HPLC测定铜陵鲜姜冻干粉6-姜辣素含量

HPLC测定铜陵鲜姜冻干粉6-姜辣素含量
钟华青; 边旭; 杨玉福; 陈卫东; 张盛
【期刊名称】《《北方药学》》
【年(卷),期】2019(016)004
【总页数】3页(P6-8)
【关键词】铜陵鲜姜; 6-姜辣素; 中国药典; 提取工艺; 冻干粉
【作者】钟华青; 边旭; 杨玉福; 陈卫东; 张盛
【作者单位】铜陵市立医院铜陵 244000; 安徽中医药大学合肥 230012; 安徽省中医药科学院合肥 230012
【正文语种】中文
【中图分类】R284.1
生姜为多年生姜科植物姜Zingiber officinale Rosc.的新鲜根茎[1]，是传统的药食两用中药材，自唐宋时起就以汉（今四川广汉）、温（今浙江温州）、铜陵（今安徽铜陵）为道地[2]，因此，作为道地药材的生姜是铜陵“八宝”之一，以“块大皮薄，汁多渣少，肉细脆嫩、香味浓烈”等特色闻名[3]。

目前，铜陵鲜姜文献报道较少，处于亟待开发的状态，因此，本试验基于鲜药鲜用的思想，将铜陵鲜姜榨汁，并将废渣利用，采用现代提取技术和制备技术，参照2015版《中国药典》中6-姜辣素的提取方法，采用正交试验方法优化铜陵鲜姜渣的提取工艺，并将其与生姜汁冷冻干燥制备成冻干粉，为今后的铜陵鲜姜的开发研
究提供实验依据。

1 仪器与试药
HH-6数显恒温水浴锅（常州荣华仪器制造有限公司）、KQ-300B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、SPD-15C高效液相色谱仪（日本岛津公司）、Cascada I超纯水仪（颇尔过滤器有限公司）、AB135-S十万分之一电子分析天平（德国METTLER TOLEDO公司）、UV757CRT型紫外-可见分光光度计（上海精科仪器有限公司）。

6-姜辣素标准品（成都曼思特生物科技有限公司、中国科学院成都生物研究所，批号：MUST-17120205，含量＞98%）；甲醇为色谱纯（上海星可高纯溶剂有限公司）；鲜姜从安徽省铜陵市采摘，并经过安徽中医药大学药学院生药系教授俞年军鉴别为姜科植物姜的新鲜根茎。

2 方法与结果
2.1 色谱条件：色谱柱为Unitary-C18（46mm×250mm，5μm）；流动相：甲醇-水（60∶40）；流速：1mL·min-1；检测波长：280nm；柱温：30℃；进样量：20μL。

2.2 对照品溶液的制备：精密称取适量6-姜辣素对照品，置5mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制得浓度为1.026mg·mL-1对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备：铜陵鲜姜洗净，去皮，稍微晾干，放入榨汁机搅碎，取鲜姜渣和鲜姜汁分别冷冻储存。

精密称取适量鲜姜渣，置于圆底烧瓶中，加入适量甲醇，称定重量，加热回流提取30min，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 专属性考察：分别精密吸取适量甲醇溶液，对照品溶液和鲜姜渣供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。

结果表明，溶剂不对样品出峰进行干扰，见图1。

图1 6-姜辣素高效液相色谱图Figure 1 HPLC chromatogram of 6-gingerol注：
A.空白甲醇溶液；
B.对照品溶液；
C.供试品溶液
2.5 标准曲线的绘制：精密吸取对照品溶液置量瓶中，用甲醇稀释制得浓度分别为2.05、5.13、10.26、25.65、51.30、76.95、102.60、256.50、51
3.00μg·mL-1系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定。

以峰面积积分值（mAU）为纵坐标（Y），对照品溶液浓度（μg·mL-1）为横坐标（X）进行线性回归，得标
准曲线方程为Y=15903X+24553，R2=0.9992，表明 6-姜辣素在 2.05～
513.00μg·mL-1内线性关系良好，6-姜辣素标准曲线见图2。

图2 6-姜辣素标准曲线Figure 2 Standard curve of 6-gingerol
2.6 精密度考察：精密吸取浓度为25μg·mL-1的6-姜辣素对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件，重复进样6次，结果峰面积RSD为0.39%，计算得平均浓度为24.78μg·mL-1，表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性考察：精密吸取按“2.3”项下方法处理得到的同一批供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在制备后 0、2、4、8、12、24h内进样测定，结果
峰面积RSD为0.36%，计算得平均含量为0.59%，表明供试品溶液在24h内稳定。

2.8 重复性考察：称取同一批生姜渣6份，按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果峰面积RSD为2.58%，计算得平均
含量为0.51%，表明该方法重现性良好。

2.9 加样回收率考察：精密称取已知浓度（118.64μg·mL-1）的鲜姜渣供试品，加入相同浓度和体积的对照品，按“2.1”项下色谱条件进行测定，结果加样回收率
平均值为99.94%，RSD为0.33%。

2.10 正交试验优选提取工艺：根据2015版《中国药典》、文献和预试验结果，
在单因素试验的基础上，提取次数为2次，提取溶媒为甲醇，选择提取温度（A）、
料液比（B）、溶媒浓度（C）、提取时间（D）进行4因素3水平的正交试验，
按L9（34）正交表安排试验，测定结果取其平均值进行统计分析。

因素水平选择，试验安排与结果和方差分析分别见表1、表2和表3。

表1 正交试验因素水平（n=3）Table 1 Orthogonal factor level table（n=3）因素水平 A提取温度（℃）B C D料液比溶媒浓度（%）提取时间（min）123 70 80 90 1∶30 1∶50 1∶70 70 80 90 10 15 30
表2 正交试验结果Table 2 Results of orthogonal test试验号提取温度A料液
比B溶剂浓度C提取时间D平均含量（%）123456789K1K2K3R 111222333 123123123 123231312 123312231 0.25 0.46 0.49 0.54 0.44 0.39 0.46 0.44 0.42 0.400 0.457 0.440 0.057 0.417 0.447 0.433 0.030 0.360 0.473 0.463
0.113 0.370 0.437 0.490 0.120
表3 方差分析结果Table 3 Results of variance analysis注：* 表示差异有显著
性 F＞F0.05（2，4）=6.940，P＜0.05。

方差来源偏差平方和自由度 F值A B （误差）CD 0.005 0.001 0.024 0.022 2222 5.000 1.000 24.000*22.333*
根据直观分析和方差分析可知，对6-姜辣素提取效率的因素影响最大的是提取时间，料液比影响最小，溶剂浓度和提取时间均有显著差异。

最佳提取工艺的组合是A2B2C2D3，即加入50倍量80%甲醇，在80℃水浴中回流提取2次，30min/次。

2.11 验证试验：根据最佳提取工艺平行提取3次，计算提取液中6-姜辣素的含量。

结果得到提取液中6-姜辣素平均含量为0.61%，表明工艺可靠、合理、可行，结
果见表4。

表4 验证试验结果（n=3）Table 4 Results of verification experiment（n=3）试验号鲜姜渣（g） 6-姜辣素提取含量（%）123平均值1.010 1.000 1.010
1.007 0.640 0.600 0.590 0.610
2.12 铜陵鲜姜冻干粉制备：按照最佳提取工艺提取铜陵鲜姜渣得到提取液，分别
精密量取等体积提取液和鲜姜汁于EP管中，搅拌均匀后放入真空冷冻干燥机，-45℃真空冷冻干燥48h，即得铜陵鲜姜冻干粉。

2.13 6-姜辣素含量测定：按照“2.10”和“2.12”项下的方法，对采摘的铜陵鲜
姜平行制备三组6-姜辣素冻干粉，用80%甲醇溶解，定量溶液100mL，在“2.1”项下条件进行测定，结果铜陵鲜姜冻干粉中6-姜辣素平均含量为1.53%，具体结
果见表5。

3 分析与讨论
铜陵鲜姜一直以来都是药食两用的道地药材[2]，本文基于其道地性特点，鲜药鲜用，采摘鲜姜，将其榨汁，通过回流提取对废渣进行重复利用，优化鲜姜渣提取工艺，即加入50倍量80%甲醇，在80℃水浴中回流提取2次，30min/次。

根据临床用药需要，将鲜姜渣提取液和鲜姜汁混合经冷冻干燥成冻干粉，测定6-姜辣素
含量为1.53%。

结果表明，提取铜陵鲜姜渣的最佳工艺稳定、可行；测定铜陵鲜
姜6-姜辣素的方法灵敏度高，稳定性、重复性好，操作简便快捷。

6-姜辣素是存在于铜陵鲜姜中固有的活性成分，具有抑菌[4]、抗氧化[5]、抗癌[6]、抗炎[7]、抗肿瘤[8]、降压[9]等多种药理作用，应用前景广阔，具有研究和开发的价值。

因此，本试验选择6-姜辣素作为铜陵鲜姜为测定指标进行试验。

在波长200～800nm下对6-姜辣素对照品溶液进行全波长扫描。

结果显示，6-姜辣素的溶液在280nm处具有最大吸收，因此选择280nm作为本试验检测波长。

参照2015版《中国药典》和购买的6-姜辣素标准品质检报告，选择甲醇-水（60∶40）体系为流动相，其余条件与“2.1”项下色谱条件相同，测定6-姜辣素对照品溶液出峰情况，结果显示6-姜辣素对照品溶液在甲醇-水（60∶40）体系中分离度较好。

因此，综合分离效果、系统的稳定程度以及时间和经济成本等各方面考虑，确定高效液相色谱的流动相为甲醇-水（60∶40）体系。

铜陵鲜姜作为安徽道地药材，具有很好的食用和药用价值，但目前的工艺开发甚少。

因此，本试验将生姜榨汁，正交试验法优化鲜姜渣的提取工艺，再与鲜姜汁混合制备冻干粉，测定6-姜辣素含量达到1.53%，为铜陵鲜姜的工业化提供理论基础。

参考文献
【相关文献】
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2015：101.
[2]方文韬，詹志来，彭华胜，等.干姜、生姜、炮姜分化的历史沿革与变迁[J].中国中药杂志，2017，42（9）：1641-1645.
[3]许舒雯，彭丽华，王凯，等.铜陵生姜挥发油化学成分的GCMS 分析[J].安徽农业科学，2013，41（15）：6910-6911.
[4]宋力，何永，张雪兵，等.生姜中多酚的提取及其抑菌性研究[J].信阳师范学院学报（自然科学版），2017，30（3）：445-448.
[5]陈燕玲，罗婷，凡栋，等.6-姜酚对抗丙酮醛引起的HK-2肾小管上皮细胞损伤的机制 [J].临床医药文献电子杂志，2017，4（52）：10111-10113.
[6]张芳.铜陵白姜姜酚的制备、抗癌活性及机理[D].合肥工业大学，2017.
[7]马武开，姚血明，陆道敏，等.姜酚对胶原诱导性关节炎的抗炎作用及其机制研究[J].中药新药与
临床药理，2013，24（1）：47-51.
[8]刘鑫，张宏伟，傅若秋，等.生姜中姜酚类活性成分的抗肿瘤作用及其机制[J].第三军医大学学报，2017，39（9）：884-890.
[9]翟向红.姜酚对家兔离体胸主动脉环的作用及机制[D].郑州大学，2013.。