发酵工程菌种的来源及选育
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发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
淀粉酶活力极强，多作糖 化酶使用；具有较强的蛋白质 分解能力，可用于制造腐乳。
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
华根霉 ( Rhizopus chinentis )
酿酒所必须的重要霉菌，也是 酸性蛋白酶和腐乳生产中的重要菌 种。
2、毛霉 ( Mucor )
鲁氏毛霉 ( Mucor rouxianus ) 能糖化淀粉且能生成少量酒精；能产生
6、醋酸菌 (Acetobacter)
➢ 不形成芽孢，G－，好气性 ➢ 可生产醋酸.
7、棒状杆菌 (Corynebacterium) ➢ 是谷氨酸和其他氨基酸的高产菌.
8、短杆菌 (Brevibacterium)
氨基酸、核苷酸工业生产中常用的菌种，也是酶法 合成生产辅酶A的菌种.
9、黄单胞菌 (Xanthomonas)
5、假丝酵母 (Candida)
➢能形成假丝，液体培养时能 形成浮膜。 ➢可生产SCP、甘油、脂肪酶。
6、红酵母 (Rhodotorula)
➢有明显的红色或黄色色 素，很多种因生荚膜而形 成粘质状菌落。 ➢可由菌体提取大量脂肪、 -胡萝卜素。
7、棉病针孢酵母 ( Nematspora gossypii )
2、葡萄汁酵母 (Saccharomyces uvarum)
与酿酒酵母相似，主要的区别在于葡萄汁酵母能发酵 棉子糖和蜜二糖。
3、汉逊酵母 (Hansenula)
此属酵母多能产生乙酸乙酯，从而增加产品的香 味，可用于酿酒和食品工业。
4、球拟酵母 (Toruiopsis)
此属酵母有些种能产生不同比例的甘油、赤藓 糖、阿拉伯糖；有的能利用烃类生产蛋白质。
复筛 不纯 第四次平板分离
第三次菌种保藏
第四次原种斜面
初步工艺条件摸索
再复筛
发酵工程(菌种选育)重点
某些化学诱变剂常用浓度及处理时间
诱变剂 二乙酯 浓度 0.1～1% 处理时间(min) 18～24 60～120 中止方法
硫代硫酸钠或稀释 大量稀释
亚硝基胍 0.1～3㎎/ml
4）突变株的筛选
菌体细胞经诱变剂处理后, 要从大量的变异菌 株中，把一些具有优良性状的突变株挑选出来, 这
需要有明确的筛选目标和筛选方法, 需要进行认真
在生产过程中，不经人工处理，利用菌种的自然
突变而进行的菌种筛选过程。但突变的频率较低。
2.自然突变的两种可能
菌种衰退，生产能力下降；
代谢更加旺盛，生产性能提高。 3.自然选育的方法——单菌落纯种分离
五、诱变育种（Mutation breeding）
1.诱变育种的含义 应用微生物遗传和变异理论，用物理或 化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群, 促进其突变率大幅度提高, 然后采用简便、
诱变剂的含义： 凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素， 统称为诱变因素或诱变剂。 分类： 物理诱变，如紫外线、γ-射线、X-射线、
快中子、激光、等离子体、高压等
化学诱变，如硫酸二乙酯、亚硝基胍、亚硝
酸、碱基类、吖啶类物质等
诱变剂量的选择：
一般来说，诱变率随诱变剂量的增高而提高，
因此，通常诱变剂量采用致死率90%～99%的剂量， 但是，对于经过一再诱变的高产菌，诱变剂量要低 得多（致死率在90%～99%）。 诱变处理的方法： 单一处理：一次用一种的诱变剂处理方法处理菌种 复合处理：两种以上的诱变处理方法处理菌种，这 种处理方法通常较单一处理的效果好。
菌悬液的细胞浓度一般控制为: 真菌孢子或酵母细胞 106～107 个/ml； 放线菌或细菌 108个/ml。 菌悬液一般用生理盐水(0.85% NaCl)稀释。 有时用化学诱变剂处理时，需要0.1mol/L 磷酸缓冲液稀释, 因为有些化学诱变剂处理时, 常常会改变反应液的pH值。
第二章生产菌种的来源
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工业发酵菌种必须具备的基本特征
能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能生成较 多的发酵产物； 培养条件如温度、渗透压等易于控制； 抗杂菌和抗噬菌体能力较强； 遗传稳定性高、不易退化； 不产生有害的生理活性物质或毒素（食品或医药微生 物菌株）
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4、性能测定（毒性试验）
自然界的一些微生物在一定条件下会产毒； 除啤酒酵母、脆壁酵母、黑曲霉、米曲霉和枯草杆菌作 为食用无须作毒性试验外，其他均需 2年以上的毒性试 验； 医药卫生上的产品，还须通过安全试验和临床试验，获 得国家的药品生产许可证，方能使用； 生产性能测定； 生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、温度、 pH值、提取工艺等； 经自然界分离筛选获得的有价值的菌种进一步进行人工 选育。
具体方法： 在固体选择培养基中加入酶作用的底物培养微生物，能够 利用此底物的酶产生菌得以生长，并且往往会在其菌落周 围形成一透明圈。 透明圈的大小与酶活力的高低成正相关，可以作为菌种初 筛的判断标准。 如：蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、甘露聚糖酶、淀粉酶、纤 维素酶等
22
目的微生物筛选方法的研究进展 目前土壤中能够培养的微生物不到总数的1%。 微生物的多样性及资源的开发仍然是今后若干 年的研究重点。 －－陈文新院士 分子生物学的实验手段，在微生物鉴别及特定 目标产物的筛选方面发挥了着越来越重要的作 用。如 :16SRNA同源性分析，基因序列分析及 DNA/DNA杂交技术等。
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几种重要生物活性物质产生菌的分离方法 抗病毒药物产生菌：用小平板测定由病毒引起的细胞 变性效果，是一种有用的筛选方法；检测病毒复制中 特有的DNA复制酶和核酸合成酶的酶抑制剂，是另一 种选择性更高的筛选方法。
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生长因子产生菌：通过观察分离菌能否促进营养 缺陷型菌株的生长来检出。 免疫激活剂产生菌：可以用细胞表面酶的抑制法， 筛选免疫激活剂产生菌； 多糖产生菌：可以通过菌落外观的观察来识别 （黏稠)
微生物菌种
虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目 前广泛使用的育种手段。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
原始菌株（出发菌株）
活细胞计数 诱变剂处理 活细胞计数 中间培养
突变株分离
诱变预备处 理
初筛 复筛 生产性能试验
工业微生物来源
想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需
菌株。
从自然界采集分离。
从一些发酵制品中分离目的菌株。
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
微生物菌种的选择性分离
工业化菌种的要求
能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合 成产物； 有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造 的可操作性要强；
分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
目的微生物富集的一些基本方法
让目的微生物在种群中占优势，使筛选变 富集的目的： 得可能。
富集的三种方案：
定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的
条件（加热、膜过滤等），进行培养。
当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分
能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明 圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。
分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、 脂肪酶、核酸酶等；
《发酵工程》
第二章 微生物菌种选育
例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌 土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然 后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白 质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性 蛋白质，产生一透明圈。
遗传性能要相对稳定；
不易感染它种微生物或噬菌体； 产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与 致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。
发酵工程(2)第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
孢子丝盘卷成球形孢囊，内形成孢酵母菌
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏
单细胞真核，主 分布于含糖质较多的 偏酸性环境中，如水 果、蔬菜、花蜜和植 物叶子上，以及果园 土壤中。
1、酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)
又称啤酒酵母。细胞多为圆形、 卵形，能产生子囊孢子。能发酵 葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和半乳糖 等多种糖类，但不发酵乳糖和蜜 二糖。
5、白地霉 ( Geotrichum candidum )
➢ 节孢子单个或连接成链。
➢ 白地霉菌体蛋白营养价值很高，可供食用和饲 料用，也可用来提取核酸，在废料废水的利用上很 用价值。
6、产黄头孢霉 ( Cephalosporium chrysogen ) 头孢霉素、先锋霉素
3、游动放线菌属 （Actinoplanes）
➢ 一般不形成气生菌丝，孢子球形，有时端生1-40 根鞭毛，能运动。 ➢ 济南游动放线菌生产创新霉素(creatmycin; 1964).
4、诺卡氏菌属 (Norcadia)
➢ 菌落较小，边缘多呈树根 毛状。 ➢ 生产利福霉素、蚊霉素等
5、孢囊链霉菌属 (Streptosporangium)
4、青霉 ( Penicillum )
产黄青霉 ( Penicillum chrysogenum ) 生产青霉素，也可用来生产葡萄
糖氧化酶、葡萄糖酸、柠檬酸和抗坏 血酸。
娄地青霉 ( Penicillum roqueforti ) 属不对称青霉组，具有分解油
脂和蛋白质的能力，用于制造干酪； 该菌孢子能将甘油三酯氧化为甲基 酮。
第二章 工业微生物菌种的选育与扩大培养
第一节 发酵工业常用微生物 第二节 菌种来源 第三节 菌种选育 第四节 种子扩大培养 第五节 菌种保藏
《发酵工程》02 工业发酵菌种选育
（2）增殖培养
➢目的： 富集目的微生物，让目的微生物在种群中 占优势，使筛选变得可能。
富集方法 1、养分 3、培养时间
2、pH条件 4、培养温度
等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、 液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。
（３）纯种分离
•
尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微
真菌（青霉素、头孢等）
一些产芽孢的细菌 植物或动物来源
问题：生产抗生素的微生物能不能用于生产氨基酸？
微生物（包括动、植物细胞）几乎可以生产 我们所需的一切产品，但是涉及到工业化生 产对于某一种特定的产品，只有特定的微生 物才具有大量表达的潜力。
例： 礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微 生物中，发现了三种有潜力的新抗生素。
• 细菌（bacteria）：常用的有枯草芽孢杆菌、 醋酸杆菌、棒状杆菌、短杆菌等。
短杆菌：GA、Gln、lys…… 枯草芽孢杆菌：淀粉酶（BF7658）、碱性蛋白酶等 地衣芽孢杆菌：HASS(耐高温α-淀粉酶) αAmylase 苏云金芽孢杆菌短：杆B菌T生物农药…棒…状杆菌 梭状芽孢杆菌：丙酮、丁y酸ea等sts的发酵
啤棒酒状酵杆母菌
• 酵母菌（yeast）：属单细胞真核生物，主 要分布于含糖较多的酸性环境中。常用的 有：啤酒酵母、假丝酵母、类酵母等。
啤酒酵母：酿酒、辅酶类物质的发酵
酒香酵母：酿酒
汉逊酵母：酿酒，用于乙酸乙酯的发酵
假丝酵母：单细胞蛋白生产，石油发酵
霉菌
• 霉菌（mould）：喜偏酸性环境。可用于生产多种 酶制剂、抗生素、有机酸及甾体激素等。
黑曲霉：柠檬酸工业、酿酒业、糖化酶 黄曲霉：酱油生产，面酱 青霉菌：青霉素的生产 红曲霉：红曲制造，南方红曲酒（女儿红）；红色；豆腐 乳 赤霉菌：赤霉素的生产
发酵工程设计菌种筛选方案
发酵工程设计菌种筛选方案第一步：确定目标产物在菌种筛选之前，首先需要确定目标产物是什么。
这个产物可以是食品添加剂、药物、化学品等。
确定目标产物后，可以确定需要的菌种类型，例如革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等。
此外，还需要确定产物的生产条件，例如温度、pH值、氧气需求等。
第二步：收集菌种资源在进行菌种筛选之前，需要先收集各种潜在的菌种资源。
这些资源可以通过从自然环境中进行采集、从已有的菌种库中获取或者通过其他方式获取。
一般来说，我们需要收集大量的菌株资源，以便进行后续的筛选工作。
第三步：菌种初步筛选在收集到菌株资源后，需要进行初步的筛选。
这一阶段的目标是快速地排除那些不太可能产生目标产物的菌株。
菌株的筛选可以通过观察菌落形态、生长速度、色素产生等方法进行。
第四步：菌种培养条件的优化在进行初步筛选后，我们需要对筛选出来的菌株进行培养条件的优化。
这包括温度、pH 值、培养基成分等。
通过优化培养条件，可以进一步筛选出对目标产物生产更为适合的菌种。
第五步：菌种产量的筛选在确定了合适的菌种后，需要进行产量的筛选工作。
这一阶段的目标是确定哪些菌株在相同的培养条件下可以产生最高的目标产物产量。
这一步通常需要进行大规模的培养实验。
第六步：菌种稳定性的筛选最后，需要对筛选出来的菌株进行稳定性的评估。
确定哪个菌株在不同培养条件下都能稳定地产生目标产物。
这一步通常需要进行长期的培养实验。
综上所述，菌种的筛选是一个复杂而又关键的工作。
通过以上的步骤，可以有效地筛选出适合生产目标产物的菌株，为发酵工程的成功提供保障。
发酵工程第二章发酵工业微生物菌种
施加选择性压力分离法 随机分离法 这两种方法都是针对菌种从样品中分离所采用的
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
新种分离与筛选的步骤
（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物
的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在 这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一 步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分 离的方法有划线分离法、稀释分离法。
施加选择性压力分离法
施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生 长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条 件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于 其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而 快速分离纯化的目的。
括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。
新种分离与筛选的步骤
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的 步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样 中所包含的所有微生物总数和种类。
方法，实际发酵工业上菌种分离的步骤要有很多 步骤。
新种分离与筛选的步骤
定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长 培养特性。
采样：有针对性地采集样品。 增殖：人为的通过控制养分或培养条件，使所需
菌种增殖培养后，在数量上占优势。 分离：利用分离技术得到纯种。 发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包
工业上常用的微生物菌种
③ 霉菌： 工业上常用的霉菌有根霉、毛霉、红曲 霉、青霉等，主要生产酶制剂、抗生素、有机酸 和甾体激素等。
④ 放线菌： 工业上常用的有链霉菌属、小单胞菌 属和诺卡菌属，主要用于生产多种抗生素。
⑤ 担子菌： 即常说的蕈菌，主要用于生产多糖、 药物开发。
⑥ 藻类： 工业上常用的藻类有螺旋藻、单烈藻等， 主要用于生产食品，替代能源等。
新种分离与筛选的步骤
（三）培养分离 尽管通过增殖培养效果显著，但还是处于微生物
的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在 这一步，增殖培养的选择性控制条件还应进一 步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分 离的方法有划线分离法、稀释分离法。
施加选择性压力分离法
施加选择性压力分离法：利用不同种类微生物生 长繁殖对环境和营养要求不同，人为控制这些条 件，使之利于某类或者某种微生物生长，不利于 其他微生物生存，以达到使目的菌占优势，从而 快速分离纯化的目的。
括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、 发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生 长和发酵最适温度、最适值、提取工艺等。
新种分离与筛选的步骤
从自然界中分离培养微生物是菌种选育的重要和基础的 步骤。
到目前为止，还没有一种分离培养方法能揭示一个试样 中所包含的所有微生物总数和种类。
微生物发酵工程：第3章 生产菌种的选育
菌种选育常用的诱变剂
4) 变异株的筛选 a 初筛: 要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的菌株、一般采用观察初选菌落
在平板上的生理效应进行初步测定，如：变色圈、透明圈、生长圈或 抑菌圈的大小等。
b 复筛: 在初筛缩小了的范围中选出1-2个、高产株尽量在接近生产条件下精确
测出菌株的生产性状、一般采用摇瓶振荡培养、进行定量分析。（与 发酵罐接近、结果具有实践意义、工作量大）
基因工程是用人为的方法获得目的基因，将该目的基因与作为载体的DNA分子体外连接成 重组DNA，然后导入受体细胞中，以改变受体细胞原来的遗传特性，获得新的品种，产生新的 产物。
基因工程菌的构建主要包括目的基因的获得、载体的选择、目的基因与载体在体外连接、 重组DNA分子导入宿主细胞、筛选、鉴定阳性重组子、产物的表达等几个步骤。
A. 粗放的测定（粗筛）
抗生素产生菌-----检测菌的平板点样培养------抑菌圈 比较抑菌圈
谷氨酸产生菌-----无蛋白胨平板上点样培养-----打孔器移菌------滤纸 ------湿圈扩大------茚三酮显色。
B. 精确的测定（复筛）
摇瓶试验、仪器分析等。
营养缺陷型: 是指某一菌株丧失了合成某种营养物质的能力、在缺乏这种营养成 分的情况下不能正常生长的变异菌株。如：赖氨酸营养缺陷型Lys-对应的野生型用 Lys+表示。
3. 评价 优点：
自然选育简单易行、是纯化菌种、防止衰退、稳定生产、提高产量的有交手段。缺点：效 率低、进展慢。
四.诱变育种
以物理、化学等人工因素、使微生物的遗传物质发生突变、进而导致遗传性状改变的育种技 术。
1. 评价 优点：
可提高菌种的生产能力、改进产品质量、扩大品种、简化工艺、突变频率高、速度快、收效 显著、方法简便。缺点：只能导致不希望有的原有性状的消失、或者使某些原有性状得到改善、 很少导致微生物获得新的性状、缺乏育种定向性、工作量大。
发酵工程第2章_菌种选育
• 脂肪酶产生菌的分离
• 为提高分离筛选效率，多采用固体平板的变色 圈法，以吐温为底物，尼罗蓝（Nile blue）作 为指示剂，根据变色圈大小来判断脂肪酶活性 的高低；也可用甘油三丁酸酯为底物，罗丹明 B为指示剂，以荧光圈的大小来测定。
• 乙醇产生菌的分离
• 通过平板上的变色圈还可以快速分离筛选产乙 醇的菌株。
4、琼脂平板在使用前应置于37℃培养箱中孵育l、 2天。
5、培养基的生物物理学参数，如pH及盐分也应调 节到与试样的生态系统参数值相近。
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五、自然界中细菌的分离
（三）分离
• 目的微生物不纯，需分离纯化。采用简便迅速， 有一定准确性的检出方法，提高筛选效率。常 用平皿反应法：
• 纸片培养显色法：浸有指示剂滤纸。
• 淀粉酶产生菌的分离：
• 分离淀粉酶产生菌时，培养基以淀粉为 惟一碳源，待样品涂布到平板上，经过 培养形成单个菌落后，再用碘液浸涂， 根据菌落周围是否出现透明的水解圈来 区别产酶菌株。
• 碘可以杀菌，一旦染色就很容易把细菌杀死，而曲利 苯蓝只是对细菌有影响但不会杀死。，建议选用0.0050.01%含量。
• 大多数放线菌的分离培养是在贫脊或复杂底物 的琼脂平板上进行的。除嗜温性放线菌外，其 他放线菌一般在培养4-20天内在分离平板上缓 慢形成菌落。
• 在放线菌分离琼脂中通常都加入抗真菌剂制霉 菌素或放线菌酮，以抑制真菌的繁殖。
• 选择性地添加抗生素。 • 分离琼脂平板制备好后，一般皆应在37℃培养
箱中存放3天。
• 在以糖为碳源的琼脂平板的菌落上，覆盖一层 含有盐类的琼脂，该蓝色物质在醇脱氢酶和 NAD作用下（在少量乙醇存在时）反应产生的 电子脱色。因此生成乙醇的菌落便显出一个淡 白色的圈，晕圈的大小可初步表示乙醇的产量。
发酵工程 第二章 发酵工业微生物菌种制备原理和技术
第二章 发酵工业微生物菌种 制备原理和技术
发酵工程 工业生产水平的
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件
三个决定要素
生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
第三节 微生物菌种的选育
第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
集的培养物到固体培养基，分离优势微生物的单
菌落。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
连续富集培养（恒化式富集培养）
改变限制性基质浓度来控制两种菌的比生长速率。 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。
固体培养基的使用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所
需的基质，以便促使酶产生菌的生长，并在菌落
使目的微生物在种群中占优势，使筛选 1. 目的：
变得可能。
2. 两种方案：
（1）施加选择性压力分离法：采用特定的有利于 目的微生物富集的条件进行培养，使目的微生物 占优势，以实现快速分离纯化的目的。 （2）随机分离法：不能提供任何有助于筛选产生 菌的信息时，只能通过随机分离法进行分离。
（1）施加选择性压力分离法
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
发酵工程 工业生产水平的
生产菌种的性能 发酵和提取工艺条件
三个决定要素
生产设备
获得优良的生产菌种是实现高水平发酵工程工 业生产的第一环节。
本章内容
第一节 发酵工业常用的微生物菌种
第二节 自然界中微生物菌种的选择性分离
第三节 微生物菌种的选育
第四节 微生物菌种的退化、复壮和保藏 第五节 工业微生物菌种的扩大培养 第六节 种子培养基及其制备
集的培养物到固体培养基，分离优势微生物的单
菌落。
移种时间是关键，应在所需菌占优势时移种。
连续富集培养（恒化式富集培养）
改变限制性基质浓度来控制两种菌的比生长速率。 用于连续发酵生产的菌种选育特别适合。
固体培养基的使用
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
常用于分离酶产生菌，选择培养基中常含有所
需的基质，以便促使酶产生菌的生长，并在菌落
使目的微生物在种群中占优势，使筛选 1. 目的：
变得可能。
2. 两种方案：
（1）施加选择性压力分离法：采用特定的有利于 目的微生物富集的条件进行培养，使目的微生物 占优势，以实现快速分离纯化的目的。 （2）随机分离法：不能提供任何有助于筛选产生 菌的信息时，只能通过随机分离法进行分离。
（1）施加选择性压力分离法
酵母(既是微生物又是真核细胞)
生长迅速，营养要求不高，易培养； 安全性好； 比哺乳动物细胞操作简单； 具有一定的修饰蛋白的能力。
中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）表达系统
具有准确的转录后修饰功能； 具有产物胞外分越功能，便于下游产物分离纯化； 具有重组基因的高效扩增和表达能力； 具有贴壁生长特性，也可进行悬浮生长； CHO很少分泌自身的内源蛋白。
发酵工艺学菌种选育知识
发酵工艺学菌种选育知识发酵工艺学是利用微生物进行发酵过程的一门学科。
在发酵工艺中，菌种的选育是至关重要的一环。
合适的菌种可以有效地提高发酵产物的产量和质量。
以下是关于菌种选育的一些知识。
首先，菌种选育的目标是选择出具有较高产量和酶活性的菌株。
为了实现这个目标，研究人员通常要进行大量的菌株筛选和改造实验。
菌株筛选可以利用不同培养基、不同培养条件或者不同筛选方法进行。
这些方法可以根据微生物的生长速度、代谢产物的产量、代谢产物的种类等方面进行评估。
在筛选过程中，研究人员需要根据自己的需求，选择出适合自己研究目的的菌株。
其次，菌株改造是菌种选育的重要手段之一。
通过基因工程和遗传改造等方法，可以对菌株的基因组进行改造，增强其产酶能力和代谢能力。
例如，可以通过插入外源基因，或者通过基因敲除、基因突变等手段，改变菌株的代谢途径，从而增加特定产物的合成量。
菌株改造的过程需要深入了解菌株的基因组结构和代谢途径，同时需要具备一定的基因工程技术和实验操作技巧。
此外，菌株选育还需要考虑到菌株的可培养性和稳定性。
虽然自然界中存在着大量的微生物资源，但是只有部分微生物能够在实验室中进行培养和繁殖。
因此，研究人员需要从自然环境中筛选出能够稳定生长并具有较高产酶能力的菌株。
同时，在菌株选育过程中，需要注意菌株的稳定性问题。
由于发酵工艺涉及到多次传代和大规模培养操作，菌株必须具备较高的稳定性，能够长时间保持其产酶性能。
综上所述，菌种选育是发酵工艺学中非常重要的一环。
通过菌株筛选和改造，可以提高发酵产物的产量和质量。
在菌株选育过程中，需要考虑菌株的产酶能力、代谢能力、可培养性和稳定性等特性。
菌株选育的成功与否，将直接影响到发酵工艺的效果。
因此，在发酵工艺学研究中，菌种选育是一个非常关键和复杂的课题。
继续写相关内容，1500字菌种选育是发酵工艺学中的一项重要任务，它对于提高发酵产物的产量和质量至关重要。
在菌种选育中，研究人员需要通过筛选和优化菌株，以获得具有优良发酵性能的菌株。
发酵工程菌种的来源及选育
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
随机分离技术举例
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
（2）化学法
通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。 如：用添加CaCO3稳定培养基的PH来分离嗜碱性的放线菌。
（3）诱饵法
将某些固体物质如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等加到分离的土 壤或水中做成诱饵富集目的菌，待菌落长出后再进行分离。
3. 富集培养
富集培养
利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的不同要求，如温度、 PH、渗透压、溶氧浓度、碳源和氮源类型及浓度等，使目的微 生物在最适宜条件下迅速繁殖，数量增加，成为人工环境下的 优势种。
(二)生态学参数及培养基的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物 理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响 实验中所要分离的细菌的数量和种类。
2、Байду номын сангаас分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有 10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物， 部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤 维素或果胶。
真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例
稀释分离法
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）
在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h
形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
菌种选育发酵菌种的自然选育
菌种选育发酵菌种的自然选育发酵菌种的自然选育一、实验目的1. 学习从自然环境中分离工业微生物菌株的方法。
2. 熟悉无菌操作技术。
二、实验原理土壤是微生物是微生物生长的大本营，水体是微生物生长的第二场所。
自然界中微生物种类繁多，而且都是混在一起的，要获得发酵菌株，首先必须把它们从混杂的微生物群体中分离出来。
分离微生物菌株最基本的方法就是稀释法。
将样品放于无菌水中，通过振荡，使微生物悬浮于液体中，然后静止一段时间，由于样品沉降较快，而微生物细胞体积小沉降慢，会较长时间悬浮在液体中。
通过对微生物细胞悬浮液的进一步稀释和选择性培养，就可以分离出我们需要的目的菌株。
基本特征：⑴能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，并能生成较多的发酵产物。
⑵培养条件如温度、渗透压等易控制⑶抗杂菌和抗噬菌体能力较强。
⑷遗传稳定性高、不易退化。
⑸不产生有害的生理活性物质或毒素（食品或医药微生物菌株）。
本实验以土壤或淡水微生物的分离为例，介绍发酵菌株的自然选育方法，若要筛选海洋微生物，在配制培养基及无菌水时应用陈海水代替蒸馏水和生理盐水，其他操作都一样。
三、实验器材与试剂1. 样品土壤、水、苹果2. 培养基⑴Zobell 2216E 琼脂培养基：蛋白胨5g，酵母膏1g，FePO40.01g，NaCl 10g，琼脂20g，加水至1000mL，pH 7.2~7.4。
⑵营养琼脂培养基:蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂20g，加水至1000mL，pH7.2~7.4。
⑶高氏一号培养基：可溶性淀粉20g，KNO3 1g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，NaCl 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，琼脂20g，加水至1000mL，pH 7.2~7.4。
⑷苹果培养基:马铃薯（去皮）200g，煮沸20 min后过滤，滤液中加蔗糖20 g和琼脂20 g，补水至1000mL，pH自然。
若要筛选海洋微生物，上述培养基用陈海水（或2%海盐）配制。
发酵工程菌种的来源
提高发酵产品质量：通过保藏和管理，可以保证发酵产品的质量和产量， 提高经济效益。
促进科学研究：通过保藏和管理，可以积累大量的菌种资源，为科学研究 提供重要的材料。
感谢您的观看
汇报人：XX
霉菌是一种真 菌，广泛存在
于自然界中
霉菌在发酵工 业中具有重要 的应用价值， 如酿酒、制醋、
制酱等
霉菌的种类繁 多，常见的有 曲霉、青霉、
红霉等
霉菌的生长条 件包括温度、 湿度、氧气等， 需要适宜的环 境才能生长繁
殖
细菌
乳酸菌：用于乳制品、饮料、食品 等发酵
霉菌：用于酱油、醋、腐乳等发酵
添加标题
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基因重组：通过 基因工程将目标 菌株中的基因进 行重组，实现基 因的优化和表达
菌种改良：通过 基因转移和基因 重组，实现菌种 的改良和进化， 提高菌种的性能 和产量
应用领域：基因 转移和基因重组 育种在发酵工程、 生物制药、环境 保护等领域具有 广泛的应用前景
代谢工程和系统生物学在菌种改良中的应用
菌种管理规定和操作规范
菌种来源：实验室、 自然环境、其他来 源
菌种保藏：低温、 干燥、无菌等条件
菌种管理：定期检 查、记录、更新等 操作
操作规范：无菌操 作、避免污染、正 确使用等要求
菌种保藏和管理的意义和作用
确保菌种活性：通过保藏和管理，可以保持菌种的活性和稳定性，提高发 酵效率。
防止污染：通过保藏和管理，可以防止菌种受到其他微生物的污染，保证 发酵过程的顺利进行。
03 基因工程菌种的构建
基因工程菌种的概念和意义
基因工程菌种：通过基因工程技术 改造微生物，使其具有特定的功能 或特性
意义：基因工程菌种的构建可以提 高发酵效率、改善产品质量、降低 生产成本，具有重要的经济和社会 价值
促进科学研究：通过保藏和管理，可以积累大量的菌种资源，为科学研究 提供重要的材料。
感谢您的观看
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霉菌是一种真 菌，广泛存在
于自然界中
霉菌在发酵工 业中具有重要 的应用价值， 如酿酒、制醋、
制酱等
霉菌的种类繁 多，常见的有 曲霉、青霉、
红霉等
霉菌的生长条 件包括温度、 湿度、氧气等， 需要适宜的环 境才能生长繁
殖
细菌
乳酸菌：用于乳制品、饮料、食品 等发酵
霉菌：用于酱油、醋、腐乳等发酵
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基因重组：通过 基因工程将目标 菌株中的基因进 行重组，实现基 因的优化和表达
菌种改良：通过 基因转移和基因 重组，实现菌种 的改良和进化， 提高菌种的性能 和产量
应用领域：基因 转移和基因重组 育种在发酵工程、 生物制药、环境 保护等领域具有 广泛的应用前景
代谢工程和系统生物学在菌种改良中的应用
菌种管理规定和操作规范
菌种来源：实验室、 自然环境、其他来 源
菌种保藏：低温、 干燥、无菌等条件
菌种管理：定期检 查、记录、更新等 操作
操作规范：无菌操 作、避免污染、正 确使用等要求
菌种保藏和管理的意义和作用
确保菌种活性：通过保藏和管理，可以保持菌种的活性和稳定性，提高发 酵效率。
防止污染：通过保藏和管理，可以防止菌种受到其他微生物的污染，保证 发酵过程的顺利进行。
03 基因工程菌种的构建
基因工程菌种的概念和意义
基因工程菌种：通过基因工程技术 改造微生物，使其具有特定的功能 或特性
意义：基因工程菌种的构建可以提 高发酵效率、改善产品质量、降低 生产成本，具有重要的经济和社会 价值
发酵工程中菌种的选育流程
发酵工程中菌种的选育流程同学们！今天咱们来一起探索一下发酵工程中菌种选育的神奇流程。
咱们得知道为啥要选育菌种。
简单说，就是要找到那种特别厉害、能高效干活的菌种，这样才能让发酵过程更顺利，产出更好更多的东西。
那选育流程是咋样的呢？第一步，得去收集各种各样的菌种资源。
这就像是在一个大宝藏里寻宝，从不同的地方，比如土壤、水、空气，甚至是一些特殊的环境中，把可能有用的菌种都找出来。
收集好了之后，就进入筛选环节啦。
这时候，科学家们会设置一些条件，像是特定的温度、酸碱度、营养物质等等，看看哪些菌种能在这些条件下生存和生长得好。
就好像是一场考试，只有表现优秀的菌种才能通过这一关。
比如说，假设我们要选育能生产某种特定物质的菌种，那就会在培养基里加入相关的成分，然后观察哪些菌种能把这些成分转化成我们想要的东西。
通过了筛选的菌种，还不算完哦，接下来要进行优化和改良。
这就像是给优秀的学生开小灶，让他们变得更优秀。
可能会用一些技术手段，比如基因突变、基因重组，来改变菌种的基因，让它们具有更好的性能。
举个例子，有一种用于发酵生产酸奶的菌种，最初可能产酸能力不是很强，经过优化改良后，产酸速度更快，做出来的酸奶口感也更好。
然后呢，就是性能测试啦。
把选育出来的菌种放到实际的发酵环境中，看看它们到底表现得怎么样。
比如说，产量是不是提高了，质量是不是更好了，生产效率是不是更高了。
如果测试结果不错，那这个菌种就有可能被大规模地培养和应用啦。
但这还没完，在实际应用的过程中，还得不断地监测和改进，确保菌种一直保持良好的性能。
再比如说，在酿造葡萄酒的时候，选育出好的酵母菌种非常重要。
通过一系列的选育流程，找到那种能让葡萄酒风味独特、品质优良的菌种，才能酿出美味的葡萄酒。
发酵工程中菌种的选育流程就像是一场精心策划的选拔比赛，经过层层筛选、优化和测试，最终选出那些“超级菌种”，为我们的生产带来更好的效果。
同学们，了解了这个流程，是不是觉得发酵工程很有趣也很神奇呢？。
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细菌分离：以乳酸菌为例
放线菌的分离
(一)采样
菜园土或林地土
土壤中放线菌最丰富，品种齐全。 可以筛选新的放线菌。
从堆肥或过热的材料中如干 草或蔗渣中可分离到大量的嗜热 放线菌，从淡水和海洋环境中分 离到嗜碱性的和嗜酸性的菌种。
自然风干，备用
气生孢子能耐干燥，耐湿热能力 高于营养体，室温保存20天， 放线菌的数量和组成变化不大， 细菌大部分死亡。
(二)生态学参数及培养基的组成原则
1、加入培养基中的天然提取物种类和用量、环境生物物 理学参数以及用于平板涂布分离样本的溶剂都会影响 实验中所要分离的细菌的数量和种类。
2、就分离培养基的组成而言，部分培养基中必须含有 10-50%的天然提取物。加入培养基中的天然提取物， 部分培养基中则应含有多种碳、氮源，如几丁质、纤 维素或果胶。
随机分离原理与技术
从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速 灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛 选出所需的目的菌。
技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应 筛选方法的确定。
随机分离技术举例
药理活性化合物产生菌的筛选
药理活性化合物是指能抑制人类代谢中某一 个关键酶的微生物产物即酶抑制剂，从而达到 治疗的目的。
样本采集时所需的工具通常有无菌刮铲、土样采集器、 镊子、解剖刀、手套、无菌小塑料袋和塑料瓶等。
采样的注意事项
1、采样时应尽可能保持相对无菌； 2、所采集的样本必须具有某种代表性； 3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、
地点以及采集地点的地理、生态参数等； 4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的
（2）化学法
通过培养基中添加某些化学成分来增加微生物的数量。 如：用添加CaCO3稳定培养基的PH来分离嗜碱性的放线菌。
（3）诱饵法
将某些固体物质如石蜡、花粉、蛇皮、毛发等加到分离的土 壤或水中做成诱饵富集目的菌，待菌落长出后再进行分离。
3. 富集培养
富集培养
利用不同微生物生长繁殖对环境和营养的不同要求，如温度、 PH、渗透压、溶氧浓度、碳源和氮源类型及浓度等，使目的微 生物在最适宜条件下迅速繁殖，数量增加，成为人工环境下的 优势种。
1. 采样
(2) 采样对象
土壤、水、空气及枯枝落叶等，以土壤为主。
从土壤中采样要考虑土壤的以下特点：
① 有机质含量和通风状况
耕地、菜园 山坡上的森林
（有机质丰富、通气保水性能好）——细菌、放线菌
（有机质丰富、பைடு நூலகம்暗潮湿）——霉菌、酵母菌
沙土、无植被土壤、新开垦的生土、贫瘠的土地
——微生物少
② 取样的土层深度：5-25cm
3. 富集培养
富集培养的策略
（2）控制培养条件
➢ 溶氧浓度——好氧/厌氧 ➢ 高温——嗜热微生物 /非嗜热微生物 ➢ PH——嗜酸性/嗜碱性
4. 菌种分离
平板划线分离法 稀释分离法 毛细管分离法 小滴分离法
• 稀释倒 平板法
稀释分离法
• 平板 涂布法
注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。
筛选模型：目标酶
生长因子产生菌的筛选
筛选模型：营养缺陷型试验菌 筛选方法：利用被分离的微生物产物能否促进
营养缺陷型试验菌生长
氨
样品
复印平板法：首先在完全培养基琼脂平板上制
备密度适当的菌落，然后把平板上的菌落转移到
基
预处理生长丝 的圈绒 直法上 径， 应丝 比绒 培绷 养在 皿一 稍个 小圆 ）柱，的再光把滑它顶当面作上印（章圆，柱复
原地菌群的出现可能是短暂的；
5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于 4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结 束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境， 其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就 会出现消长。
1．土样采集方法
森林、旱地，草地可先掘洞，由土壤下层向上层顺 序采集；
3．水样采集方法
用于细菌检测的水样应收集于100m1干净、灭菌的广口 塑料瓶中。
由于表层水中含有泥沙，故在采样时应在较深的静水 层中采集水样。
方法是：握住采样瓶底浸入水中30-50cm处，然后瓶口 朝下打开瓶盖，让水样进入。如果有急流存在的话， 应直接将瓶口反向于急流。采集瓶从水中取出时应迅 速并带有较大的弧度。水样不应装满采样瓶。所有水 样都应在24h之内迅速进行检测，或者4℃下贮存。
水田等浸水土壤在不损土层结构的情况下插入圆筒 采集。如果层次要求不严格，可取离地面5～15cm处 的土。将采集到的土样盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中。
在采集植物根际土样时，一般方法是自土壤中慢慢 拔出植物根，在大量无菌水中浸渍约20min，洗去粘 附在根上的土壤，然后再用无菌水漂洗下根部残留 的土，这部分上却为根际土样。
植物体上细菌的分离：无菌富集，加植物浸出 液适度培养取样，洗涤，取1ml经适度稀释后涂 布平板。
水中细菌的分离：水样通过0.22μm无菌滤膜， 取出滤膜用1ml无菌稀释液将滤膜上的沉积洗下。 用样本稀释液适度稀释,涂布平板倒置培养或滤 纸压印分离法。
水中细菌分离的简易富集技术
在无菌的、用棉团塞好的广口三角烧瓶中连续培养，定期 取样涂布适宜分离琼脂平板上；
但对某些少数细菌则要求特殊的富集或 选择技术才能很好地被分离培养。
富集方法
运用细菌的酶诱导性，在分离培养基中添加若 干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来 激活细菌某一特殊基因组，可以建立起若干富 集技术。
富集可以促进抗性的产生并维持下来。
土样中细菌的富集：适度稀释后，取0.1m1涂布 已添加及未添加富集底物(如几丁质、纤维素等) 的土浸出汁平板。
土中真菌的分离：稀释法，混入法，压贴法，粘附法， 浮选法，注射器采集法，土过筛法，庶糖密度梯度离 心法。
植物材料中真菌的分离：植入法，压贴法，洗涤法， 浸泡法。
水中真菌的分离：水样稀释后涂布分离。饵诱技术常 用于水中真菌的富集。
子实体直接分离培养担子菌：新采集的子实体组织植 入平板内或在放于液体培养基表面放一小块无菌滤纸 上培养。
1. 采样
（1）采样原则 广泛性 充分了解目标微生物的性质（种类、生理特征等）
如根据微生物的营养类型：
纤维素酶产生菌——森林土壤 蛋白酶和脂肪酶产生菌——肉类加工厂和饭店潲水沟中的污水、污泥 利用碳氢化合物为碳源的菌株——油田附近
极端菌的筛选要根据其特殊的生理特征：
高温酶产生菌——南方、温泉、火山爆发处及北方的肥堆 耐压菌——油井或海洋深处
真菌的分离筛选：以啤酒酵母的分离为例
稀释分离法
取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）
在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h
形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用
纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次
性能测定
①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定
第三节 发酵工业菌种分离和筛选
一、菌种的来源
根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂 或菌种保藏部门索取或购买；
从大自然中分离筛选新的微生物菌种。
从自然界筛选
二、新种分离与筛选的步骤
制定方案：首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。 采样：有针对性地采集样品。 预处理：提高菌种分离的效率 富集培养：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培
2．植物体采集方法
在采集叶面时，一般是用灭菌的剪刀、打孔器、安 全刀片等，由几片新鲜叶片的同一部位切取一小块， 并注意不要损伤周围边缘。
选择叶面时应考虑叶位、叶龄、叶片正反面和在一 片叶上的取样部位。
采集植物根及根系时，方法与根际土样采集方法相 似。将洗净的根装入采样袋中，采集根系时，一般 与根际土样一起保存。
0.5mL的笨酚，室温下振荡30分钟，静止5分钟，取上清液用无菌水稀释 10倍。同时另取土样5g，不加热和笨酚处理，余步骤同上，作为对照。
（4）用移液管分别吸取原液和10倍稀释液各0.1ml标志稀释倍数的平板上， 涂抹均匀，倒置，28℃培养。
（5）培养10~14d，观察比较不同处理方法的生长情况、菌落特征。挑取红 色，无气生菌丝的小菌落以及其它菌落形态菌株接种斜面，进一步用于 形态观察和鉴定。
真菌分离
真菌分离
1、利用低碳／氮比的培养基可使真菌生长菌落分散， 利于计数，分离和鉴定。这里主要是利用营养成分 的减少而使生长减慢，并由此限制真菌的迁涉生长。
2、改变培养温度将有利于不同嗜温区真菌的分离。 3、有时真菌子实体形成必须有光线，这在分离培养
时应加以考虑。
4、选择性富集：是通过一定的方式使样本中一种或一群微 生物数量上的增加而利于分离的一种技术。
放线菌分离操作步骤
培养基添加重铬酸钾的方法减少细菌和真菌的数量
（1）取体积为300ml的高氏一号培养基，加入0.1%的重铬酸钾15mL，使之终 浓度为50ppm，摇匀，倒平板，待用。
用干热和苯酚处理减少链霉菌数量
（2）取土样5g，摊平于大号培养皿上，在恒温干燥箱中120℃干热处理1h。 （3）土样热处理后，加入装有45mL无菌水和少量玻璃珠的三角瓶中，加入
1、涂布的平板经培养后，如生长出菌落，则按涂布 不同稀释度的稀释液所得的单菌菌落和多菌菌落对 琼脂平板进行分类。
2、用无菌牙签将菌落转接到筛选平板上及转接至添 加有少量天然浸出液的适宜保藏琼脂斜面上。
3、筛选平板经培养后，按生长出菌落的形态学特征 如色素、菌落形态等进行最初分组。
4、将认为有希望的菌落用牙签转接到另一模拟分离 琼脂平板上进行筛选。
在不同水体的水样中加入一定的底物如蔗糖、多糖及蛋白 质等，同样可以促进水中微生物的增殖。
培养过程中可加入低浓度的抗真菌剂以抑制真菌的生长。 另一富集方法是在培养烧瓶中添加细菌“附着材料”，如