纤维素分解菌培养基
纤维素分解细菌的分离和鉴定
纤维素分解细菌的分离和鉴定一．实验目的：1.研究低温环境下纤维素降解细菌的分离与鉴定．2.采用低温培养的方法从秸秆堆肥中筛选出3株分解纤维素的细茵。
3.通过PCR克隆这3株茵的16s rDNA并与相似菌株做比对．进一步构建分子进化树．来研究其分类情况。
4.综合其个体形态、茵落形态、生理生化特征、16S rDNA发育树构建结果等分类依据。
二．实验原理：细菌进行化能异养、短杆状、无出芽分裂、好氧、革兰氏染色阴性．无芽孢、无丝状菌体、有细胞壁且能独立生存。
应为其第二部分滑动细菌或第七部分的假单胞菌类。
由于滑动细菌能在“固体表面和汽一水交界面缓慢滑动”，故其固体菌落边缘应不整齐，且其一般形成亮色肉眼可见的子实体。
将灭菌的滤纸蘸取无菌生理盐水后贴在已凝固的平板上，用接种环蘸取土样，点样在平板滤纸上，15℃下培养10 d。
用接种环从有滤纸水解透明圈的单菌落处刮取细菌，在贴有滤纸的初筛平板上划线，计数并且观察。
三、实验仪器：1、材料试验材料为背阴处长时间堆放的秸秆堆肥表层；2、培养基：初筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基”。
：啦嘞1．00 g，MgS04·7H20 0．30 g，NaCl 0．10 g，F'eCl3O．0l g，NaN03 2．50 g，CaCi2 0．10 g，琼脂18．00 g，蒸馏水l000lnl，pH值7．0～7．2．121℃灭菌20min。
无淀粉滤纸(浙江富阳纸厂)用浓度l％的醋酸浸泡一夜后用浓度2％的Na-2C03水溶液洗至中性，晾干备用。
把上述处理过的滤纸剪成直径约为8 ca的圆形滤纸片．放在干净的平皿中，用报纸包好．采用湿热的方法灭菌；3、复筛培养基。
浓缩10倍的赫奇逊固体无机盐培养基：啦P04 1．009，m．庐04‘7H200．309。
NaO 0．109．FeCl30．01g，NaN03 2．50 g．CaCl20．10g，羧甲基纤维素钠lO．00 g，琼脂18．00g，蒸馏水10130ml，pH值7．0—7．2，121℃灭菌20 min。
实验一 纤维素的微生物降解
实验一纤维素的微生物降解一、实验目的1、掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术；了解不同的微生物菌落在斜面上、半固体培养基和液体培养基中的生长特征；进一步熟练和掌握微生物无菌操作技术；掌握微生物培养方法。
2、了解纤维素分解的基本理论，并掌握有关纤维素好氧和厌氧分解的一些基本实验技术。
二、实验原理1、从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化2、常用的分离纯化方法：单细胞挑取法，稀释涂布平板法，稀释混合平板法，平板划线法等。
稀释涂布平板法的步骤：倒平板－制备土壤污水稀释液－涂布－培养－挑菌落；平板划线法的步骤：倒平板－标记培养基名称－划线。
3、测定纤维素分解酶，可观察其对提供的唯一碳源滤纸纤维的分解情况确定。
如果滤纸溃烂，说明有纤维素分解菌的作用。
4、纤维素分解微生物可根据需氧的与否分为两大类：好氧分解微生物和厌氧分解微生物。
三、实验材料1. 培养基A. 赫奇逊液固体培养基（好氧）：KH2PO4 1.0g，MgSO4٠7H2O 0.3g，FeCl3 0.01g，CaCl2 0.1g，NaNO3 2.5g，蒸馏水1000ml，pH值为7.2～7.3，0.1MPa灭菌20min。
B. 厌氧液体培养基：牛肉膏1.5g，蛋白胨2.5g，水1000ml，CaCO3 2.0g；0.1MPa 灭菌20min。
2. 器材A.近3mm粒度菜园土。
B.镊子，无淀粉滤纸，1ml和10ml无菌吸管，无菌水，天平。
3、土样：格物楼西，小树根部约10cm，地表覆盖较多枯叶、枯草，取土深度约15cm。
四、方法步骤1. 土粒法分离纤维素的好氧分解微生物⏹采土方式：在选好适当地点后，用小铲子除去表土，取离地面5～15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好、标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。
⏹将赫奇逊培养基趁热倒入培养皿，冷却后加直径近于培养皿的滤纸一张，用少量培养液润湿。
分解纤维素的微生物的分离知识点
分解纤维素的微生物的分离知识点纤维素是植物细胞壁的主要结构成分，通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起，其结合方式和程度对植物源食品的质地影响很大。
你知道纤维素的微生物怎么分离的吗?下面店铺给你分享分解纤维素的微生物的分离知识点，欢迎阅读。
分解纤维素的微生物的分离知识点一、纤维素与纤维素酶1.纤维素的化学组成含C、H、O三种元素，是一种多糖。
纤维素的基本组成单位是葡萄糖，人体内没有纤维素酶，所以人体不能直接以纤维素为能源物质，但土壤中有分解纤维素的微生物，最终把纤维素分解成葡萄糖释放到无机环境。
2.纤维素的分布棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素。
纤维素产生于植物的光合作用，地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨。
研究土壤中分解纤维素的微生物将给我们的生活带来很大变化。
3.纤维素酶的组分纤维素酶是一种复合酶，一般认为它至少包括C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶三种组分。
前两种酶使纤维素分解成纤维二糖，第三种酶将纤维二糖分解成葡萄糖。
二、纤维素分解菌的筛选1.方法刚果红染色法，常用的有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行颜色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红。
2.原理(1)含纤维素的培养基中加入的刚果红，可与纤维素形成红色复合物。
(2)当纤维素被纤维素酶分解后，形成的纤维二糖、葡萄糖不和刚果红发生这种反应，红色复合物就无法形成，培养基中出现以纤维素分解菌为中心的透明圈，可通过是否产生透明圈来筛选纤维素分解菌。
三、实验设计1.实验流程土壤取样→选择培养(此步可省略)→梯度稀释→将样品涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基上→挑选产生透明圈的菌落。
2.土壤取样采取土样时，可以选择富含纤维素的环境。
3.选择培养(1)目的：增加纤维素分解菌的浓度，确保能够从样品中分离得到所需要的微生物。
(2)操作方法：将土样加入装有30 mL选择培养基的锥形瓶中，将锥形瓶固定在摇床上，在一定温度下振荡培养1～2_d，直至培养液变混浊，也可重复选择培养。
纤维素菌分离和鉴定的方法
纤维素菌分离和鉴定的方法一、概述纤维素由于其特殊的生化性质，一直是微生物学和食品工业研究的关注焦点。
特别是纤维素的分解，除了传统的化学方法，生物法也是目前广泛采用的技术之一。
对纤维素酶活性和产酶微生物的分离和鉴定，是纤维素生物技术研究的重要内容。
纤维素分解酶是产生于微生物体内的一类酶，广泛存在于真菌和细菌中，可划分为纤维素酶和半纤维素酶两大类，规律的利用这些微生物菌种，开发新型的纤维素分解酶。
纤维素的微生物分解菌种较多，其中许多菌种能分泌出多种细胞外酶，如单糖的转化酶、纤维素酶、半纤维素酶、葡萄糖氧化酶、木糖酶、果糖酶和葡聚糖酶等。
多种新型有机物的产生依赖于工业生产中微生物的应用技术，目前各国纤维素降解的菌株和发酵产物分离和鉴定方法越来越多。
纤维素菌的分离可采用筛选、稀释和富集等方法。
实际应用中，常用的分离方法有：（一）厌氧富集法：根据纤维素菌能够在厌氧条件下进行生长和代谢的特点，采用富集培养方法，利用耐氧性微生物限制氧气的供应，引起产生厌氧性纤维素分解菌类，然后推广领域固定化、发酵和应用。
可根据繁殖时间将厌氧富集法分为短时间富集法和长时间富集法。
（二）筛选法：在纤维素富含的自然环境或人工培养环境中进行筛选。
先用一些微生物菌株做为预培养菌种，加入富含纤维素的培养基，通过短期采取接种、稀释、摇动等处理方式，寻找纤维素分解酶活力最高的培养物，然后进行分离纯化、性质鉴定。
（三）稀释法：将样品依一定比例进行稀释，将稀释后的液体均匀地均匀的加入纤维素培养基中，用深层培养的方式进行发酵，进行分离鉴定纯化。
稀释法适用于富含纤维素且菌株较多的培养基的菌群筛选。
（一）形态学特征鉴定法：根据菌株的形态学特征进行鉴定。
此方法是最基本也是最重要的鉴定方法之一。
菌株的形态学特征包括形状、结构、颜色和大小等，进一步对分离的菌株进行正确定义。
常用的形态学特征包括：形态特征、结构特征、色素特征和大肠杆菌。
（二）生理生化特征鉴定法：通过菌株的生长特性在不同培养基中的表现，或菌体在不同生长条件下表现的生化过程，如碳源利用情况，氮源利用情况，温度和pH值的影响等，进行鉴定。
分解纤维素的微生物的分离知识点
(2)①诱变组中菌落周围的透明圈与 对照组相比较大，说明诱变育种获 得了高纤维素酶产量的菌株②诱变 组中菌落周围的透明圈与对照组相 同，说明诱变育种没有使菌株发生 相关变化
③诱变组中菌落周围的透明圈与对照 组相比较小，说明诱变育种获得了低 纤维素酶产量的菌株
2、自养型微生物利用无机碳源， 异养型微生物利用有机碳源；
3、自养型微生物利用无机氮源，
异养型微生物可能利用无机氮源也可能利用有机氮源
4、有机碳源也是异养型微生物的主要能源
5一样（有机碳源）
8．有些微生物能合成纤维素酶，通过对这些微生物的研究和应用，使人们 能够利用秸秆等废弃物生产酒精，用纤维素酶处理服装面料等。纤维素酶可 以通过微生物发酵来生产，为了提高酶的产量，请你设计一个实验，利用诱 变育种的方法，获得产生纤维素酶较多的菌株。 (1)写出实验步骤：
①______________________________________________.
②制备含有___________的固体培养基。 ③
___________________________________________________________
______________.
④
_____________________________________________________
（一）微生物需要的营养物质及功能
微生物需要的五大类营养要素物质
碳源 氮源
生长因子
无机盐 水
生长因子
概念 微生物生长不可缺少的微量有机物 来源 酵母膏、蛋白胨、动植物组织的提取液 常见的生 长因子 维生素、氨基酸、碱基等
是否培养所有微生物的培养基中都需要 加生长因子？
研究纤维素降解菌的有关方案
纤维素降解菌的筛选及酶学性质的研究1.采样腐烂的苹果、蘑菇培养基及地面下10cm处土壤等2.富集培养(1)配制300ml 选择培养基。
(2)在250ml 锥形瓶中装入90ml 培养基（三瓶），放5-8 颗玻璃珠，塞上瓶塞，在121℃下高压蒸汽灭菌22min。
(3)每一份土样各取10g，在无菌条件下加入装有90ml 选择培养基的锥形瓶中，锥形瓶标上相应的标号。
(4)将瓶置于摇床上，在30℃下振荡（150rpm 左右）培养3-4d，至培养基变浑浊。
3.培养基1. 纤维素平板培养基CMC 20 g；KH2 PO4 2 g；ZnCl20.0017g ；MnSO40.0016g ；CoCl20.002 g ；MgSO4 ·7H2O 0.3 g ；(NH4)2 SO41.4 g ；CaCl20.3 g；FeSO4 0.0005g ；琼脂20 g；蒸馏水1000 mL；pH7.0-7.22. 刚果红纤维素鉴别培养基KNO32 g ；MgSO40.5 g ；KH2 PO41 g ；NaCl 1 g；Na2 HPO 41 g ；CMC-Na 20 g ；刚果红0.2 g ；琼脂20 g；蒸馏水1000 mL3. 液体发酵培养基蛋白胨3 g ；硫酸铵2 g ；酵母膏0.5 g ；KH2 PO4 4 g ；CaCl2 ·2H2O 0.3 g；MgSO4 .7H2O 0.3 g；Tween-80 0.2 mL；CMC 20 g；蒸馏水1000 mL4. 菌种保藏培养基（PDA）马铃薯200 g ；葡萄糖20 g ；琼脂15 g ；蒸馏水1000 mL ；pH自然5. 选择培养基CMC-Na5g，NaNO3 1g，KCl 0.5g，酵母膏0.5g，水解酪素0.5g。
将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml。
4.基本实验步骤1.纤维素降解菌的初筛称取样本10 g ，放入盛90 mL 无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶中，振摇约20 min ，使土样与水充分混合，将细胞分散，用一支无菌移液管从中吸取1 mL土壤悬液加入盛有9 mL无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌移液管从此试管中吸取1 mL加入另一盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、不同稀释度的土壤溶液。
纤维素分解菌的选择培养基中
• • • •
【 例 1】 微 生 物 体 内 能 够 使 纤 维 素 分 解 成 纤 维 二 糖 的 酶 是 ( )。 A．C1酶和Cx酶 B．C1酶和葡萄糖苷酶 C．Cx酶和葡萄糖苷酶 D．C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶 深度剖析 纤维素酶包括 C1 酶、 Cx 酶和葡萄糖苷酶，能将 纤维素分解为纤维二糖的是C1酶和Cx酶。 答案 A
土壤取样
1、本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
答：本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样成的菌悬 液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。 本课题通过选择培养，使纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择 培养基上。其他步骤基本一致.
2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
梯度稀释
按照课题1 的稀释操作方法，将选择培 养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数 到106
将样品涂布到鉴别纤维 素分解菌的培养基上
1、制备培养基:参照旁栏中的比例
2、涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各 取0.1ml涂布在培养基上，30℃倒置培养
挑选产生透 明圈的菌落
参照课本刚果红染色法，挑选产生透明 圈的菌落，一般即为分解纤维素的菌落
答：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分 解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通 环境。
③实例：树林中多年落叶形成的腐殖 土，多年积累的枯枝败叶等。 ④讨论:如果找不到合适的环境，可将 滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什 么作用？你认为滤纸应埋进土壤中多深？ 将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌 相对集中，实际上是人工设置纤维素分解 菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深 约10cm左右的土壤中。
2.3分解纤维素的微生物的分离的拓展
(三)、实验设计
土壤 选择 培养 梯度 将样品涂 布到鉴别 培养基 ①鉴别培养基 的特点? ②如何鉴别? 挑选 菌落 挑选什 么样的 菌落?
取样
稀释
什么 样的 环境 取样? 根据：微生物 对生存环境的 要求，到相应 环境中去找；
① 培养的目的? ②选择培养基的 特点?
目的：增加纤维素 分解菌的浓度，以 确保能够从样品中 分离到所需要的微 生物；
培养基经涂布培养先长出菌 步 落→再覆盖1mg/mL的CR溶 骤 液→(10~15min后)倒去CR溶 液→加入1mol/L的NaCl溶液 →15min后倒掉NaCl溶液→ 出现透明圈
优 显示出的颜色基本上是纤 点 维素分解菌的作用
配置10mg/mL的CR溶液→灭菌 →按照1mLCR溶液/200mL培养 基的比例混匀→倒平板→接种后 培养→出现透明圈
问题三：“资料三”中的两种方法各有哪些优点和不足，
你打算选哪一种？ 刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20 年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是 传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌 落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本 上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便， 不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆 汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生 物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生 的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位， 因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另 一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长 时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤 维素分解菌不易区分。
5、实验测定链霉素对3种细菌的抗生素效应，用3种细 菌在事先准备好的琼脂块平板上画3条等长的平行线（3 条线均与下图中的链霉素带接触），将平板置于37℃条 件下恒温培养3天，结果如图所示。从实验结果分析以 下叙述，不正确的是 D
分解纤维素的微生物的分离的拓展
要求，到相应 确保能够从样品中
环境中去找；
分离到所需要的微 生物；
2
4.酪素
• 微生物培养基的氨基酸氮源，由酪蛋白 水解得到，常见商品名称为水解酪素或 酶解酪素。酪蛋白水解后富含21种氨基 酸，氨基酸种类齐全。因此常用于制备 培养基。
3
3、酵母膏
酵母膏实际上是膏状的酵母抽提物，酵
母抽提物是国家行业标准的规定名称。
你打算选哪一种？
刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20
年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是
传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌
落之间发生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本
上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，
不存在菌落混杂问题，缺点是提物以酵母为原料，采用自溶法
或加酶水解法工艺，经分离、脱色（或精制
浓缩、喷雾干燥）而成的，含氨基酸、肽、
多肽及酵母细胞水溶性成分的产品。包含粉
状、与膏状的产品。
酵母膏可以有食品调味与生物发酵培养
基两大类用途。在生物发酵行业应用还有一
种习惯叫法是酵母浸膏。
4
问题三：“资料三”中的两种方法各有哪些优点和不足，
汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生
物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生
的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，
因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另
一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长
时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤
维素分解菌不易区分。
D链霉素可以用于治疗伤寒病人
1
(三)、实验设计
土壤 取样
纤维素分解菌的筛选及其生长条件的研究
纤维素分解菌的筛选及其生长条件的研究作者：路娟娟陈娴孔峰程洁红来源：《江苏理工学院学报》2017年第06期摘要：为筛选出能够降解纤维素的纤维分解菌，为生物质的高效利用提供生物预处理的微生物资源基础。
采集土壤样品进行混合并制成一定浓度的菌悬液，经过初筛、纯化和复筛，获得了6株纤维素分解菌，并对这6株菌用英文字母进行编号，分别为菌A、菌B、菌C、菌D、菌E、菌F；同时进行了每种菌的不同温度、不同pH值对纤维素菌酶活力的影响实验，并获得了每种菌的最适温度、最适pH值参数。
菌株的最适温度和最适pH值可以为纤维素分解菌用于生产、工程实践方面提供合理的工艺参数依据。
关键词：纤维素分解菌；筛选；酶活力中图分类号：Q819.0 文献标识码：A 文章编号：2095-7394（2017）06-0020-05木质纤维素生物质（所有的植物和植物原料）是地球上最丰富的且具有巨大的生物能源和大宗化学品生产潜力的可再生有机物质。
[1]木质纤维素物质主要由纤维素、半纤维素和木质素构成，三者所占的比例分别是40%、20%～30%和20%～30%。
[2]由于纤维素结构复杂，又与木质素结合形成难以被高效利用的“木质纤维素”，这一直是限制木质纤维素生物质高效利用的瓶颈。
因此，破坏纤维素、木质素的牢固结构，使纤维素、木质素及包裹在其中的有机质成分充分裸露而被利用，是生物质高效利用的前提。
目前，用生物方法对生物质进行预处理是既经济又高效的方法。
筛选出能够降解纤维素的纤维分解菌，为生物质的高效利用提供生物预处理的微生物资源基础。
同时对所筛选出的微生物进行了温适宜度、适宜pH值等生长条件的实验研究。
1 材料及方法1.1 菌种来源采集江苏理工学院校园灌木丛下、小树林下腐烂叶子下面的土壤样品，进行混合后制成一定浓度的菌悬液备用。
1.2 培养基准备（1）赫奇逊噬纤维素基础培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.3g，FeCl3 0.01g，CaCl2·6H2O 0.1g，NaCl 0.1g，NaNO3 2.5g，琼脂25g，水1 000mL[3]。
纤维素分解菌的筛选流程
纤维素分解菌的筛选流程1.首先从自然环境中采集潮湿的土壤样本。
First, collect moist soil samples from the natural environment.2.将土壤样本分离并进行稀释处理。
Separate and dilute the soil samples.3.接种土壤样本到富含纤维素的培养基中。
Inoculate the soil samples into a cellulose-rich medium.4.培养一段时间以促进纤维素分解菌的生长和繁殖。
Culture for a period of time to promote the growth and proliferation of cellulose-degrading bacteria.5.筛选并分离出有纤维素降解能力的菌株。
Screen and isolate bacteria with cellulose degradation ability.6.通过观察和测定菌株的生长特性来初步鉴定。
Preliminary identification of bacterial strains by observing and measuring their growth characteristics.7.进行酶活性测定以确认菌株的纤维素降解能力。
Enzyme activity assays to confirm the cellulose degradation ability of bacterial strains.8.将具有潜在应用前景的菌株进行进一步鉴定和纤维素降解能力测定。
Further identification and cellulose degradation ability testing of bacterial strains with potential application prospects.9.将菌株进行16S rRNA基因测序以了解其系统发育关系。
纤维素分解菌的分离筛选和产酶条件优化
长 、 维素 酶复合 物 的分子 量十分 庞 大 、 纤 单个 酶组 分 没有水 解纤 维素 的能力 等原 因一直 是 阻碍纤 维素 酶 大规模 生产 应 用 的瓶 颈 问 题 ． 为此 ， 试 验 利 用 本
收 稿 日期 ：０ ０— ７—１ ２１ ０ ９ 修 回 日期 ：０ ０ ９— ８ ２ １ —０ ２
术， 利用 工农业 废弃 物等 发酵 生产人 类急 需 的燃料 、 饲 料及化 工 产 品 ， 即化 工 原 料 的 “ 色 化 ” 具 有 极 绿 ，
１ ２ １ 选 择富集 培 养基 ： 维 素粉 ５ｇ Ｎ Ｎ ．． 纤 ，ａＯ
１ ｇ， ２ Ｎａ ＨＰＯ４ ・７Ｈ２ ０． ＫＨ２ Ｏ ５ ｇ， ＰＯ４０． ９ｇ
的挑 战 ， 找再生 能 源 替 代不 可 再 生 能 源是 应 对 这 寻
一
纤 维 素刚果 红鉴 别培养 基从 不 同分 离源 分离筛 选 出 对 纤维 素具 有 良好分 解 效 果 的纤 维 素 分解 菌 ， 对 并 其 酶活 力进行 了测 定 ， 选 出 １株纤 维 素 酶 活力 较 筛
关键词： 纤维素 分解 菌 ； 离； 分 筛选 ； ＭＣ酶 活 ； 纸酶 活 Ｃ 滤
中 图 分 类 号 ：Ｑ ２ Ｔ ９０ 文献标识码 ： Ａ 文章 编 号 ：０ ９ ９ ２ ２ １ ）６— ０ ７ ４ １０ —７０ （ ００ ０ ０ ３ —０
资源 和环境 问 题 是人 类 在 ２ ｌ世 纪 面临 最 主要
Ｍ Ｓ ４・ Ｈ Ｏ ０ ５ｇ Ｋ １ ． ， 母 膏 ０ ５ｇ ｇ Ｏ ７ ２ ． ， Ｃ ５ｇ 酵 ０ ． ， 水解 酵 素 ０ ５ｇ 将 上述 物 质 溶解 后 ， 蒸馏 水定 容 ． ． 用
到 １ ０ ． ０ｍ１ ０
分解纤维素的微生物的分离
设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 设置对照的主要目的是排除实验组中非测试 因素对实验结果的影响
A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。 一是由于土样不同， 一是由于土样不同，二是由于培养基污染或培养基混有 其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。 其它氮源。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实 验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种， 验方案有两种。一种方案是可以接种其它菌种，看是否 有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。 有菌落的出现，验证培养基是否混有其它氮源。另一种 方案是将A 方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培 作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。 所以，在实验中一般都应设置对照组， 所以，在实验中一般都应设置对照组，使实验更有 说服力。 说服力。
（4）细菌的计数 选取菌落数在30～300的平板进行计数。 选取菌落数在30～300的平板进行计数。在 30 的平板进行计数 同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数， 同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数， 然后求出平均值， 然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度 计算出样品中细菌的数目。 计算出样品中细菌的数目。
四、课题延伸
本课题对分解纤维素的微生物进行了 初步的筛选。但是， 初步的筛选。但是，这只是分离纯化的第 一步。为确定得到的是纤维素分解菌， 一步。为确定得到的是纤维素分解菌，还 需要进行发酵产纤维素酶的实验。 需要进行发酵产纤维素酶的实验。
五、结果分析与评价
1.培养物中是否有杂菌污染以及选择 1.培养物中是否有杂菌污染以及选择 培养基是否筛选出菌落 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长， 对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长， 说明培养基没有被杂菌污染。 说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的 菌落数目明显大于选择培养基的数目， 菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选 择培养基已筛选出一些菌落。 择培养基已筛选出一些菌落。
12147 纤维素分解菌培养基
配制方法:
称取本品44.2g于1L蒸馏水或去离子水中
（可按比例增加或减少配制量），加热煮沸1分钟，分装，121℃高压灭菌15分钟,灭菌结束后请摇匀，
以防琼脂沉积于器皿底部而凝固，备用。
注意事项:
实验室专用；使用时避免与皮肤、眼睛接触；
避免吸入或吞食。
250g
セルロース分解菌培
地
纤维素分解菌培养基
Cellulose Decomposing Microorganisms Medium
製品コ―ド：12147
調製法：
本品44.2gを精製水１Lに加えて振り混ぜのち、1
分
間に加熱して煮沸溶解、分注する。
121℃で１5分間高
圧蒸気滅菌する。
滅菌後振いて、凝固を防止して使用
する。
注意事項：
試験室専用；使用の時、皮膚、目と接触を避ける,
吸入と飲み込むの場合を注意する。
組成(配方)：g/L
硫酸アンモニウム（硫酸铵）…………………2.0g
硫酸マグネシウム（硫酸镁）…………………0.5g
リン酸二水素カリウム（磷酸二氢
钾）……… 1.0g
塩化ナトリウム（氯化钠）……………………0.5g
セルロース（纤维素粉）……………………
20.0g
コンゴレッド（刚果
红）………………………0.2g
寒天（琼脂）………………………………20.0g
滅菌後のpH7.1±0.1(25℃)
許可号：20111116
保存方法：室温、光を避ける、防湿
保存期限：三年間。
分解纤维素的微生物的分离
第7课时 分解纤维素的微生物的分离学习目标 1.掌握纤维素酶的种类和作用及纤维素分解菌的筛选方法。
2.理解并掌握纤维素分解菌的筛选过程及刚果红染色法的原理。
3.掌握纤维素酶的测定方法。
一、纤维素分解菌的筛选1．纤维素与纤维素酶 (1)纤维素①基本组成单位：-----------。
②分布：主要分布在植物--------------等器官中。
特别提醒 纤维素的分布、主要性质和作用分布 棉花是自然界中纤维素含量最高的天然产物，此外，木材、作物秸秆等也富含纤维素主要性质 常温下比较稳定，不溶于水及一般有机溶剂；纤维素不具有还原性，但在一定条件下能进行水解反应，产生葡萄糖，故其水解产物具有还原性 作用植物细胞细胞壁的主要成分；一种重要的膳食纤维，具有刺激胃肠蠕动、促进消化液分泌的功能；此外纤维素可用于造纸、纺织、制造炸药等(2)纤维素酶①组成：是一种复合酶，至少包括三种组分，即C 1酶、C X 酶、葡萄糖苷酶。
②作用：纤维素―――――――→C 1酶和C X 酶纤维二糖―――――――→葡萄糖苷酶葡萄糖特别提醒 除自然环境中存在的分解纤维素的微生物外，在草食性动物牛、马、羊等的消化道内，也共生有分解纤维素的微生物，其可产生纤维素酶分解纤维素，而人体没有分解纤维素的能力。
2．纤维素分解菌的筛选 (1)方法：--------------。
①方法一：先培养------------，再加入-------------进行颜色反应。
②方法二：在------------时就加入刚果红。
特别提醒 方法一需要用NaCl 溶液洗去培养基表面浮色后，再进行观察，方法二不需要。
(2)原理纤维素＋刚果红→红色复合物↓纤维素酶纤维二糖和葡萄糖，不能和刚果红形成红色复合物 ↓以--------------心的透明圈1．如何设计实验证明纤维素酶能分解纤维素？提示 设计对照实验。
取两支试管，分别加入等量的滤纸条和缓冲液，在一支试管中加入纤维素酶，另一支试管中加入等量蒸馏水，振荡反应一段时间后，可观察到加入纤维素酶的试管中滤纸条被水解，而加入蒸馏水的试管中滤纸条没有变化。
猪盲肠中纤维素分解菌的分离鉴定
·实验研究·
ShiYan YanJiu
猪盲肠中纤维素分解菌的分离鉴定
Abel-Aziz Hussein，吴家勇，姜海龙 吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130000
摘 要：在农业生产中，秸秆是一种巨大的具有可再生性的宝贵资源。如果经过科学有效的微生物发酵处理，秸秆当 中所含的营养物质以及其适口性可大大提高。本实验以猪盲肠为微生物来源，从中分离出能有效分解纤维素的菌 株，以期为秸秆资源的开发利用奠定基础，为开发适合喂猪的发酵秸秆饲料提供菌种资源。试验一：通过 CMC-Na 刚果红培养基从猪盲肠内容物中分离出一株具有产纤维素酶能力的菌株 JY-1，经检测产酶活性达 0.32 U/mL。采用 16SrDNA 分子学测序技术鉴定其为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。 关键词：秸秆；猪盲肠纤维素菌；菌株种子液
1.4 纤维素分解菌的分离纯化
-80 ℃冰箱中。
1.5 菌株种子液的制备以及复筛 将冰箱中保藏的菌株在 Luria-Bertani 平
板培养基上进行反复的划线培育，将划线分离出 的单个菌落用接种针接种活化培养 24 h，挑取少 量菌落接种在 Luria-Bertani 液体培养基上， 摇床培养箱设置条件为 37 ℃、220 r/min 培养 12 h，以 1.0% 的比例接种至 Luria-Bertani 液 体培养基中，于振荡培养箱中继续培养 12 h 即完 成种子液的制备。
1.1 试验样品与采集 本试验猪盲肠样品取自于长春巨源屠宰场的
2 头健康三元杂交阉公猪，在屠宰后立即分离出 盲肠样品迅速将已消毒的棉绳对盲肠端头进行结 扎后剪切，快速装入灭菌的封口塑料袋中，并挤 压出封口袋中多余空气后密封，置于泡沫冰盒中 带回试验室准备开始纤维素分解菌的分离。
2.1.4分解纤维素的分离
1、实验原理 2、培养基的设计
三、实验流程不操作
1、实验设计不操作 2、案例分析
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
三、实验流程不操作 1、实验流程不操作 ⅰ土壤取样
ⅱ选择培养
ⅲ梯度稀释
生命
ⅳ将样品涂布到鉴别纤 维素分解菌的培养基上
ⅴ挑选产生透明圈菌落
ⅵ纤维素酶测定
山西省实验中学 生物教研组：颜威
刚果红(RD) 纤维素(多糖)
结合 形成
红色复合物
刚果红(RD)不水解后的纤维生命二糖和葡萄糖丌反应
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理 刚果红(RD)染色法 (2)透明圈反应
刚果红(RD) 纤维素(多糖)
结合 形成
红色复合物
生命
纤维素酶(复合酶)
红色复合物无法
一、纤维素和纤维素酶
2、纤维素酶
说明： (1)纤维素酶是一种复合酶,包括多种组分,各组分之间协 同作用,单一的一种组分无法独立彻底分解纤维素。 (2)该酶也具有与一性,只能分解纤维素。 (3)该酶发挥作用需要温和的生条命 件,包括适宜的温度和pH等。
山西省实验中学 生物教研组：颜威
生命所系 性命相托
山西省实验中学 生物教研组：颜威
以纤维素分解菌为 中心形成透明圈
生命所系 性命相托
二、纤维素分解菌的筛选
1、实验原理
(2)透明圈反应
说明： I. 在固体培养基中加入可被特定菌群所利用的营养成
分，造成浑浊、丌透明的培养基背景 II. 就会在待筛选菌落周生围命形成透明圈，透明圈的大小
反映了菌落利用此物质的能力 III. 培养微生物时加入药物所产生的透明圈也可用亍检