免疫检测技术基本原理
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特点：敏感、特异、快速，能定 性、定量、定位。
免疫标记技术
• 酶免疫标记技术 • 荧光免疫分析技术 • 放射免疫分析技术 • 免疫金标记技术
酶联免疫吸附试验
• 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann, 荷兰学者Van Weerman和Schuurs分 别报道将免疫技术发展为检测体液中微量 物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸 附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)
酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
酶
底物
显色 测定波长
反应
辣根过氧化物酶 邻苯二胺
橘红色 492
四甲替联苯胺
β-Ｄ－半乳糖 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)
苷酶
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
荧光 黄色
360,450 420
• 2、标记方法 • 戊二醛交联法 • 过碘酸盐氧化法
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶 抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
例：乳胶凝集抑制试验检测HCG (妊娠诊断)
已知抗体
待检标本
＋
步骤1：将已知抗体 与待检标本混匀
抗原吸附 乳胶颗粒
＋
步骤2：加入抗原 吸附的乳胶颗粒混 匀
结果判断：
不凝集为 阳性结果
凝集反应
2.沉淀反应
概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出 现沉淀物称沉淀反应。
类型： ★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳 ★免疫比浊法
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
第三节免疫检测技术的基本原理
• 抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原 检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未 知的抗原 .
• 将免疫反应与现代测试技术结合 • 超微量的检测
免疫学检测技术的优点
• 高度的灵敏性 • 高度的特异性
免疫分析技术的应用
• 常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术
2.间接凝集法
➢ 先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上 (如RBC, 乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗 原反应，出现凝集为阳性结果。
➢ 临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试 验等。
待检样品
抗原吸附血球 或乳胶颗粒
反应凝集物
+wenku.baidu.com
→
3.间接凝集抑制试验
➢ 先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知 抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
分别洗涤 除去未结合
的成分
对照管由于只加酶标抗原，与固 相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则随待测抗原和酶 标抗原与固相抗体竞争结合的结果而 异。如待测抗原量多，竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合，使固相上 结合的酶标抗原量减少。因此，加入 底物后显色反应较弱。
单向琼脂扩散试验
双向琼脂扩散试验
对流免疫电泳
免疫比浊法原理
抗体 抗原
免疫复合物的 浓度与透射光 的衰减呈正相 关
测吸光度 计算抗原 或抗体的 含量
3.中和反应 如抗“O”试验
4.免疫标记技术
概念：用荧光素、酶、同位素等 标记抗体或抗原用以测定相应抗原或 抗体的技术称为免疫标记技术。常用 方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、 放射免疫检测技术等。
凝集试验
➢概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗 体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物， 称为凝集反应。
1.直接凝集反应 ➢抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳
性结果。 ➢①玻片直接凝集法：定性试验 ➢②试管直接凝集法：半定量试验
玻片直接凝集试验
+
试管法半定量试验
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法
间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法)
包被固相载体: 用已知抗原包被
O O
N
抗体
H2O
O O
N
OH
OH
抗体
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析
2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
用已知特异性 抗体包被 固相载体
黄色 460
氨基水杨酸
棕色 449
邻联苯甲胺
兰色 425
2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 蓝绿色 642
唑啉磺酸-6)铵盐
碱性磷酸酯酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
黄色 400 红色 500
葡萄糖氧化酶
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
黄色 405 深蓝色 420
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
O
抗体
Schiff碱
免疫标记技术
• 酶免疫标记技术 • 荧光免疫分析技术 • 放射免疫分析技术 • 免疫金标记技术
酶联免疫吸附试验
• 1971年瑞典学者Engvail和Perlmann, 荷兰学者Van Weerman和Schuurs分 别报道将免疫技术发展为检测体液中微量 物质的固相免疫测定方法，即酶联免疫吸 附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay , ELISA)
酶及其底物
酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原 在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败 的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的 免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物 放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ， 将得到不同的颜色反应.
酶
底物
显色 测定波长
反应
辣根过氧化物酶 邻苯二胺
橘红色 492
四甲替联苯胺
β-Ｄ－半乳糖 甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)
苷酶
硝基酚半乳糖苷(ONPG)
荧光 黄色
360,450 420
• 2、标记方法 • 戊二醛交联法 • 过碘酸盐氧化法
戊二醛交联法 (一步法）
抗体-NH2 + COH-（CH2）3-COH + NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶 抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-抗体 酶-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
例：乳胶凝集抑制试验检测HCG (妊娠诊断)
已知抗体
待检标本
＋
步骤1：将已知抗体 与待检标本混匀
抗原吸附 乳胶颗粒
＋
步骤2：加入抗原 吸附的乳胶颗粒混 匀
结果判断：
不凝集为 阳性结果
凝集反应
2.沉淀反应
概念：可溶性抗原与相应抗体结合后出 现沉淀物称沉淀反应。
类型： ★单向免疫扩散 ★双向免疫扩散 ★对流免疫电泳 ★免疫比浊法
（一）双抗体夹心法
此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原
获得待分析物的未标定抗体
将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体
加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点
洗涤除去未结合的 抗体及杂质
洗涤并除去未结合的封闭蛋白
加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物
加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体
第三节免疫检测技术的基本原理
• 抗原、抗体反应的原理，利用已知的抗原 检测未知的抗体或利用已知的抗体检测未 知的抗原 .
• 将免疫反应与现代测试技术结合 • 超微量的检测
免疫学检测技术的优点
• 高度的灵敏性 • 高度的特异性
免疫分析技术的应用
• 常用的诊断技术 血凝试验 酶联免疫吸附试验 胶体金免疫技术 放射免疫分析技术
2.间接凝集法
➢ 先将可溶性抗原或抗体吸附在颗粒载体上 (如RBC, 乳胶颗粒)，再与相应抗体或抗 原反应，出现凝集为阳性结果。
➢ 临床常用的有间接血凝试验、乳胶凝集试 验等。
待检样品
抗原吸附血球 或乳胶颗粒
反应凝集物
+wenku.baidu.com
→
3.间接凝集抑制试验
➢ 先将待检抗原与已知的抗体反应，再加入用已知 抗原吸附的载体颗粒，不出现凝集为阳性结果。
测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与
固相抗体竞争结合
对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合
加底物显色
分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比，
计算标本中待测抗原含量
分别洗涤 除去未结合
的成分
对照管由于只加酶标抗原，与固 相抗体充分结合，故分解底物显色深； 测定管的显色程度则随待测抗原和酶 标抗原与固相抗体竞争结合的结果而 异。如待测抗原量多，竞争性地抑制 酶标抗原与固相抗体结合，使固相上 结合的酶标抗原量减少。因此，加入 底物后显色反应较弱。
单向琼脂扩散试验
双向琼脂扩散试验
对流免疫电泳
免疫比浊法原理
抗体 抗原
免疫复合物的 浓度与透射光 的衰减呈正相 关
测吸光度 计算抗原 或抗体的 含量
3.中和反应 如抗“O”试验
4.免疫标记技术
概念：用荧光素、酶、同位素等 标记抗体或抗原用以测定相应抗原或 抗体的技术称为免疫标记技术。常用 方法有免疫荧光技术、酶免疫技术、 放射免疫检测技术等。
凝集试验
➢概念：颗粒性抗原(细菌、红细胞等)与相应抗 体结合，在一定条件下出现肉眼可见的凝集物， 称为凝集反应。
1.直接凝集反应 ➢抗原与抗体直接混合作用，出现凝集为阳
性结果。 ➢①玻片直接凝集法：定性试验 ➢②试管直接凝集法：半定量试验
玻片直接凝集试验
+
试管法半定量试验
1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 1/128 1/256 1/512
的复合物
洗涤除去其他 未结合的物质
彻底洗涤 未结合的 酶标抗体
加底物进行 酶催化反应
根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定
（二）间接法
间接法是检 测抗体最常用的方 法，其原理为利用 酶标记的抗抗体以 检测已与固相结合 的受检抗体，故称 为间接法。
酶联免疫吸附试验(ELISA-间接法)
包被固相载体: 用已知抗原包被
O O
N
抗体
H2O
O O
N
OH
OH
抗体
标记免疫物的分离与鉴定
1、分离 目的：去除游离酶 方法：盐析、柱层析
2、鉴定 抗体活性 酶活性 标记物纯度
ELISA的种类和变化
（一）双抗体夹心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA
固相载体
加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合
洗涤，除去无关的物质
加底物 显色
根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定
加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体
（三）竞争法
此法可用于抗原和半抗原的定 量测定，也可用于测定抗体 。
用已知特异性 抗体包被 固相载体
黄色 460
氨基水杨酸
棕色 449
邻联苯甲胺
兰色 425
2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻 蓝绿色 642
唑啉磺酸-6)铵盐
碱性磷酸酯酶
4-硝基酚磷酸盐(PNP) 萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐
黄色 400 红色 500
葡萄糖氧化酶
ABTS+HRP+葡萄糖 葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰
黄色 405 深蓝色 420
戊二醛交联法（二步法）
COH-（CH2）3-COH + NH2-酶 抗体-NH2 + CHO-（CH2）3-CH = NH2-酶
抗体-NH2 =CH-（CH2）3-CH = NH2-酶
过碘酸盐氧化法
O O
NaIO4
酶-五炭糖环
O O
O
O
+ NH2抗体
O NaBH4 O
OH N
O
抗体
Schiff碱