覆盆子多糖提取_结构分析及自由基清除作用研究

覆盆子 Rubus chingii Hu 又称树莓、木莓、托 盘等，属于蔷薇科，悬钩子属植物，为多年生小 灌木。覆盆子果实富含鞣花酸、超氧化物、糖、 Vc，VB 等物质，具有延缓衰老，消除疲劳，提高 免疫力等功效。覆盆子已被世界公认为第三代黄 金水果，在国际国内市场上前景极为广阔。据分 析[1]，每 100 g 鲜果含蛋白质 0.2 g，脂肪 0.5 g，碳 水化合物 13.6 g，纤维 0.3 g，灰分 0.5 g，钙 22 mg， VA1 30 mg， VB1 0.03 mg， VB2 0.09 mg， 烟 酸 0.9 mg，Vc2 5 mg，VB9 0.20～0.25 mg，所含的各种 营养成分均易被人体吸收，具有改善新陈代谢， 增强抗病能力的作用，是老少皆宜的果中佳品。 覆盆子适应性很强，耐旱、耐瘠薄，有较强的抗 寒能力。我国的野生覆盆子十分丰富，分布较广。 大部分地区都能栽培，不择土壤，病害少。是一 种优良的果树资源，便于开发利用。
采用水杨酸参与 OH·体系反应。各管用移液 管，按 2 mL FeSO4 溶液(5.0 mmol/L)、2 mL 过氧 化氢溶液(0.5%)、2 mL 水杨酸溶液(7.5 mmol/L)的 顺序加入溶液。A 至 F 号管中加入梯度浓度覆盆 子粗多糖溶液(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL) 各 2 mL；在 a 至 f 号管中加入梯度浓度覆盆子纯 化多糖溶液各 2 mL。在 0 号管中加入 2 mL 超纯 水，作为对照液。将各试管放入 37 ℃水浴培养 90 min。 水 浴 完 成 后 ， 取 出 冷 却 至 室 温 ， 并 在 510 nm 波长下测各管溶液的吸光度。记录数据。 按下式计算清除率 E(%)。
2 结果与分析
2.1 多糖提取 覆盆子多糖的提取目前尚无人研究，在本研
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2009 年 第 34 卷 第 7 期
食品科技
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提取物与应用
究中参照天麻多糖提取方法[4]和其他多糖提取方 法，比较了不同提取方法对提取效果的影响。
表 1 粗多糖提取参数与实验结果
Abstract: Objective: To study the raspberry(Rubus chingii Hu) polysaccharides(RPS) extraction, structure and
free radicals scavenging activities. Methods: The polysaccharides was extracted from raspberry by water and
LIU Ming-xue, NIU Jing-e, SU Zhong-wei, WANG Yu-qiao, LI Min
(Life Science and Engineering College, Southwest University of Science and Technology, Mianyang 621000)
苷键。在相同的实验体系浓度下，覆盆子粗多糖及纯化多糖对 OH·的 IC50 分别为 1.37、0.91 mg/ mL；对 O2-·的 IC50 分别为 0.66、0.44 mg/mL。结论：覆盆子多糖为酸性 α-呋喃糖，且含 β－糖苷
键，对氧自由基具有较强清除能力。
关键词： 覆盆子；多糖；提取；结构；自由基清除
收稿日期： 2009-03-03 基金项目： 四川省教育厅重点项目(041123)。 作者简介： 刘明学(1975—)，男，讲师，主要从事分子细胞生物学及生物活性物质研究工作。
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提取物与应用
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2009 年 第 34 卷 第 7 期
with
Fenton
reaction
and
O
· -
2
with
Pyrogallol
Autoxidation
Method
was
studied．
Results:
The
optimal
extraction
technology conditions were that the temperature was 80 ℃, the extraction time was twice, the Sevag reagent
E(%)=(A0-A 样品)/A0×100 1.6.2 覆盆子多糖对超氧阴离子自由基(O2-·)的清 除作用 采用邻苯三酚自氧化体系。用移液管在 各管中加入 4 mL Tris-HCl(pH 8.2)，2 mL 邻苯三 酚溶液(10 mmol/L)。A 至 F 号管中加入梯度浓度覆 盆子粗多糖溶液各 2 mL；在 a 至 f 号管中加入梯 度浓度覆盆子纯化多糖溶液各 2 mL。在 0 号管中 加入 2 mL 超纯水，作为对照液。将各试管置于 37 ℃水浴中精确反应 10 min。水浴完成后，各支试 管加 1 mL 盐酸(6 mol/L，约 22%)溶液终止反应， 冷却至室温，并在 325 nm 波长下测各管溶液的吸 光度。记录数据。计算公式同上。
furanose with some β-glucosidic bond and had strong capacity of scavenging free radicals.
Key words: raspberry(rubus chingii hu); polysaccharides; extraction; structure; free radicals scavenging
precipitated by ethanol, purified with CTAB. The structural characterization of RPS was confirmed by IR and
NMR techniques. In the vitro simulated chemical reaction system, the polysaccharide scavenging effect on OH·
实验号 1 2 3 4
原料加入量/g 100 30.2 33.59 50
水量/mL 1000 800 1000 500
浸提温度/℃ 80 80 100 100
浸提时间/h 1.5 2 1 2
提取次数 2 2 2 2
氯仿：正丁醇 粗多糖得率/%
1∶1
4.39
2∶1
5.53
1∶1
4.64
2∶1
4.43
在第一方案中，料水比为 1∶10，提取两次， 浓缩至 200 mL 后，按 1∶1 比例加入氯仿正丁醇(3∶ 1)沉淀蛋白质，之后再加入 0.5 倍体积的氯仿正丁 醇(3∶1)溶液，离心后的上清液浓缩至 100 mL，加 入 4 倍体积无水乙醇沉淀多糖，获得初多糖的提 取率为 4.39%。
1 材料与方法
1.1 材料 覆盆子：市售。
1.2 多糖提取方法[4] 覆盆子→粉碎过筛(20 目)→加入适量蒸馏水→
80 ℃/100 ℃水浴浸提 1.5~2 h 两次→合并滤液→浓 缩→离心→加入一定体积氯仿-正丁醇(3∶1)溶液， 剧 烈振摇 8~10 min→离心取上清→再加入 0.5 倍体积 氯仿-正丁醇(3∶1)， 剧烈振摇 8~10 min→离心取上 清→浓缩至 250 mL→加入 3 倍体积 95%乙醇， 在 较低温度下静置 12 h→离心， 沉淀 60~70 ℃烘干， 计算提取得覆盆子粗多糖质量。 通过正交设计优 化提取工艺。 1.3 覆盆子多糖的纯化[4]
制备覆盆子粗多糖，CTAB 季铵盐络合法进一步纯化；通过 IR、NMR 等分析覆盆子多糖结构；
利用 Feton 体系和邻苯三酚自氧化反应，采用比色法测定覆盆子多糖对 OH·及 O2-·自由基的清除
作用。结果：通过实验获得覆盆子多糖提取工艺为料水比 1∶30、浸提温度 80 ℃、提取次数 2
次、氯仿正丁醇用量为 2∶1；红外光谱和 1H-NMR 分析覆盆子多糖为酸性 α-呋喃糖，且含 β－糖
近几十年来，人们发现从植物中提取的多糖具 有非常重要与特殊的生理活性。具有抗肿瘤和免疫 促进，抗炎、抗病毒、抗凝血、降血糖、降血脂、 抗疲劳、抗衰老等作用[2]。已有文献报道，覆盆子 粗多糖具有明显的促进淋巴细胞增殖作用[3]。但覆 盆子多糖提取分离方面的报道未曾看到，其生理功 能及工艺开发有待进一步研究。本研究利用我国覆 盆子资源丰富，营养价值高的特点，对覆盆子中多 糖的提取方法进行了研究，初步分析多糖结构，研 究自由基清除活性。为进一步研究其生理活性和产 品开发奠定基础。
多糖纯度鉴定采用紫外光谱扫描法；多糖含 量测定采用硫酸－苯酚分光光度法。 1.5 覆盆子多糖结构分析
采用溴化钾压片法对样品进行红外光谱(IR)测 定以及核磁共振波谱(NMR)分析。将 30 mg 样品用 D2O 溶解交换 3 次，经 D2O 溶解后加入核磁管， 在 300 K 下测定(Bruker Avance 600)。红外光谱和 核磁共振由中科院成都生物研究所完成测定。 1.6 多糖溶液的自由基清除作用[5-6] 1.6.1 覆盆子多糖对羟基自由基的清除作用(OH·)
在第二方案中，料水比为 1∶26，提取两次， 浓缩至 150 mL 后，按 2∶1 比例加入氯仿正丁醇(3∶ 1)沉淀蛋白质，之后再加入 0.5 倍体积的氯仿正丁 醇(3∶1)溶液，离心后的上清液浓缩至 150 mL，加 入 3 倍体积 95%乙醇沉淀多糖，获得初多糖的提 取率为 5.53%。
在第三方案中，料水比为 1∶30，提取两次， 浓缩至 130 mL 后，按 1∶1 比例加入氯仿正丁醇(4∶ 1)沉淀蛋白质，之后再加入 0.5 倍体积的氯仿正丁 醇(4∶1)溶液，离心后的上清液浓缩至 80 mL，加入 4 倍体积无水乙醇沉淀多糖，获得初多糖的提取率 为 4.64%。
中图分类号： Q 946.3
文献标志码： A
文章编号： 1005-9989(2009)07-0163-05
Extraction, structure and free radicals scavenging activities of polysaccharides from Raspberry(Rubus chingii Hu)
2009 年 第 34 卷 第 7 期
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提取物与应用
覆盆子多糖提取、结构分析及 自由基清除作用研究
刘明学， 牛靖娥， 苏忠伟， 王玉乔， 李 敏 (西南科技大学生命科学与工程学院，绵阳 621000)
摘要： 目的：研究活性覆盆子多糖的提取、结构分析与自由基清除作用。方法：以水提醇沉法
称取覆盆子粗多糖 1 g 充分 溶于 100 mL 蒸馏 水 中， 溶液用 1% NaOH 调 整 pH 至 10→加 入 2%
CTAB 溶液至沉淀完全， 摇匀， 静 置 3 h→离心得 沉淀→将沉淀溶解于 100 mL NaCl(2 mol/L)溶液中， 置于 60 ℃水浴中解离 2 h→离 心 除 不 溶 物→上 清 液用透析袋装好， 流水透析→浓缩至 20 mL， 加入 3 倍 体 积 无 水 乙 醇 沉 淀 多 糖→离 心 ， 60 ℃干 燥→ 冷冻干燥得到纯化多糖。 1.4 覆盆子多糖纯度检验和含量测定
在第四方案中，料水比为 1∶10，提取两次， 浓缩至 100 mL 后，按 2∶1 比例加入氯仿正丁醇(4∶ 1)沉淀蛋白质，离心后的上清液浓缩至 80 mL，加 入 2 倍体积 95%乙醇沉淀多糖，获得初多糖的提 取率为 4.43%。
ratio was 2 ∶1. IR and 1H -NMR analysis indicated that RPS was composed of α -furanose with some β -
glucosidic bond. The respective IC50 of raw RPS and refined RPS to OH· was 1.37 mg/mL and 0.91 mg/mL, to O2-·was 0.66 mg/mL and 0.44 mg/mL. Conclusion: These results clearly indicated that RPS structure wasα-