卡托普利对高血压大鼠Klotho蛋白的影响

卡托普利对高血压大鼠Klotho蛋白的影响
王彦琛;李汶嘉;张玮;罗丹;杨伟;王颖;任延平;苏显明
【摘要】目的观察卡托普利对高血压模型大鼠Klotho蛋白及相关炎性因子的影响.方法 SD大鼠18只,随机分为正常组、模型组、干预组,其中模型组及干预组先给予N'-硝基-L-精氨酸灌胃建立高血压大鼠模型.造模成功后,干预组给予卡托普利100 mg/kg灌胃,正常组、模型组给予等体积的生理盐水灌胃.测大鼠尾动脉血压变化,酶联免疫吸附法(ELISA)测血浆中Klotho蛋白、血栓素
A2(thromboxane,TXA2)、内皮素(endothelin,ET)水平,硝酸还原酶法测一氧化氮(nitric oxide,NO)水平,TBA法测丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量,WST-1法测超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性.观察每组大鼠胸主动脉血管壁HE染色病理变化,免疫组化CD31标记观察血管内皮细胞损伤.结果与正常组比较,模型组TXA2、ET、MDA含量高于正常组(P<0.05),Klotho蛋白含量、NO含量、SOD活性低于正常组(P<0.05);与模型组比较,干预组TXA2、ET、MDA含量显著降低(P<0.05),Klotho蛋白含量、NO含量、SOD活性高于模型组
(P<0.05).HE染色结果显示:模型组大鼠主动脉血管中膜弹力纤维增生、紊乱,管壁较正常组增厚;干预组大鼠血管管壁厚度明显小于模型组.免疫组化结果显示:模型组大鼠主动脉血管内皮细胞受损、脱落;干预组大鼠血管内皮细胞增多、逐渐修复.结论卡托普利可以减轻内皮细胞的应激反应、修复血管内皮,改善血管内皮功能,提高Klotho蛋白水平.
【期刊名称】《西安交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2019(040)002
【总页数】4页(P218-221)
【关键词】卡托普利;高血压;大鼠;血管内皮;Klotho蛋白
【作者】王彦琛;李汶嘉;张玮;罗丹;杨伟;王颖;任延平;苏显明
【作者单位】西安交通大学第一附属医院老年心血管内科,陕西西安 710061;咸阳市中心医院老年病科,陕西咸阳 712000;西安交通大学第一附属医院老年心血管内科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院老年心血管内科,陕西西安710061;西安交通大学第一附属医院老年心血管内科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院老年心血管内科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院老年心血管内科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院老年心血管内科,陕西西安 710061;西安交通大学第一附属医院老年心血管内科,陕西西安 710061【正文语种】中文
【中图分类】R3
高血压是影响人类身体健康的多发病和常见病，其并发症致死及致残率逐年上升，已成为全球健康问题。

血管转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitor, ACEI)在降压同时，可以延缓和逆转心室重构，改善血管内皮功能，减少心律失常的发生，提高生存率，改善预后。

Klotho蛋白是一种内源性抗衰老物质，研究发现，Klotho蛋白基因敲除的小鼠骨髓和外周血中内皮祖细胞数量显著降低，推断Klotho蛋白可能参与了内皮祖细胞的功能调控和血管损伤修复[1]。

ACEI在降压的同时对Klotho蛋白影响如何，目前研究较少。

为此，本研究拟通过卡托普利干预高血压模型大鼠，探讨其在降压过程中对Klotho蛋白及相关炎性因子的影响。

1 材料与方法
1.1 试剂与仪器N’-硝基-L-精氨酸(凡科维，批号109208)，卡托普利(Solarbio，批号723A023)。

Klotho蛋白试剂盒、血栓素试剂盒、内皮素试剂盒(酶联免疫法)、丙二醛(MDA)测定试剂盒(TAB法)、超氧化物歧化酶(SOD)测定试剂盒(WST-1法)均购自南京建成生物工程研究所。

电子分析天平(奥豪斯仪器，中国上海)，低速离心机(中科中佳，中国安徽)，酶标仪(赛默飞世尔，中国上海)，BP-300A全自动大小鼠无创血压测量系统(秦盟软件有限公司，中国成都)。

1.2 实验动物及分组 SD大鼠18只、体质量(200±10)g，由西安交通大学医学部
实验动物中心提供，生产许可证：SYXK(陕)2016-003。

随机分为正常组、模型组、干预组，每组6只，其中模型组及干预组先给予N’-硝基-L-精氨酸490
mg/(kg·d)连续灌胃28 d建立高血压模型。

造模成功后，干预组每日给予卡托普
利100 mg/kg灌胃，其余2组给予等体积生理盐水灌胃、每日1次，连续14 d。

1.3 样本采集与处理实验第14天称重，测安静状态下大鼠尾动脉血压3次，取平均值。

用100 mg/mL水合氯醛0.35 mL/100 g麻醉，取腹主动脉血EDTA抗凝、离心，-20 ℃保存，用于检测Klotho蛋白浓度、血栓素A2(TXA2)、内皮素(ET)、丙二醛(MDA)含量、一氧化氮(NO)水平、超氧化物歧化酶(SOD)活性。

采血后立
即处死大鼠，快速取出胸主动脉，生理盐水冲洗，100 mL/L甲醛溶液固定，常规石蜡切片，分别用于HE染色、免疫组化CD31标记。

1.4 Klotho蛋白浓度、TXA2、ET含量测定酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒测定血浆Klotho蛋白、TXA2、ET浓度，在450 nm波长下于酶标仪中测定样本吸光度(A)，根据标准品浓度及吸光度绘制标准曲线，计算出样本中各指标浓度。

1.5 MDA含量、SOD活力、NO水平测定按试剂盒操作说明测定血浆MDA、SOD活性及NO水平。

1.6 统计学分析采用SPSS19.0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差表示，给药前后的比较采用配对样本t检验；同一指标多组间比较采用单因素方差分析，
两两比较采用LSD-t检验；方差不齐采用秩和检验。

P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组大鼠给药前后收缩压的比较正常组、模型组大鼠给药前后血压变化无统
计学差异，干预组大鼠给药后收缩压较给药前降低，差异有统计学意义(P<0.001，表1)。

表1 各组大鼠给药前后收缩压比较
Tab.1 Comparison of systolic pressure before and after administration in the three groups of rats(n=6, mmHg)
组别给药前给药后tP正常组111.15±3.82117.78±4.85-2.433 0.059模型组173.05±4.85171.07±3.830.6280.558干预组
170.65±4.48117.95±7.1013.185<0.001
2.2 各组Klotho蛋白、NO、TXA2、ET、MDA含量及SOD活性的变化模型组TXA2、ET、MDA水平高于正常组，Klotho蛋白、NO、SOD水平低于正常组，差异有统计学意义(P<0.05)。

干预组TXA2、ET、MDA水平低于模型组，Klotho 蛋白、NO、SOD水平高于模型组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

2.3 卡托普利对大鼠主动脉管壁HE染色及免疫组化CD31的影响 HE染色结果显示：模型组大鼠主动脉壁弹力纤维增生、排列紊乱，细胞核增大变形，管壁增厚。

干预组大鼠主动脉血管壁弹力纤维数量较模型组减少，排列相对整齐，细胞核缩小，管壁相对变薄(图1)。

免疫组化CD31标记显示：高血压模型大鼠血管内膜水肿、毛糙，内皮细胞受损、脱落，部分完全缺失，边缘无免疫组化标记。

干预组大鼠血管内膜水肿消退，内皮细胞逐渐修复，血管内缘可见相对连续棕黄染色的内皮细胞(图2)。

表2 各组大鼠Klotho、NO、ET、TXA2、MDA含量及SOD活力比较
Tab.2 Comparison of the levels of Klotho, NO, ET, TXA2, MDA and SOD
activity in the three groups of rats
n=6)
项目正常组模型组干预组
Klotho(U/L)46.84±5.0737.92±5.66∗44.92±3.44∗∗#NO(μmol/L)9.33±2.584.9 1±1.58∗6.55±0.76∗∗#ET(μg/L)62.87±13.2495.37±13.90∗∗61.65±12.19∗∗# TXA2(ng/L)509.49±53.99612.37±59.28∗∗430.94±73.67∗∗#SOD(U/mL)224. 62±3.09215.64±5.59∗∗231.74±4.22∗##MDA(nmol/mL)93.44±42.86160.27±39.98∗∗57.37±16.55∗∗##
与正常组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01。

图1 各组血管结构比较(HE染色)
Fig.1 Comparison of vascula r structures of the three groups (×400)
A：正常组；B：模型组；C：干预组。

图2 各组血管内皮结构比较(免疫组化CD31标记)
Fig.2 Comparison of vascular endothelial structures of the three groups (×400)
A：正常组；B：模型组；C：干预组。

3 讨论
高血压是一种以动脉血压升高为特征，可伴有血管、心脏、肾脏等器官功能性或器质性改变的全身性疾病。

目前认为血管内皮功能障碍是高血压最早期和最重要的血管损害。

血管内皮细胞可分泌多种活性肽，其中ET和NO是调节血管平滑肌舒缩功能的重要物质[2-3]，ET具有强烈的收缩冠状动脉、肾小动脉、刺激心钠素释放的作用；NO具有舒张血管平滑肌细胞，使平滑肌松弛，动脉血管扩张，从而调节
血压和血流分布的作用。

正常情况下，二者处于动态平衡。

发生高血压时血管壁增厚，内皮细胞受损，ET生成增多，NO减少，打破二者之间平衡，血压调节功能受损。

血管内皮长期受过高的动脉压影响，引起炎性细胞黏附、激活和吞噬，产生大量自由基，自由基发生脂质过氧化产生MDA，体内MDA含量增高，NO合成释放减少，导致血管内皮依赖舒张功能下降，血小板聚集性升高，冠脉痉挛和管腔内血栓形成，测定MDA的含量可以反映生物膜过氧化损伤的严重程度[4-5]。

SOD能够清除自由基，对机体氧化和抗氧化平衡有至关重要的作用，测定SOD 活性可以反映机体抗氧化和清除氧自由基的能力[6]。

高血压时管腔变细，血小板黏附、聚集增强，TXA2产生增多，导致血管内皮进一步损伤，血栓素、前列环素比例失调，血压进一步升高。

本研究显示：高血压模型大鼠血浆中ET、TXA2、MDA含量显著升高，SOD活力、NO水平显著降低，符合高血压发生时各因子的表现，高血压模型建立成功。

本研究观察到大鼠在发生高血压时Klotho蛋白水平是降低的，而在给予卡托普利干预后，Klotho蛋白水平较高血压模型组大鼠水平升高。

在高血压病理状态下，体内血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)的浓度升高，激活血管紧张素Ⅱ受体1型(angiotensin type 1 receptor, AT1R)，使细胞内钙离子浓度增加；或激活细胞膜表面的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸/烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NADH/nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶，引起氧化应激反应，均可导致血管内皮细胞的受损[7]。

卡托普利是ACEI，能有效抑制肾素-血管紧张素-醛固醇系统及血管紧张素转化酶的产生，阻断血管紧张素Ⅰ转化途径[8]，促进血管舒张并降低外周血管阻力，减轻内皮损伤；卡托普利通过抑制AngⅡ的生成，使AT1R激活减少，进而调节鞘氨醇、溶血卵磷脂、油酸酰胺等代谢产物的表达，达到保护血管内皮功能的目的[9]。

Klotho蛋白是一种抗衰老蛋白，腺病毒介导的Klotho基因导入动脉粥样硬化模
型鼠(带有高血压、肥胖、高血糖、高血脂)可以改善血管内皮功能障碍，增加NO 的合成，降低血压，防止内膜肥厚和血管纤维化[10-11]。

体外实验进一步证实，Klotho蛋白可以显著减轻过氧化氢诱导的人脐静脉内皮细胞的凋亡和衰老，并能
促进内源性NO合成[12]。

本课题组早期研究指出，Klotho蛋白与高血压水平呈
负相关，与NO水平呈正相关[13]；我们同时也观察到大鼠在发生高血压时、给予卡托普利干预后Klotho蛋白与NO水平变化的趋势是一致的。

已有动物模型证实，敲除Klotho基因的缺陷小鼠具有高表达的血管内皮损伤，而在注射Klotho蛋白后，其血管内皮损伤完全消失，说明Klotho对血管内皮细胞
具有强烈的保护作用[14]。

本研究观察到卡托普利干预后HE染色的大鼠血管增生的管壁在一定程度上得到恢复，中膜重塑；免疫组化标记进一步提示卡托普利可以减轻血管内皮细胞损害，并对受损内皮细胞有所修复。

综上所述，我们推断卡托普利可能通过修复内皮细胞、抗内皮细胞的氧化损伤调节机体内Klotho蛋白水平，而Klotho蛋白可能与卡托普利有协同调节血压的作用。

具体的调节机制需要进一步研究。

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