金刚刺地龙汤对弗氏佐剂诱导类风湿关节炎大鼠的影响

金刚刺地龙汤对弗氏佐剂诱导类风湿关节炎
大鼠的影响
张浩敏,赵培源,张信昕,杜汝番,阴蔓茹,徐晨雨,胡飞雪,宗　斌
(河南中医药大学,河南郑州450046)
[摘要]
踝关节组织的影响。

将24只健康雌性SD 大鼠随机分为空白组、模型组、双氯芬酸钠组、金
刚刺地龙汤组,每组6只。

除空白组外,其余组大鼠采用左后足跖部皮内注射0.1mL 完全弗式佐剂方法制备类风湿关节炎模型。

实验第14天开始,双氯芬酸钠组给予双氯芬酸钠溶液9mg /(kg ·d )灌胃,金刚刺地龙汤组给予金刚刺地龙汤药液10.62g /(kg ·d )灌胃,空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃,均1次/d ,连续14d 。

实验期间观察各组大鼠行为学表现;评估各组大鼠造模前及实验第1,3,7,10,14,16,19,22,29天左后肢足跖炎症程度,测量足踝体积、足踝围;灌胃结束后处死大鼠,计算脾脏指数,HE 染色观察踝关节组织病理学形态,使用ELISA 法测定血清中肿瘤坏死因子-α(TNF -α)、白细胞介素-6(IL -6)、白细胞介素-1β(IL -
1β)水平。

模型组大鼠精
神状态萎靡,反应迟钝;各时间点足跖炎症程度评分、足踝体积、足踝围及脾脏指数和血清中IL -6、IL -1β、TNF -α水平均明显高于空白组(P 均<0.05);关节软骨组织严重破坏,大量炎细胞浸润,毛细血管增生。

与模型组比较,双氯芬酸钠组、金刚刺地龙汤组大鼠精神状态与活动程度均明显改善;实验第22天和实验第29天左后肢足跖炎症程度评分、实验第16,19,22,29天足容积和足踝围均明显低于同期模型组(P 均<0.05),且金刚刺地龙汤组大鼠实验第22天足容积明显低于同期双氯芬酸钠组(P <0.05);脾脏指数均明显增高(P 均<0.05),血清中IL -6、IL -1β、TNF -α水平均明显降低(P 均<0.05);
骨侵蚀及炎细胞浸润、毛细血管增生均明显减轻。

金刚刺地龙
汤可明显减轻完全弗氏佐剂诱导类风湿关节炎大鼠足趾肿胀和关节组织破坏,机制可能与下调炎
症因子水平、减轻炎症反应有关。

[关键词]　金刚刺;地龙;类风湿关节炎;佐剂性关节炎;大鼠doi :10.3969/j.issn.1008-8849.2023.22.010
[中图分类号]　R -332　[文献标识码]　A　[文章编号]　1008-8849(2023)22-3121-06
[作者简介]　张浩敏,男,本科在读。

[通信作者]　赵培源,E -mail :prayertcm@
[基金项目]　河南省本科高校省级大学生创新创业训练计划项目(S202110471031)
Effect of Smilacis Chinae Rhizoma Lumbricus decoction on freund ’s adjuvant
Induced rheumatoid arthritis induced
ZHANG Haomin,ZHAO Peiyuan,ZHANG Xinxin,DU Rufan,YIN Manru,XU Chenyu,HU Feixue,ZONG Bin (Henan University of Traditional Chinese Medicine,Zhengzhou 450046,Henan,China)
Abstract :Objective It is to observe the anti⁃inflammatory effect of Smilacis Chinae Rhizoma Lumbricus decoction (SCRLD)on rheumatoid arthritis (RA)induced by complete Freund’s adjuvant in rats and its histopathological effect on inflamed ankle.Methods Twenty⁃four healthy female SD rats were randomly divided into blank control group,model group,diclofenac sodium group and SCRLD group,with 6rats in each group.All the rats of every group except for the
blank control group were given intradermal injection of 0.1mL complete Freund’s adjuvant in the left hind paw to establish arthritis models.On the 14th day of modeling,the rats in the diclofenac sodium group were intragastrically administered with 9mg /(kg·d)diclofenac sodium solution,and the rats in the SCRLD group were intragastrically administered with
10.62g /(kg·d)SCRLD,the rats in the blank control group and the model group were given the same amount of normal
saline by gavage,all once daily,continuously treated for14days.During the experiment,the behavioral performance of rats in each group was observed,the degrees of toe inflammation in the left hind limb of rats were assessed before modeling and on days1,3,7,10,14,16,19,22,and29of the experiment in all groups,and the ankle volume,ankle circumfer⁃ence of rats in each group were measured.The rats were executed at the end of gavage,their splenic index was calculated, the histopathological morphology of the ankle joints was observed by HE staining,and the serum levels of tumor necrosis factor⁃α(TNF⁃α),interleukin⁃6(IL⁃6),and interleukin⁃1β(IL⁃1β)were determined by ELISA.Results The rats in the model group were depressed and unresponsive,their toe inflammation degree scores,ankle volume,ankle circumference and splenic index and serum levels of IL⁃6,IL⁃1βand TNF⁃αwere all significantly higher than those of the blank group at all time points(all P<0.05),and their articular cartilaginous tissues were severely damaged,with a large number of in⁃flammatory cells infiltrated,and capillary pared with the model group,the mental state and activity level of the rats in the diclofenac sodium group and the vajra dillon soup group were significantly improved;the scores of the de⁃gree of inflammation in the left hind limb on the22nd and29th days of the experiment,the foot volume and ankle circum⁃ference on the16th,19th,22nd and29th days of the experiment were significantly lower than those in the same period of time in the model group(P<0.05),and the foot volume on the22nd day of the experiment in the vajra dillon soup group was significantly lower than that in the same period of time in the model group.Diclofenac sodium group(P< 0.05);spleen index were significantly higher(P<0.05),serum levels of IL⁃6,IL⁃1β,TNF⁃αwere significantly lower (P<0.05);bone erosion and inflammatory cell infiltration,capillary proliferation were significantly pared with the model group,the mental state and activity of rats in the diclofenac sodium group and SCRLD group were signifi⁃cantly improved,the scores of the inflammation degree of the left hind limb on the22nd and29th days of the experiment, the foot volume and ankle circumference on the16th,19th,22nd and29th days of the experiment were significantly low⁃er than those in the model group at the same time period(all P<0.05),and the foot volume on the22nd day of the ex⁃periment in the SCRLD group was significantly lower than that in the diclofenac sodium group(P<0.05);the spleen inde⁃xes of rats in the diclofenac sodium group and SCRLD group were significantly increased(both P<0.05),and the serum levels of IL⁃6,IL⁃1β,TNF⁃αwere significantly decreased(all P<0.05),the bone erosion and inflammatory cell infiltra⁃tion,capillary proliferation were significantly reduced.Conclusion Smilacis Chinae Rhizoma Lumbricus decoction can sig⁃nificantly reduce toe swelling and joint tissue destruction in rats with complete Freund’s adjuvant⁃induced rheumatoid ar⁃thritis,and the mechanism may be related to down⁃regulating the levels of inflammatory factors to alleviate inflammatory re⁃sponses.
Keywords:Smilacis Chinae Rhizoma;Lumbricus;rheumatoid arthritis;adjuvant arthritis;rats
类风湿关节炎是一种全身性慢性炎症性疾病,以侵蚀性关节炎为主要特征,易反复发作,长期持续进展可导致病变部位僵硬畸形,伴骨骼肌萎缩[1]。

类风湿关节炎属自身免疫性疾病,病因尚不明确。

由于该病发病后期的高致残性,临床上普遍强调尽早使用改善病情抗风湿病药物,以期防止患者骨质受到严重破坏。

但由于目前缺乏特效药物,同时临床常用药物具有较强的潜在不良反应,因此类风湿关节炎的临床治疗存在一定难度。

中医认为类风湿关节炎属于“痹证”范畴,临床中针对该病的中医药诊疗显示出一定优势[2]。

金刚刺地龙汤由前人临床经验总结所得,目前被收集进了《古方养生:一对一中医验方》中。

该方活血通络、温经祛湿,是治疗痹证的常用方剂,能够有效减轻患者病情,但其作用机制尚不明确。

本实验以完全弗氏佐剂诱导类风湿关节炎大鼠为模型,探讨了金刚刺地龙汤对类风湿关节炎的保护作用及可能机制。

1　实验材料与方法
1.1　实验动物　SPF级12周龄雌性SD大鼠24
只,体重200~285g,由郑州市中原区梦飞养殖场提
供,许可证号:SCXK(豫)2020-0009。

所有大鼠置
于河南中医药大学实验动物中心饲养[许可证号: SYXK(豫)2021-0015],饲养环境温度21~25℃,湿度40%~60%,光照时间每天12h。

大鼠自由进
食和饮水,定期更换垫料,清洁消毒鼠笼。

动物实验
遵守河南中医药大学实验动物福利伦理相关法规和
各项规定。

1.2　实验药物及试剂　金刚刺地龙汤,由金刚刺15g、广地龙15g、蜈蚣2g、黄芪40g、桂枝12g、海风藤12g、威灵仙12g、甘草10g组成(各药材购于北京同仁堂药材有限责任公司);双氯芬酸肠溶片(白云山汤阴东泰药业有限责任公司,规格:25mg/片);
完全弗氏佐剂(Chondrex公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒、白细胞介素-6(IL-6) ELISA试剂盒、白细胞介素-1β(IL-1β)ELISA试
剂盒(武汉纯度生物公司)。

1.3　实验仪器　电子天平(五鑫衡器有限公司,YH-M20001),电子计重秤(上海浦春计量仪器有限公司,JSB6-01),医用离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司,TDZ5-WS),精密电子天平(梅特勒托利多科技(中国)有限公司,XPR304S),低温保存箱(青岛海尔特种电器有限公司,DW-86L828W),病理切片扫描仪(匈牙利3DHISTECH MIDI 250FLASH DESK)。

1.4　实验方法　所有大鼠置于实验室动物房中相同环境下适应性喂养1周,造模前称重标号,随机分为空白组、模型组、双氯芬酸钠药组、金刚刺地龙汤组,每组6只。

模型组和给药组大鼠建立类风湿关节炎模型:固定大鼠,使用医用酒精对大鼠足跖皮肤消毒后,采用1mL注射器于大鼠左足足垫皮下朝踝关节方向进针,注射0.1mL完全弗氏佐剂后按压注射部位5s防止佐剂流出[3];空白组大鼠同期同部位注射0.1mL生理盐水。

实验过程中测定大鼠足趾容积以判断造模是否成功。

自实验第14天开始,双氯芬酸钠组大鼠给予双氯芬酸钠溶液9mg/(kg·d)灌胃,金刚刺地龙汤组大鼠给予金刚刺地龙汤药液10.62g/(kg·d)灌胃,空白组和模型组大鼠灌胃等量生理盐水,均1次/d,连续14d。

1.5　检测指标及方法
1.5.1　一般行为学表现　实验期间,每天观察记录大鼠的体型、毛色、活动情况、精神状态以及进食饮水等情况。

1.5.2　左后肢足跖炎症程度评分　造模前及实验第1,3,7,10,14,16,19,22,29天评估各组大鼠左后肢足跖炎症程度。

评分标准:行动自如,无关节红肿情况为0分;足跖出现红色斑点,轻度肿胀为1分;行动变缓,关节部位中度肿胀为2分;行动困难,关节重度肿胀为3分;几乎不再行动,关节严重肿胀为4分。

1.5.3　足容积和足踝围　造模前及实验第1,3,7, 10,14,16,19,22,29天用引流法测量各组大鼠足容积:将大鼠的左后肢放入装有水的有刻度的玻璃容器中,水面不要过大鼠的踝关节,重复测量3次,记录每次的排水量,取平均值。

测量足容积后,用软尺测量大鼠左后足踝围,重复测量3次,取平均值。

1.5.4　脾脏指数　末次灌胃结束后,麻醉处死各组大鼠,取脾脏组织,去除脂肪并用滤纸吸干表面液体后称重,脾脏指数=脾脏质量/体重[4]。

1.5.5　踝关节滑膜组织病理形态　处死各组大鼠后,切取左后肢并剥离踝关节滑膜组织,放入4%多聚甲醛液中固定。

经过EDTA液脱钙后石蜡包埋、切片,进行常规HE染色,光学显微镜下观察滑膜组织的病理形态。

1.5.6　血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平　末次灌胃结束后,从大鼠腹主动脉采集血液。

静置1h 后,将血液在离心机中以3000r/min离心15min,取上清液,ELISA法检测血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平。

1.6　统计学方法　采用SPSS26.0统计学软件进行数据分析,采用GraphPad Prism9软件作图。

正态分布计量数据以均数±标准差(⎺x±s)表示,通过单因素分析法判断数据的方差齐性,如果方差齐,组间两两比较采用LSD检验;方差不齐,使用Dun⁃nett’s T3检验。

P<0.05表示差异有统计学意义。

2　结 果
2.1　各组大鼠一般行为学表现　造模前各组大鼠精神状态一致,皮毛有光泽,活泼好动,反应敏捷,足跖关节无红肿。

造模各组大鼠造模后均表现出不同程度的精神状态萎靡,反应迟钝;金刚刺地龙组与双氯芬酸钠组大鼠随着用药时间的延长,精神状态出现好转,足跖关节肿胀程度明显减轻。

2.2　各组大鼠足跖炎症程度评分　模型组大鼠各时间点左后肢足跖炎症程度评分均明显高于同期空白组(P均<0.05),双氯芬酸钠组和金刚刺地龙汤组大鼠实验第22天和实验第29天左后肢足跖炎症程度评分均明显低于同期模型组(P均<0.05),双氯芬酸钠组和金刚刺地龙汤组大鼠各时间点左后肢足跖炎症程度评分比较差异均无统计学意义(P均> 0.05)。

见图1。

图1　空白组和类风湿关节炎各组大鼠不同
时间点足跖炎症程度评分
2.3　各组大鼠足容积和足踝围比较　实验第1,3, 7,10,14天,造模各组大鼠足容积和足踝围均明显高于同期空白组(P均<0.05),造模各组大鼠足容积和足踝围比较差异均无统计学意义(P均> 0.05)。

实验第16,19,22,29天,模型组大鼠足容积和足踝围均明显高于同期空白组(P均<0.05),双氯芬酸钠组和金刚刺地龙汤组大鼠足容积和足踝围均明显低于同期模型组(P均<0.05),且金刚刺地龙汤组大鼠实验第22天足容积明显低于同期双氯芬酸钠组(P<0.05)。

见表1及表2。

2.4　各组大鼠脾脏指数比较　空白组、模型组、双氯芬酸钠组和金刚刺地龙汤组大鼠脾脏指数分别为(22.99±1.39)%、(27.23±
3.70)%、(38.26±8.51)%、(29.26±7.32)%,模型组、双氯芬酸钠组和金刚刺地龙汤组大鼠脾脏指数均明显高于空白组(P均<0.05),但金刚刺地龙汤组大鼠脾脏指数明显低于双氯芬酸钠组(P<0.05)。

2.5　各组大鼠踝关节滑膜组织病理学形态　空白组大鼠踝关节组织结构正常,组织细胞完整,未出现异常增生及异常细胞;模型组大鼠踝关节软骨组织严重破坏,大量炎细胞浸润,毛细血管增生;双氯芬酸钠组与金刚刺地龙组大鼠踝关节组织结构破坏程度、炎性细胞浸润程度、毛细血管增生程度均较模型组轻。

见图2。

表1　空白组和类风湿关节炎各组大鼠不同时间点足容积比较(⎺x±s,mL)组别只数造模前实验第1天实验第3天实验第7天实验第10天实验第14天实验第16天实验第19天实验第22天实验第29天空白组62.18±0.302.33±0.092.34±0.152.30±0.122.43±0.242.41±0.132.26±0.152.16±0.112.20±0.122.18±0.13模型组62.22±0.193.82±0.23①3.76±0.13①3.63±0.29①3.59±0.39①3.78±0.46①3.77±0.40①3.60±0.45①3.66±0.40①3.62±0.26①
双氯芬酸钠组62.16±0.253.57±0.17①3.78±0.33①3.62±0.08①3.62±0.32①3.52±0.36①3.13±0.38②2.87±0.40②2.97±0.29②2.69±0.25②金刚刺地龙组62.21±0.253.68±0.22①3.56±0.15①3.37±0.19①3.37±0.26①3.20±0.12①3.15±0.20②3.05±0.31②2.85±0.96②③2.70±0.22② 注:①与空白组比较,P<0.05;②与模型组比较,P<0.05;③与双氯芬酸钠组比较,P<0.05。

表2　空白组和类风湿关节炎各组大鼠不同时间点足踝围比较(⎺x±s,cm)组别只数造模前实验第1天实验第3天实验第7天实验第10天实验第14天实验第16天实验第19天实验第22天实验第29天空白组63.10±0.193.20±0.043.20±0.053.10±0.093.20±0.133.30±0.103.20±0.083.10±0.073.10±0.083.10±0.10模型组63.00±0.144.30±0.08①4.20±0.08①4.10±0.19①4.10±0.26①4.10±0.33①4.20±0.30①4.10±0.33①4.00±0.29①4.20±0.18①双氯芬酸钠组63.10±0.164.10±0.12①4.30±0.21①4.10±0.22①4.10±0.26①4.10±0.29①4.00±0.28②3.70±0.27②3.70±0.23②3.50±0.17②金刚刺地龙组63.10±0.174.20±0.15①4.10±0.10①3.90±0.15①4.00±0.18①3.90±0.13①3.80±0.02②3.70±0.18②3.60±0.05②3.50±0.16② 注:①与空白组比较,P<0.05;②与模型组比较,P<0.05。

图2　空白组和类风湿关节炎各组大鼠踝关节组织病理形态(HE染色,×100)
2.6　各组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平
比较　模型组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α
水平均明显高于空白组(P均<0.05);双氯芬酸钠
组和金刚刺地龙汤组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平均明显低于模型组(P均<0.05);金刚刺地龙汤组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α
水平均明显高于双氯芬酸钠组(P均<0.05)。

见
表3。

3　讨 论
表3　空白组和类风湿关节炎各组大鼠血清中IL-6、IL-1β、TNF-α水平比较(⎺x±s,pg/mL)组别只数IL-6IL-1βTNF-α
空白组668.95±10.289.47±1.8483.73±14.23模型组6135.32±8.28①26.15±3.49①217.29±18.95①双氯芬酸钠组688.93±7.93②15.85±2.68②134.63±32.20②金刚刺地龙汤组695.61±9.82②③24.94±3.62②③157.52±5.09②③ 注:①与空白组比较,P<0.05;②与模型组比较,P<0.05;③与
双氯芬酸钠组比较,P<0.05。

类风湿关节炎以手、腕、足等小关节红、肿、热、
痛为主要表现,持续发展可导致关节结构及骨骼结
构破坏。

目前研究表明持续的炎症反应与类风湿关
节炎的反复发作及进展密切相关,类风湿关节炎发
作会导致免疫异常,免疫系统被激活,可活化并刺激B细胞,释放大量的炎性细胞因子如IL-6、TNF-α和IL-1β,造成器官和组织的损伤,影响机体的正
常功能[5]。

有研究表明,滑膜组织中的滑膜巨噬细胞也参与类风湿关节炎的免疫反应,巨噬细胞能够产生大量的NO[6],而NO又能够促进IL-6、IL-1β、TNF-α等炎症因子的合成分泌,从而激发、维持以及进一步加强炎症反应[7],各种细胞因子组成复杂的因子网络,造成了破骨细胞骨吸收过程和成骨细胞骨重构过程的平衡失调[8]。

本实验结果显示,完全弗氏佐剂诱导类风湿关节炎大鼠出现足趾肿胀、关节炎症,脾脏指数明显增高,关节软骨组织严重破坏,大量炎细胞浸润,毛细血管增生,血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均明显增高。

说明类风湿关节炎模型建立成功,出现明显炎症反应。

中医学理论认为,类风湿关节炎主要由于机体
受到风、寒、湿侵袭,加之患者自身气血虚弱、肝肾亏
损引发。

《临证指南医案》指出:“痹者,闭而不通之
谓也,正气为邪所阻,脏腑经络不能畅达,皆由气血
亏损,腠理疏豁,风寒湿三气得以乘虚外袭,留滞于
内以致湿痰、浊血流注凝涩而得之。

”[9]由此可知,痹证多由筋脉痹阻、气血不通所起,筋脉痹阻则经脉不通,不通则痛;气行不畅则湿浊痰聚,阻滞经络;血行不畅则瘀,瘀久则化热,从而表现出红、肿、热、痛等典型的炎性症状。

故治宜清热宣痹活络,或就此感受邪气不同,可分别给予祛风、散寒、除湿、清热、化痰诸法,便于对于不同患者进行辨证治疗[10]。

金刚刺地龙方中君药金刚刺祛风除湿、软坚散结,地龙咸寒降泄、通经活络;臣药蜈蚣通络止痛、攻毒散结,黄芪补气升阳、除痹止痛、利水消肿,桂枝发汗解肌、温通经脉,海风藤、威灵仙通络止痛,辅佐君药共奏通络止痛、除痹散结之功;甘草为使,调和诸药,缓和金刚刺、地龙、蜈蚣等药物的峻烈之性。

现代药理相关研究表明,短梗菝葜和金刚刺生药中富含甾体皂苷类化合物成分,具有较好的抗炎活性[11-12];地龙具有抗炎、抗血栓作用[13];蜈蚣能促进成骨细胞生,有抗炎镇痛作用[14];黄芪能抑制淋巴母细胞转化,可抑制Ⅰ型变态反应[15]。

本实验结果发现,金刚刺地龙汤可以减轻大鼠足趾肿胀程度,降低大鼠关节炎评分和血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平,减轻踝关节滑膜组织炎细胞浸润和踝关节组织结构破坏。

说明金刚刺地龙汤可以下调IL-6、IL-1β、TNF-α水平,减轻炎症反应,从而抑制炎症反应对大鼠关节结构的破坏。

综上所述,金刚刺地龙汤可明显减轻完全弗氏佐剂诱导类风湿关节炎大鼠足趾肿胀和关节组织破坏,分析与抑制IL-6、IL-1β、TNF-α的表达,减轻炎症反应有关,为其临床应用提供了一定理论依据。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。

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重和生理功能、生理职能、社会功能、精神健康评分均高于干预前,但观察组各指标改善更明显,证实PDCA 循环护理干预及联合延续护理干预的良好临床效果。

食管癌术后引发的并发症以及术后放、化疗的不良反应对患者生理、心理、社会功能均造成不同程度损害
[19]。

本研究也显示,干预前2组患者癌症自
我管理效能感量表评分、社会支持评定量表评分均较低,且对照组由于缺少针对性的延续性护理,出院3个月后这2个量表各项评分改善不明显,甚至正性态度、自我减压评分以及主观支持、对支持的利用度评分有降低趋势。

观察组给予延续护理后,上述2个量表中各项评分均明显增高,提示联合延续护理干预可提高患者自我管理效能感。

综述所述,PDCA 循环延续性护理干预是新型多科室团队合作护理干预方式,有利于岗位职责分工,重点调动各环节的协调干预,有利于护理人员及时跟踪病情,遵医嘱为患者提供护理服务,使护理干预连贯、规范,不仅可以改善患者身体状况、生活质量,还可以提升癌症自我管理效能感、社会支持能力,提高整体护理质量,效果优于单纯PDCA 循环护理干预。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。

[
参
考
文
献
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