实验3 化脓性球菌的分离鉴定
微生物实验总结
灭菌：1．热力灭菌法干热灭菌法：160-170℃，2h高压蒸汽灭菌法：103.4kPa (121℃)，15-30min 2．紫外线灭菌：265-266nm，破坏DNA构型培养基：1.液体培养基——基础培养、生化反应、糖发酵管2.固体培养基（斜面培养基）——纯培养、短期保存菌株3.半固体培养基——检测细菌动力化脓性球菌的分离鉴定：致病性肠道杆菌的分离鉴定：平板划线法接种工具：接种环培养基——化脓菌：血平板，肠道菌：SS平板注意事项：菌量适当；遵守无菌操作原则，全程避免杂菌污染；划线力度、划线角度观察细菌的形态特征1.单染色法：观察细菌形态，但不能鉴别2.复染色法（观察形态，鉴别细菌）革兰染色法、抗酸染色法3.特殊染色法——特殊结构或特殊成分的染色常见应用：荚膜、芽胞、鞭毛、异染颗粒染色革兰染色法：1.涂片标记载玻片→滴加标本→用接种环涂布均匀，形成直径约1cm菌膜2.干燥：空气中，或酒精灯火焰上方热空气中3.固定：迅速通过酒精灯外焰三次，冷却4.染色初染：滴加结晶紫，覆盖菌膜，静臵1min，流水冲洗(背面) 媒染：滴加卢戈碘液，覆盖菌膜，静臵1min，流水冲洗脱色：玻片浸入95%乙醇中，冲洗至染料不再溶下为止，水洗(背面)复染：滴加石炭酸稀释复红，覆盖菌膜，静臵30s，流水冲洗(背面)5.干燥(滤纸吸干水分)、镜检(油浸镜)甘露醇发酵实验培养基：甘露醇发酵管接种工具：接种针方法1灭菌接种针2从斜面沾取菌落3接种至培养基液面下4灭菌接种针5培养18-24h结果判定阳性：蓝→黄致病性葡萄球菌血浆凝固酶实验玻片凝集试验方法1玻片划分两格2灭菌接种环3分别取盐水或兔血浆于两4取待检菌，盐水中研磨5灭菌接种环6取待检菌，兔血浆中研磨7摇动玻片，2min内观察结果判断阳性：出现凝集致病性葡萄球菌常(+)药敏试验培养基：普通平板方法：药片扩散法按照无菌操作原则，用接种环取少量纯培养物接种于平板上，反复交叉密集划线镊子灭菌，冷却，分别取4种药片，平贴于平板上，轻轻压药片间距>24mm、药片距平板边缘>15mm静臵15min，平板倒臵培养16-18h，观察结果因子血清鉴定步骤鉴定属：A-E多价血清鉴定组：A-E单价0抗体血清鉴定种：H抗体血清注意事项血清量足够，避免干燥每格研磨后，灭菌接种环，避免交叉污染2min内观察结果在SS琼脂平板上，致病性肠道杆菌菌落特征是直径小，无色或淡红色半透明，非致病性肠道杆菌的菌落特征是直径中等大小，深红色。
医学微生物学化脓性球菌
抗菌药物研究
针对化脓性球菌的抗菌药物研究主要集中在新型抗生素的发现和已有抗生素的 改良，以克服细菌耐药性问题。
新型疫苗与免疫治疗研究
新型疫苗
针对化脓性球菌感染的新型疫苗研究，旨在通过激发机体免疫反应，预防和治疗 感染。
抗菌药物的剂量和疗程
抗菌药物的剂量和疗程应根据患者的病情和医生 的建议来确定，以确保治疗效果和防止耐药性的 产生。
抗菌药物的联合应用
在某些情况下，可能需要联合应用多种抗菌药物 来治疗化脓性球菌感染。联合应用抗菌药物时应 谨慎，并遵循医生的建议。
05
化脓性球菌研究进展
耐药性与抗菌药物研究
耐药性机制
治疗。
综合治疗
在治疗过程中，应注意 休息，遵医嘱治疗，同 时保持良好的生活方式
和饮食习惯。
防止传播
在治疗过程中，应注意 防止感染传播给其他人
或动物。
抗菌药物选择与应用
1 2 3
根据病菌类型选择抗菌药物
不同类型的化脓性球菌对不同的抗菌药物敏感程 度不同，因此应根据具体的病菌类型选择合适的 抗菌药物。
免疫治疗
免疫治疗作为一种新型治疗方法，通过调节机体免疫系统，增强对化脓性球菌的 清除能力。
感染机制与防治策略研究
感染机制
深入了解化脓性球菌的感染机制，有助于为防治策略提供理 论依据，降低感染风险。
防治策略
针对化脓性球菌的防治策略研究，包括预防措施、早期诊断 和有效治疗等方面的研究。
THANKS
感谢观看
临床表现与疾病类型
疖
疖是化脓性球菌引起的皮肤感染 ，表现为局部红肿、疼痛，可形
微生物学实验设计_案例导入_皮肤化脓性病原菌的分离和鉴定
化脓性球菌的防治原则
注意个人卫生，要及时用消毒药物处理皮肤创伤（如碘酊）等 预防交叉感染，减少同带菌者或有相似症状的人有皮肤接触，
可疑体现在： （1）菌落周围出现溶血环 （2）菌落颜色为金黄色
生物化学反应鉴定： 甘露醇分解试验（+） 血浆凝固酶试验（+） 耐热核酸酶试验（+）
血清学检测SPA：协同凝集 试验（+）
引起皮肤化脓 性感染的细菌 为金黄色葡萄
球菌
致病性葡萄球菌的鉴定—血浆凝固酶实验
实验原理：许多病原性的葡萄球菌菌株在代谢过程中能产 生一种血浆凝固酶样物质，可使含有枸橼酸钠或肝素抗凝 剂的兔或人血清发生凝固，而非致病病株一般不产生此酶， 故凝固酶可作为鉴别葡萄球菌有无致病性的重要指标之一。
勤洗手，勤洗澡，对于脸部的化脓，不要将其抓破或挤出，因 脸部的化脓位于危险三角区及其附近，极易引起颅内感染引起 严重后果 由于金黄色葡萄球菌易产生耐药性，治疗因根据药敏实验结果 针对性的选用窄谱抗生素，防止耐药性菌株扩散 对于反复发作的顽固性疖疮，宜采用自身菌苗进行人工自动免 疫，有一定疗效（原理是重建皮肤微生态平衡，粪菌移植也是 运用这个原理） 少熬夜，养成正常的作息习惯，多吃蔬菜水果，帮助机体恢复
皮肤化脓性病原菌的分离与鉴定
案例导入
机械学院王斌同学皮肤表面有一化脓感染病灶， 经久不愈。请设计一个方案：从脓汁中分离、鉴定 化脓性病原菌，并提出防治原则。
分析原因
皮肤表面的正常细菌群：皮肤表面常见的细菌有类白喉杆菌、凝固酶 阴性葡萄球菌、丙酸杆菌、假单孢菌、分枝杆菌、变形杆菌、大肠埃 希菌、不动杆菌、克雷伯菌等
血液标本中常见化脓性球菌的分离培养与鉴定
血液标本培养
增菌培养
标本接种于硫酸镁葡萄糖肉汤中（1:5～1： 10），37℃孵育，每日观察，连续7天。如疑有 菌生长，涂片、革兰染色、镜检，初步报告。
根据涂片结果，选择相应的抗菌药物进行初 步药敏试验
自动血培养检测系统
• 原理：细菌和真菌生长时释放CO2，通 过各种手段检测CO2来判断阴阳性
A群链球菌 “敏感”
药物敏感试验
检测分离 菌株对各种药物 的敏感性，为临 床治疗提供依据
Diameter of zone of inhibition(mm)
Antibiotic Resistant Intermediate Sensitive
Penicillin G ≤20
(S*.aureus ≤11 E.coli)
培养基的制备
基础培养基（营养肉汤） 牛肉膏 0.3% 蛋白胨 1% NaCl 0.5% pH 7.2-7.6
营养琼脂：营养肉汤添加1.5%琼脂 半固体培养基：营养肉汤添加0.25%琼脂
培养基的制备
培养基制备的基本过程
1. 调配成分：加定量蒸馏水， 准确称取各成分，混合 2. 溶解：沸水浴 3. 校正pH：用NaOH校正，高压灭菌后，下降0.1-0.2 4. 滤过澄清 5. 定容、分装：斜面（试管高度的1/3-1/4） 6. 灭菌：121℃ 15-20min
21～28
≥29
12～21
≥22
Streptomycin ≤11
12～14
≥15
Amikacin ≤14 Cefradine ≤14
15～16
≥17
15～17
≥18
Minocyline ≤14
常见病原性细菌的分离鉴定方法1
在载玻片两端滴加生理盐水一滴，用 接种环挑取待检菌(金葡菌、白葡菌)， 分别与它们研磨、混匀，滴加兔血浆1滴， 立即观察有无凝固颗粒，若有即为阳性。 此法用于测定结合型凝固酶。
二、链球菌属
葡萄球菌菌落观察（教师示教）
分别取金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球 菌培养物，用分离划线方法接种血平板， 置37℃培养，18h～24h以后观察结果。
血琼脂平板中18h-24h后形成圆形隆 起、表面光滑、湿润、边缘整齐、不透明 的菌落，不同菌种可产生金黄色、白色或 柠檬色色素。某些菌种（株）有溶血现象。
血浆凝固酶试验（教师示教）
（学生操作 ）
小结
1.一般细菌的鉴定流程 2.化脓性球菌的鉴定方法
一般细菌的鉴定流程 细菌学检验Biblioteka 采集标本和注意事项的一般程序
分离与培养 1.培养基的选用
2.培养方法
3.无菌操作
细菌的鉴定 1.涂片，革兰染色，镜检
2.生化反应
3.血清学鉴定
化脓性球菌的生物学性状
葡萄球菌 链球菌（肺炎球菌） 奈瑟菌属
麦芽糖发酵试验：分别取脑膜炎球菌、 淋球菌接种于麦芽糖发酵管中，置 37℃24h～48h观察结果。
细菌学检验的一般程序
涂片染色
初步诊 断报告
增菌
快速诊 断试验
接种平板培养基，分离单个菌落
挑取可疑菌落
涂片染色
各种鉴定试验
生化试验 血清学实验 动物试验 药敏试验
明确诊断报告
血液标本
革兰染色 染色性 形状排列
血平板分离培养 溶血现象、革兰染色
初步诊断
实验设计局部化脓性炎症病原菌的分离鉴定及敏感药物筛选
实验设计:局部化脓性炎症病原菌的分离鉴定及敏感药物筛选小组成员：范子文孙琦黄必胜雍之瑶【实验病例】刘正春，男，38岁，建筑工人，上班时被石头砸断了胳膊，由于长时间不接受正规治疗，他的胳膊上的伤口感染开始化脓，发热1天，伤口肿胀疼痛体检：体温39℃，伤口局部红肿，有黄色粘稠脓汁血象：血白细胞12x109/L，中性粒细胞80%，淋巴细胞28%。
要求：1 脓汁标本病原菌的分离和鉴定；2 选择敏感抗生素治疗【实验目的】掌握病原菌的分离和鉴定，掌握化脓性细菌的主要特点选择合理的敏感抗生素进行治疗【设计思路】球菌是细菌中的一个大类，根据格兰染色的不同，可分为革兰阳性和革兰阴性两类。
阳性：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌、肠球菌等阴性：脑膜炎球菌、淋球菌等病原性球菌中常引起人类化脓性疾病的细菌，又称为化脓性球菌。
上述细菌均为化脓性球菌，它们形态、培养上各有特点，可供鉴别。
所可能用到的检查方法：染色镜检、分离培养、生化反应、血清学实验、动物接种。
所以，我们小组的实验设计即围绕取样，检查，确定，选用抗生素治疗的主线流程，结合上述检查方法，最终确定出引起患者化脓的致病菌并治疗。
【初步观察】在病例中，患者的明显体征为伤口局部红肿，有黄色粘稠脓汁，根据金黄色葡萄球菌的致病特点，在发生局部感染时，皮肤化脓感染的特点是脓汁粘稠，病灶局限，界限清楚。
其中患者黄色粘稠脓汁与此特征相符，初步怀疑为金黄色葡萄球菌，需要进一步检验。
肺炎球菌多导致呼吸道炎症，大叶性肺炎，与胳膊外伤无关，可排除。
肠球菌所致感染中常见的为心血管系统感染和尿路感染，可以排除。
脑膜炎球菌主要有呼吸道感染转变为菌血症或者败血症，可以排除。
淋球菌引起人类泌尿生殖系统急慢性化脓性感染，可以排除。
所以实验的目的为分辨引起患者伤口化脓的细菌是葡萄球菌还是链球菌，或者二者兼有。
【标本采集】在本病例中，患者为伤口感染化脓，即开放性脓肿，所以我们采取标本的方法为：用无菌棉拭采取脓液及病灶深部分分泌物。
血液标本中常见化脓性球菌的分离培养与鉴定一
会引起感染，如心内膜炎和血流感染等。
03
分离培养与鉴定
表皮葡萄球菌在血平板上形成圆形、表面干燥、凸起、灰白色至棕色的
菌落。通过染色镜检和生化试验可对表皮葡萄球菌进行鉴定。
溶血葡萄球菌
生物学特性
溶血葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，直径约1μm，常呈双排列。在固体培养基上生长的菌落直径约1mm，圆形、不透明， 边缘整齐，表面光滑、湿润、凸起、无色。
致病性
金黄色葡萄球菌是人类化脓感染中最常见的病原菌，可引起局部化脓感染，也可引起肺炎 、伪膜性肠炎、心包炎等，甚至败血症、脓毒症等全身感染。
分离培养与鉴定
金黄色葡萄球菌在血平板上形成圆形、表面光滑、湿润、凸起、不透明的菌落，菌落周围 可形成完全透明的溶血环。通过染色镜检和生化试验可对金黄色葡萄球菌进行鉴定。
接种工具
使用无菌接种环或针头将血液标 本接种到培养基上。
接种方法
将血液标本均匀涂布在培养基表面， 或用划线法接种，以促进菌落的生 长。
防止交叉污染
在接种过程中，要严格遵守无菌操 作规程，避免交叉污染。
培养条件
温度
化脓性球菌的生长需要适宜的温 度，一般为35-37℃。
湿度
保持培养箱内的湿度，以防止培 养基干燥。
致病性
溶血葡萄球菌可引起人类和动物感染，如尿道炎、前列腺炎、伤口感染和心内膜炎等。其致病力可能与产生毒素和其 他毒力因子有关。
分离培养与鉴定
溶血葡萄球菌在血平板上形成圆形、表面光滑、湿润、凸起、无色的菌落，菌落周围可形成完全透明的 溶血环。通过染色镜检和生化试验可对溶血葡萄球菌进行鉴定。
06
血液标本中化脓性球菌的感 染与防治
血液标本中化脓性球菌的分离培养与鉴定是临床微生物学实验室的重要工作之一 ，对于及时诊断、治疗和预防疾病具有重要意义。
脓汁中球菌的分离与鉴定.ppt
甲型溶血 性链球菌
乙型溶血 性链球菌
丙型链球 菌
溶血现象 α溶血
溶血环的 特点血
2-4mm， 完全透明
致病强
无
无
无
甲链
乙链
丙链
肺炎双球菌
生物学性状：
G+ 双球菌,菌体呈矛头状 ,宽端
相对,尖端向外.有荚膜. 营养要求高,在含有血液或血
清的培养基中才能生长 最适温度为37度,最适pH为
7.4-7.8.
• 在 血琼脂平板上,菌落呈圆形稍扁,灰白色, 细小,半透明,直径0.5-1.5mm.α溶血环, 与甲型溶血性链球菌相似,孵育时间>48h, 菌落中央呈脐状下陷.
脑膜炎双球菌
生物学性状:
G肾形或豆形双球菌,两菌接触
面平坦或稍向内陷.
营养要求高,需在含有血清, 血液的培养基中才能生长.
• 2) 沙门菌和志贺菌只发酵葡萄糖,不发酵乳糖,分 解葡萄糖产的酸使培养基pH下降,酚红指示剂变
黄,但是培养基中的葡萄糖仅有0.1%,在斜面的
酸性物质被氧化成挥发性酸,且细菌氧化氨基酸 物质产生的氨的中和作用,是斜面变红,而底层则 为黄色.
双糖铁培养基的用途
• 用于观察细菌是否产生硫化氢及对糖的发 酵能力.
• 菌落特点: • 圆形,无色,半透明,中等大小
(四)常见培养基的特性
血琼脂平板
• 在普通琼脂培养基的 基础上加入血液制备 而成,是最常用的营养 培养基,可供营养要求 较高的细菌生长.
• 常用于分离培养和溶 血现象观察.
SS培养基
• 含有胆酸盐抑制G+, 枸橼酸钠和煌绿能部 分抑制大肠杆菌,致病 的沙门菌和志贺菌能 大量生长.
• 含有中性红指示剂和 乳糖,中性红遇酸变粉 红.
微生物病原性球菌实验设计
脓汁标本中病原性球菌的鉴定实验目的：1 、掌握病原性球菌的形态和培养特性。
2 、熟悉病原性球菌的分离和鉴定程序。
实验材料：（1）标本：脓汁（2）培养基：血琼脂平板、液体培养基（3）其他：试管、载玻片、酒精灯、接种环等实验方法（1）化脓性球菌常用标本：化脓部位脓液或分泌物、痰液、咽镊子、血液、脑脊液、泌尿道分泌液。
根据病变部位，无菌采集，并置于无菌容器中。
（2）分离程序1）用无菌接种环取材料少许，拇指推开皿盖。
2）在点燃的酒精灯附近操作。
先平行划线拇指端和食指端平皿直径的三分之一，旋转平皿90度，接种环灭菌，此为第一区。
用无菌接种环从第一区带出细菌作为第二区的开始，再连续划线，大约划平皿面积的四分之一，再次灭菌接种环，再旋转90度，此区为第二区。
第三区方法同第二区。
第三区与第四区之间，接种环不灭菌直接划线划满平皿其他区域。
3）在平皿底部用玻璃铅笔注明班级、姓名、日期等信息。
置于37摄氏度温箱，皿底向上，培养18到24小时，备用。
4）待血琼脂平板第四区上出现菌落，用无菌接种环挑取平皿中菌落在点燃的酒精灯附近接种在液体培养基，用于增菌并编号。
5) 试管上用玻璃铅笔注明班级、姓名、日期等信息。
置于37摄氏度温箱，皿底向上，培养18到24小时，备用。
（3）鉴定程序1）取各液体培养基中的菌液经过涂片→干燥→固定→染色（HE）→显微镜观察。
根据染色结果分为：紫色的革兰染色阳性菌：葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌红色的革兰染色阴性菌：淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌2）对革兰染色阳性菌（葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌）进行溶血实验。
根据结果分为：完全透明溶血环：葡萄球菌、链球菌草绿色溶血环：肺炎链球菌3）对出现完全透明溶血环的细菌做过氧化氢酶实验，根据结果分为：阳性：葡萄球菌阴性：链球菌4）对革兰染色阳性菌（淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌）进行分解麦芽糖实验，根据结果分为：不分解麦芽糖：淋病奈瑟菌分解麦芽糖产酸不产气：脑膜炎奈瑟菌（4）确诊程序根据鉴定程序得出的初步诊断，再进行确诊1）葡萄球菌的确诊①血浆凝固酶试验，鉴定致病性葡萄球菌②耐热核酸酶试验，用于检测金黄色葡萄球菌产生的耐热核酸酶③甘露醇发酵试验，金黄色葡萄球菌可发酵甘露醇，该试验为阳性2）链球菌的确诊①杆菌肽试验敏感试验，出现抑菌环者即可初步鉴定为A群链球菌②胆盐溶菌试验，肺炎链球菌阳性，草绿色链球菌阴性③血清学鉴定试验，检测链球菌群的特异性抗原，出现凝集者为阳性3）肺炎链球菌的确诊①荚膜肿胀试验，呈现阳性则为肺炎链球菌②菊糖发酵实验，肺炎链球菌可以发酵菊糖③胆盐溶菌试验，肺炎链球菌阳性4）淋病奈瑟菌的确诊①革兰染色后镜检若发现中性粒细胞内有革兰阴性双球菌5）脑膜炎奈瑟菌的确诊①分解葡萄糖、麦芽糖、产生少量酸②氧化酶试验阳性③血清凝集试验阳性鉴定图解。
化脓性球菌分离鉴别的流程
化脓性球菌分离鉴别的流程英文回答：Identification of Pus-Forming Cocci.The identification of pus-forming cocci, such as Staphylococcus and Streptococcus species, is essential for appropriate antibiotic therapy and infection control measures. The following steps outline a general procedure for their identification:1. Specimen Collection: Collect specimens from the infected site, such as wound swabs, blood, or sputum.2. Gram Staining: Perform Gram staining on the specimen to determine the morphology and staining characteristics of the bacteria. Pus-forming cocci are typically Gram-positive and appear as cocci (round or oval cells).3. Colonial Morphology: Culture the specimen onappropriate media, such as blood agar or chocolate agar, and observe the colony morphology. Staphylococcus species often form colonies that are round, opaque, and golden or white in color, while Streptococcus species tend to form colonies that are beta-hemolytic, meaning they cause a clear zone of hemolysis around the colonies.4. Catalase Test: Differentiate between Staphylococcus and Streptococcus species using the catalase test. Staphylococcus species produce the enzyme catalase, which breaks down hydrogen peroxide into water and oxygen, creating bubbles during the test. Streptococcus species do not produce catalase and therefore do not elicit a positive result.5. Coagulase Test: Further differentiate Staphylococcus species using the coagulase test. Staphylococcus aureus, a common pathogen, produces the enzyme coagulase, which converts fibrinogen into fibrin, causing clot formation in the test. Other coagulase-negative Staphylococcus species do not produce this enzyme.6. Hemolysis Test: Determine the hemolytic propertiesof Streptococcus species on blood agar plates. Beta-hemolytic Streptococcus species cause a clear zone of hemolysis around the colonies, while alpha-hemolyticspecies produce a greenish zone of hemolysis, and non-hemolytic species do not cause any hemolysis.7. Lancefield Grouping: Further differentiate Streptococcus species based on their Lancefield group antigens. This involves using specific antibodies to determine the group (A, B, C, D, etc.) to which the Streptococcus species belongs.8. Antibiotic Susceptibility Testing: Performantibiotic susceptibility testing to determine the appropriate antimicrobial agents for treating the infection.中文回答：化脓性球菌分离鉴别流程。
化脓性球菌
.
3
化脓性球菌：因病原性球菌主要引起化脓 性炎症 主要包括：
革兰阳性菌：葡萄球菌，链球菌，肺炎链球菌 革兰阴性菌：脑膜炎奈瑟菌，淋病奈瑟菌
.
4
一、葡萄球菌属 (staphylococcus)
是最常见的化脓性球菌
.
5
概述： 分布广泛
医院内交叉感染的重要传染态与染色： 球形，葡萄串状，革兰染色阳性 （G+），无鞭毛，无芽孢，幼龄培养物可见荚膜。
③链道酶：降解脓汁中具有高度粘稠性的DNA--脓汁稀薄，利于扩散
.
43
2、所致疾病：
（1）乙型溶血性链球菌
，淋巴管炎 化脓性感染 蜂窝组织炎，
扁桃体炎等
中毒性疾病 猩红热
超敏反应性疾病 风湿热 急性肾小球肾炎
.
44
• （2）、其他链球菌： • 甲型溶链：常引起亚急性细菌性心内膜
炎。
• 变形链球菌：与齿菌斑的形成有关。 • B族链球菌：易引起新生儿感染。 • D族链球菌：常引起尿路、腹部、心内膜
1. 链球菌呈球形，G+，链状排列； 2. 营养要求较高，血平板上为灰白色的微小
菌落，致病菌株有β溶血现象； 3. 主要致病物质为外毒素和侵袭酶； 4. 主要引起人类各种化脓性炎症。
.
49
三、肺炎链球菌
（一）生物学特性
1、形态与染色：
革兰染色阳性，双球菌矛头 状，平面相对，尖面相背。有厚 荚膜，无芽胞，无鞭毛。 2、培养特性
金黄色葡萄球菌（S.aureus）：金黄色 表皮葡萄球菌（S.epidermidis）：白色 腐生葡萄球菌（S.saprophyticus）：柠檬色
2．根据凝固酶： 凝固酶阳性菌株 凝固酶阴性菌株
化脓菌分离鉴定过程
系统实验报告（报告三） 化脓菌/肠道菌分离鉴定过程 目的 策略（原理设计） 方法步骤：简单写 结果（判定方法） 结论
协同因子
纤维蛋白原
Tube coagulase Test
＋
－
The Slide Coagulase Test
细菌的药物敏感性试验
纸片扩散法（K-B法）
肠道菌分离鉴定过程（三）
Antigens of salmonella
O antigen polysaccharide of LPS used to divide Salmonella to 42 groups （A－Z，O51－63，O65－67） A-E groups are pathogenic H antigen flagella antigen divide Salmonella tow phase: special no special Vi antigen related to the virulence of Salmonella sensitive to heat ( lose activity at 60℃)
React with anti-Vi antiserum
Agglutination reaction
(＋) (－)
Identify its group and phage
化脓菌分离鉴定过程（三）
化脓菌分离鉴定过程
葡萄球菌 甘露醇发酵试验 试验
Inoculate the bacteria into a mannitol micro-tube Incubate at 37℃ for 18h. S.aureus will ferment mannitol to produce acid, which causes the medium to turn yellow.
化脓性球菌的分离鉴定
葡萄球菌的鉴定
• ii.SPA菌诊断液的制备即将上述稳定液与已知的抗血清结合。 1) 取10%SPA菌稳定液1ml，离心弃上清，再用PBS洗菌体一次，并加PBS至
1.2 固体培养基菌落性状观察 在营养琼脂平板上，葡萄球菌菌落性状：菌落直径1~2mm，
圆形、凸起、边缘整齐，表面光滑、湿润、不透明的菌落。根据 其产生的色素不同，可分为：金黄色葡萄球菌—菌落金黄色，表 皮葡萄球菌——菌落呈白色或柠檬黄色（含白色葡萄球菌，柠檬 色葡萄球菌）
在血平板上，金黄色葡萄球菌菌落呈金黄色且周围可形成完 全透明的溶血圈（β溶血）；而白色、柠檬色葡萄球菌菌落周围则 无溶血圈。
用生理盐水以适当比例稀释脓汁，以平板划线分离培养 法分别接种在血平板及营养琼脂平板上，在37℃恒温培养 箱中培养过夜；次日，观察营养琼脂平板及血平板上菌落 性状，并挑单克隆菌落至营养肉汤培养基中培养18~24h；
3.革兰染色
取洁净玻片一张，在玻片中央滴一小滴菌液，均匀涂布、 自然干燥并固定后进行革兰染色（或直接取脓性分泌物涂 片染色镜检）
1ml，悬浮菌体，然后加沙门氏菌AFO多价血清0.1ml，(注：血清预先放56℃水浴加 热30min，进行灭活处理)。SPA菌和血清充分摇匀，放37℃水浴中作用30min，此间 应不断振摇，以保持菌体呈悬浮状态，以利于菌体与IgG结合。
2) 将与抗体结合后的SPA菌液以3 000 r/min的转速离心15min，弃上清，并用 PBS悬浮菌体洗离2次，以洗去未给合的剩余血清，最终加含0.05%～0.1%NaN3的缓 冲盐水10ml。这种菌悬液即为1%标记的SPA菌诊断液。 • 在制备稳定液、诊断液的过程中，应同时作不含A蛋白的葡萄球菌及含A蛋白葡萄
实验3化脓性球菌的分离鉴定
[ 教学目标 ]
了解：各种消毒灭菌的方法及应用 无菌操作技术
掌握： 1.化脓性球菌分离鉴定的方法和步骤 2.紫外线杀菌的原理 3.抗生素敏感实验的方法
[ 重点难点 ]
重点：化脓性球菌分离鉴定 ——接种血平板 难点：化脓性球菌分离鉴定 ——接种血平板
消毒与灭菌
概念：
? 消毒( disinfection): 杀死物体上病原微生物，并 不一定能杀死含芽孢的细菌和非病原微生物。用 以消毒的药品称为消毒剂。
药敏试验的常用方法： 纸片法
操作：
敏感金葡
贴纸片
结果分析：
如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈形 成，敏感度越高抑菌圈直径越大：
>20mm ： 极度敏感 15-20mm ：度敏感 <10mm: 不敏感 无抑菌圈：耐药
三、化脓性球菌分离鉴定（一）
成对排列
操作：
1. 接种血平板（ 1块/人） 三线法接种分离单个菌落
思考题
1. 临床上耐药性菌株感染，如何确定其治疗用药？ 2. 抗生素耐药性实验的结果是如何判定？
高压蒸汽灭菌法：
高压蒸汽灭菌法的杀菌效果最好，运用广泛。
优点： 1.能够达到较高的温度。 2.穿透力强。 3.蒸气遇冷物凝成水时可放出汽化热， 迅速提高冷物的温度。 4.高压蒸气不会使物品过分潮湿，避 免了水煮的缺点。
化脓菌分离鉴定过程肠道菌分离鉴定过程
• 中等大小（1～2mm）、表面光滑、边缘整齐、 不透明、有溶血环、产生金黄色色素或白色色素
• 乙型溶血性链球菌
• 菌落较小（0.5～0.75mm）、灰白色、表面光滑、 有光泽、有清晰透明溶血环
• 甲型溶血性链球菌/肺炎链球菌
• 细小菌落周围产生草绿色溶血环。
纯培养（Pure culture）
Gram-stain
Morphological characteristics
葡萄球菌－球形，呈葡萄串状排列 链球菌－链状排列 肺炎链球菌－矛头状，成双排列，尖端向外
Staphylococci are Gram-positive cocci, typically arranged in clumps or Grape-like clusters
Isolation and culture
Cultural • Specimens planted on blood agar plates give rise to typical colonies in 18h at 37℃
l characteristics
Experiment Two
化脓菌分离鉴定过程（二） 肠道菌分离鉴定过程（二）
化脓菌分离鉴定过程
Objective 掌握从临床标本中分离和鉴定化脓性球 菌的原则和方法。 辅助临床诊断及指导临床用药。
Identified method for pyogenic cocci Gram-stain Isolation and culture Pure culture Direct identification The antibiotic susceptibility test
革兰染色
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微生物学实验三
化脓性球菌的分离鉴定
（综合性试验） 微生物学教研室 郭棵棵
实验内容
录像：消毒灭菌 操作： 1. 紫外线杀菌实验（普通平板 1块/3人） 2. 抗生素敏感试验（普通平板 1块/3人） 3. 化脓性球菌分离鉴定（一）—— 接种血平板 材料：
1. 2. 3. 4. 抗生素纸片（青霉素、链霉素、庆大霉素、黄连素 1套/6人） 大肠杆菌、敏感金葡菌（1支/6人） 脓汁标本（乙型链球菌、致病性金葡菌 各1支/6人） 普通平板、血平板、黑纸片等
压力为15磅/寸2，30分钟可杀死一切芽胞，达到灭菌的目的。 （温度可达121℃ )
注意事项：
1. 高压的整个过程必须有专人守侯，并随时排气以 防压力表显示错误及其它原因引起高压锅内压力 剧增而导致爆炸。 2. 高压完毕需等待高压锅内压力降低至零时方可打 开取物。
紫外线杀菌原理:
波长200-300nm的紫外线具有杀菌作用，其中 以265-266nm最强，这与DNA的吸收光谱范围一致。 紫外线主要作用于DNA，使一条DNA链上相邻的两个 胸腺嘧啶共价结合而形成双聚体，从而改变DNA的 分子构型，干扰DNA的复制与转录，导致细菌的死 亡或变异。
操作：
敏感金葡
贴纸片
结果分析：
如果细菌对药物敏感，则在药片周围有抑菌圈 形成，敏感度越高抑菌圈直径越大： >20mm： 极度敏感 15-20mm： 中度敏感 抑菌圈直径 10-15mm： 轻度敏感
<10mm:
不敏感
无抑菌圈：耐药
三、化脓性球菌分离鉴定（一）
化脓性炎症是临床上常见病，除了病原性球 菌外，其他微生物也可以引起化脓性感染。
灭菌(sterilization):杀灭物体上所有微生物的 方法。
防腐(antisepsis):防止或抑制细菌生长繁殖的方法， 细菌一般不死亡。同一种化学药品在高浓度时称 为消毒剂，低浓度时为防腐剂。
无菌(asepsis):不含活菌的意思。防止细菌进入人 体或其他物品的操作技术，称无菌操作。
7. 注意操作中始终保持无菌操作
紫外线杀菌实验操作
划线、盖纸、照射
电离辐射
β射线和γ射线； 产生自由基或毒性基团，干扰DNA合成,导 致酶系统功能紊乱等; γ射线有较高穿透力； 常用于一次性医用塑料制品的消毒；也用 于食品消毒，不破坏其营养成分。
滤过除菌：
物理阻留；
用于不耐高温的血清、
物理消毒灭菌法：
干热灭菌法：焚烧、烧灼、干烤（170℃/2h） 热力灭菌法 湿热灭菌法：巴氏消毒法、流动蒸汽消毒法、 煮沸法、间歇蒸汽灭菌法、高压蒸汽灭菌法 紫外线 电磁波辐射杀菌法 电离辐射 滤过除菌法 超声波杀菌 干燥
化学消毒灭菌法：使用消毒剂
原理：
1.使菌体蛋白质变性或凝固：酚类、醇类、重金属 盐等。如石炭酸、来苏、洗必泰 2.干扰细菌的酶系统和代谢：氧化剂，如过氧化氢，
注意事项:
1.穿透力弱，一般玻璃、纸、布、尘埃、水 蒸气均能阻挡。
2.适用于空气、物体表面的消毒。
3.有效距离在2米左右（紫外灯的安装）
4.紫外线对人的眼睛、皮肤有损害作用。
操作步骤：
1. 取普通平板（1块/3人）
2. 取大肠杆菌斜面培养物在平板上密集划线
3. 用灭菌镊子取无菌黑纸片夹放到平板正中 4. 将平板放到紫外线下照射30分钟 5. 放37℃孵箱培养 6. 观察结果
常见的标本有脓汁、咽拭子、痰、血液、脑
脊液等。 本次实验是以脓汁标本进行病原性球菌的分 离鉴定
化脓性球菌分离鉴定步骤
37℃ 接种 血平板 脓汁 菌落 划线法 24h
革兰染色
葡萄状排列 链状操作：
1. 接种血平板（1块/人） 三线法接种分离单个菌落
思考题
1. 临床上耐药性菌株感染，如何确定其治疗用药？ 2. 抗生素耐药性实验的结果是如何判定？
高压蒸汽灭菌法：
高压蒸汽灭菌法的杀菌效果最好，运用广泛。 优点：1.能够达到较高的温度。 2.穿透力强。 3.蒸气遇冷物凝成水时可放出汽化热， 迅速提高冷物的温度。 4.高压蒸气不会使物品过分潮湿，避 免了水煮的缺点。
[ 教学目标 ]
了解：各种消毒灭菌的方法及应用 无菌操作技术 掌握：1.化脓性球菌分离鉴定的方法和步骤 2.紫外线杀菌的原理 3.抗生素敏感实验的方法
[ 重点难点 ]
重点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板 难点：化脓性球菌分离鉴定——接种血平板
消毒与灭菌
概念：
消毒( disinfection):杀死物体上病原微生物， 并不一定能杀死含芽孢的细菌和非病原微生物。 用以消毒的药品称为消毒剂。
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抗生素、药液等的除菌。
高锰酸钾，过氧乙酸等
3.损伤细菌细胞膜：表面活性剂，如新洁尔灭
二、抗生素敏感试验
随着抗生素的广泛应用，耐药变异菌株日益 增加（尤其是金葡、肠道杆菌），给医疗工作带 来了不少的困难。
为正确使用抗生素，临床上常在分离致病细 菌的同时做药物敏感试验，以了解该细菌对常用 各种抗生素的敏感性。 药敏试验的常用方法：纸片法