结合缓冲液（N a H2P O4-N a2H P O4，p H7.5）：称取30.083g12H2O·N a2H P O4和2.496 g 2H2O·NaH2PO4，加入800 mL水溶解，定容至1 000 mL。

淋洗缓冲液（含0.1 mol/L NaCl和0.05 mol/L pH 7.5的NaH
2
PO4-Na2HPO4）：称取15.04 g 12H2O·Na2HPO4、1.248 g 2H2O·NaH2PO4和5.84 g NaCl，加入800 mL水溶解，定容至1 000 mL。

洗脱缓冲液（含1 mol/L NaCl和0.05 mol/L pH 7.0的NaH2PO4-Na2HPO4）：称取7.52 g 12H2O·Na2HPO4、0.624 g 2H2O·NaH2PO4和29.2 g NaCl，加入400 mL水溶解，定容至500 mL。

若为无水NaH
2
PO4和Na2HPO4，则需进行换算。

1.3.3 样品处理
1.3.3.1 提取
称取1.00 g样品（含乳铁蛋白0.01～1.00 mg）于50 mL离心管中，加入18 mL温热（约45 ℃）的结合缓冲液，涡旋振荡5 min，使样品充分溶解后用结合缓冲液定容至20 mL；于4 ℃、11 000 r/min条件下离心10 min，轻轻取出中间层，取所得液体10 mL过肝素亲和柱净化。

1.3.3.2 净化
平衡亲和柱：取10 mL结合缓冲液平衡肝素亲和柱（自然流速，或加压稍快，约每滴2 s），弃去全部流出液。

上样：取1.3.3.1节中的提取液10 mL过柱，上样前将柱子排干，使流速减慢并控制在0.2 mL/min内（10 mL样液约需50～60 min），弃去全部流出液。

淋洗：待样液全部流出后，向肝素亲和柱中加入20m L淋洗缓冲液（自然流速，或加压稍快，约每滴2 s），弃去全部流出液。

洗脱：排干淋洗液，加入3.5 mL洗脱缓冲液进行洗脱，收集全部流出液，将收集所得溶液过水系滤膜，供HPLC检测。

1.3.4 标准曲线的绘制
乳铁蛋白标准储备溶液的配制：准确称取乳铁蛋白标准品，加水溶解，配制成质量浓度为10 mg/mL的标准储备液，置于0～4 ℃冰箱中保存，可保存3 个月。

乳铁蛋白标准工作溶液的配制：分别准确吸取乳铁蛋白标准储备液，定容后配制成标准系列工作液，质量浓度分别为50、100、150、200、250、500 μg/mL。

使用前配制。

取上述标准工作液，质量浓度由低到高依次进样检测，以峰面积-质量浓度作图，以乳铁蛋白标准溶液的质量浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，得到标准曲线及回归方程。

1.3.5 HPLC条件
色谱柱：C
4
柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，300 A）；柱温30 ℃；进样体积50 μL；流速1.0 mL/min；检测波长280 nm；流动相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈。

流动相梯度洗脱程序如表1所示。

表 1
流动相梯度洗脱程序
Table 1
Mobile phase gradient program
时间/min
乙腈体积分数/%
0.1%三氟乙酸体积分数/%
030705554510604012307016
30
70
待测样液中乳铁蛋白的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。

1.3.6
乳铁蛋白含量计算
按照下式计算试样中乳铁蛋白的含量。

m X ＝ρh V h n h
1 000
100式中：X 为试样中乳铁蛋白的含量/（mg /100 g ）； ρ为从标准工作曲线得到的被测组分质量浓度/（μg /mL ）； m 为试样质量/g ；V 为样液定容体积/mL ；n 为稀释倍数。

2 结果与分析
2.1
乳铁蛋白的标准工作曲线及HPLC 图
乳铁蛋白的标准曲线为y =2.388 3x ＋0.062 3，在质量浓度50～500 μg /mL 范围内，乳铁蛋白标准曲线具有良好的线性关系，相关系数R 2=0.999 9。

乳铁蛋白标准溶液（250 μg /mL ）及特殊医学用途婴儿配方食品中乳铁蛋白的HPLC 图如图1～2所示。

00
2
4
68 ⮉ 䰤/min
101214
16
204060 /m A U 80100120 5.880
图 1
乳铁蛋白标准溶液的HPLC 图
Fig. 1
HPLC chromatogram of lactoferrin standard solution
00
2
4
68
⮉ 䰤/min
10121416
102030 /m A U
4050708060 5.872
图 2 特殊医学用途婴儿配方食品中乳铁蛋白的HPLC 图Fig. 2
HPLC chromatogram of lactoferrin in formulas for special
medical purposes intended for infants
2.2 检出限和定量限
对样品进行3 次测定，得到基线噪音均值，按照
GB /T 5009.1—2003《食品卫生检验方法 理化部分 总则》[15] 中的公式检出限=S /b （S 为仪器噪音的3 倍，即仪器能辨认的最小物质的信号；b 为标准曲线回归方程的斜率）计算检出限，得出本研究中乳铁蛋白的检出限为5 mg /100 g 。

用3 倍检出限表示定量限[16]，得出方法定量限为15 mg /100 g 。

2.3
方法回收率
根据本方法的检出限，称取样品约1 g ，加入质量浓度500 μg /mL 的乳铁蛋白标准溶液1 mL ，同时做空白实验。

表 2 回收率实验结果Table 2
Recovery of the method 序号称样量/g 本底值/（μg /g ）加标量/
μg 检测值/
（μg /g ）回收率/%
1 1.010 747950094594.2
2 1.000 447950095394.8
3 1.010 947950094694.4
4 1.016 247950093793.1
5 1.020 547950093492.96
1.013 8
479
500
94494.3平均值
94393.9相对标准偏差/%
0.66
0.77
由表2可知，6 次测定的相对标准偏差（relative s t a n d a r d d e v i a t i o n ，R S D ）为0.66%，回收率为92.9%～94.8%，回收率RSD 为0.77%，表明本方法的测定准确度较高。

2.4
方法精密度及稳定性
取质量浓度为200 μg /mL 的乳铁蛋白标准溶液，连续进样6 次。

表 3 精密度实验结果Table 3
Precision of the method
序号
1
23456平均值RSD /%保留时间/min 5.873 5.874 5.882
5.880 5.884 5.886 5.8790.08峰面积467.7
467.5
468.4
467.4
467.9
469.0
467.8
0.12
由表3可知，同一质量浓度乳铁蛋白标准溶液的测定RSD 为0.12%，表明本方法的精密度较好。

表 4 稳定性实验结果Table 4
Stability of the method 序号123456平均值RSD /%峰面积474.7
483.0
485.9
488.6
480.7
487.1482.60.96
由表4可知，本方法平行实验检测结果的RSD 为0.96%，稳定性好。

此外，在重复条件下2 次独立测定结果的绝对差值在1.5～8.3范围，约为平均值的0.5%～1.7%，远低于《食品中乳铁蛋白的测定》 [17]中不得超过算术平均值20%的要求。

2.5 方法可靠性
将本方法的测定结果与第三方机构检测方法的结果进行比对，评估本方法的可靠性。

表 5 能力验证结果
Table 5 Proficiency testing
检测项目样品编号
自检值/
（mg/100 g）
外检值/
（mg/100 g）
相对
偏差/%*
乳铁蛋白139.139.00.26 240.244.59.66 347.539.819.35 459.756.0 6.61 563.156.012.68 6107.983.229.69
注：*.与外检值相比，取绝对值。

由表5可知，6 个乳铁蛋白含量不同样品的自检值和外检值比较接近，说明本方法与第三方检测机构采用的检测方法对乳铁蛋白的检测在一定程度上具有同一性。

样品3、5、6的自检值和外检值存在较大的偏差，这可能是由于2 种方法在处理复杂食品基质时存在一定差异以及人员操作等检测误差。

由于没有与国家标准检测方法进行对比，无法完全消除方法间的误差，但选择具有较高检测研究能力的第三方机构作为可靠性评价对象，在相对独立的检测方法研究背景下，可以在一定程度上说明本方法具有良好的可靠性。

此外，从检测结果看，随着样品中乳铁蛋白含量的增加，本方法的适应性应该优于第三方机构的检测方法。

2.6 实际样品测定
采用本方法对7 批次商业化生产的特殊医学用途婴儿配方食品进行乳铁蛋白检测，考察方法的应用情况。

表 6 实际样品测定结果
Table 6 Lactoferrin content in actual samples determined by the
method
批次1234567平均值RSD/%含量/（mg/100 g）99.7114.6103.5103.894.1105.6107.9104.17 6.16
由表6可知，考虑到批次间的生产差异性，本方法对同配方、不同批次生产的样品的检测结果比较稳定，RSD为6.16%，可应用于生产实践。

3 结论
本研究建立了一种准确、高效、便捷的特殊医学用途婴儿配方食品中乳铁蛋白的含量测定方法，采用肝素亲和柱净化，反相-HPLC柱分离，外标法定量测定。

结果表明：在质量浓度50～500 μg/mL范围内，乳铁蛋白标准曲线具有良好的线性关系；该方法的检出限为5 mg/100 g，定量限为15 mg/100 g；平均回收率为93.9%，同一质量浓度乳铁蛋白标准溶液的测定RSD 为0.12%，稳定性实验中平行实验检测结果的RSD为0.96%；与第三方机构的检测结果进行比较，方法在一定程度上表现出较好的可靠性，但也存在一定的检测偏差。

在没有国家标准检测方法的前提下，本方法可以尝试用于特殊医学用途婴儿配方食品中乳铁蛋白的定量测定，同时也值得在不断的检测实践中改进，以更好满足该复杂食品体系的测定。

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