荧光检测神经递质氨基酸

激发的 单重态
荧光 激发的 三重态
荧光的激发光谱和发射光谱
可作为进行荧光测定时选择合适的激发波长和测定 波长的依据。 激发光谱： 固定荧光的发射光谱（即测定波长）而不 激发光谱： 断改变激发光（即入射光）的波长，并记 录相应的荧光强度所得到的荧光强度对激 发波长的谱图。 使激发光的波长和强度保持不变，不断改 发射光谱： 发射光谱： 变荧光的测定波长（即发射波长）并记录 相应的荧光强度所得到的荧光强度对发射 光波长的谱图。
毛细管电泳方法有着简单、高效、费用低、分析时 间短等优点，并且最近也被应用于生物样品中氨基酸的 检测。 在这之前作者曾成功的采用毛细管电泳与荧光检测 器联用的方法进行了多种体系中牛磺酸的测定。 研究目的： 研究目的： ①提出一种能够对多种 多种生物基质中神经递质氨基 多种 酸经行分析的方法。 ②研究通过提高温度的方法缩短衍生化时间 缩短衍生化时间的方 缩短衍生化时间 法在其他氨基酸的检测上是否同样有效。 Amino Acids (2009) 36:35–41
化合物溶液的发射光谱特征： 化合物溶液的发射光谱特征：
1、所观察到的荧光的波长 总是大于激发光的波长— —斯托克斯位移 2、发射光谱的形状通常与 激发波长无关，通常只含 一个发射带。 3、与吸收光谱呈镜像关系
荧光强度与溶液浓度的关系：
If=2.303YfI0εbc
浓度足够小使得对激发光的吸光度很低时， 注意：当溶液浓度足够小 浓度足够小 所测得溶液的荧光强度才与该荧光物质浓度成正比。 浓度效应：浓度达到一定程度，荧光强度随着浓度的 增大而下降。 可能原因： 1、内滤效应 ①杂质吸收 ②前面吸收多 2、溶质间的相互作用 激发/基态二聚物 3、发射光谱和吸收光谱呈现部分重叠。
1852年 Stokes在考察奎宁和叶绿色的荧光时，用分光计观 察到其荧光的波长比入射光的波长稍长，才判明这 种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长 的光，从而导入了荧光是发射光的概念。他还是第 一个提出应用荧光作为分析手段的人（1864年）。 1867年 Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工 作。
该方法在测定血浆氨基酸含量中的应用：
预处理： 采用静脉穿刺的方法采集到的血液放于装有 EDTA的疏散管中，然后迅速在4℃下以3000g离心5 分钟，放置过夜后取100 μL血浆与50 μL内标物 质混合后过滤去蛋白质。50 μL上清液与40 μL 200 mmol/L Na2HPO4 、与10 μL 80 mmol/L FITC 在100℃下反应20分钟，稀释100倍后用于实验。
荧光表征：
许多化合物由于本身具有大的共轭体系和刚性的 平面结构，因而具有能发射荧光的内在本质，我们称 这些化合物为荧光化合物。 具有荧光团的物质，我们可以通过检测某种荧光 特性参数的变化而对该体系的某些性质加以研究。 对于不含荧光团或内源荧光性质很弱的物质我们 可以加入一种荧光化合物（荧光探针），再通过测量 荧光探针的荧光特性的变化来对该体系加以研究。 例：用对pH敏感的荧光探针检测pH。
荧光分析的灵敏度和选择性：
灵敏度： 1、比比色法和分光光度法高2-3个数量级。 2、加大激发光的强度，可以增大荧光强度 从而提高分析的灵敏度。 3、灵敏度可达亿分之几。 4、接近单分子检测水平。 选择性： 1、可以选择适当的激发波长和荧光测定波 长达到选择性测定的目的。 2、荧光特性参数较多，还有荧光寿命、荧 光偏振等。
实验结果：
与文献符合的很好
该方法在其他生物基质中的应用：
红细胞中
尿液中
培养的细胞
唾液
脑脊液
玻璃体
该方法的优点： 3、该方法的优点：
1、通过提高温度的方法减少了衍生化的时间，相对于 以前需要6-14h的衍生化时间现在只需20min。 2、使用范围广泛，能应用于血浆、红细胞、培养的细 胞、脑脊髓液、唾液、玻璃体等生物基质中的多种氨 基酸神经递质的测定。以前的方法都只能用于一两种 生物基质中的某几个氨基酸。 3、简单、高效、费用低、分析时间短。 4、线性程度高、方法的精确度与准确度均很高。
1864年 1928年 1948年 1952年 50年代 初期 70年代 后期
Liebeman提出了最早的关于荧光与化学结构关系 的经验法则。 Jette和West研制出第一台光电荧光计，灵敏度 非常有限。 Studer推出第一台自动光谱校正装置。 实现商品化。 极少数分析化学工作者从事荧光分析方面的工作 引起了国内分析界广泛重视
实验方法及结果： 实验方法及结果：
1、条件的摸索 用毛细管电泳法与荧光检测器联用的方法检测一混合 标准样品 样品：Ala 800 µmol/L; Ser 200 µmol/L; Gly 400 µmol/L; Tau 200 µmol/L; Glu 100 µmol/L; Asp 100 µmol/L 内标物质： homocysteic acid（高半胱氨酸） 磷酸盐缓冲溶液浓度： 5 - 50 mmol/L pH：10-12 温度：20-50℃（3℃为梯度）
荧光的原理
物质在吸收入射光的过程中，光子的能量传递给了物 质分子。分子被激发后，发生了电子从较低的能级到较高 能级的跃迁。跃迁所涉及的两个能极间的能量差等于所吸 收光子的能量。紫外、可见光区的光子能量较高，足以引 起分子中的电子发生电子能级跃迁 电子能级跃迁。 电子能级跃迁 处于激发态的分子不稳定，可能通过辐射跃迁和非辐 射跃迁的衰变过程而返回基态。辐射跃迁 辐射跃迁的衰变过程伴随 辐射跃迁 着光子的发射，即产生荧光或磷光。 由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发 光现象称为荧光。
最终确定的最优实验条件：
磷酸盐缓冲液浓度：18mmol/L pH:11.6 温度：23℃ FITC浓度：8mmol/L 衍生化时间：20min 检测时间：小于12min
SCN O O
FITC分子中的异硫氰基可 直接与氨基经碳酰化反应 形成硫碳氨基键，成为荧 光标记氨基酸。
OH
HO
O
异硫氰酸荧光素
在上述实验条件下对标准混合物的分析结果： 氨基酸
Байду номын сангаас 目录
1 2 3 4 荧光简介 研究目的 研究方法及结果 方法的优势
荧光的概念：
当紫外线照射到某些物质的时候，这些物质会发 射出各种颜色不同强度的可见光，而当紫外线停止照 射时，所发射的光线也随之很快消失，这种光线被称 为荧光。
历史：
1575年 西班牙的内科医生和植物学家N. Monardes第一次 记录了荧光现象
荧光检测器在体内药分中的应用
例：
Quantification of neurotransmitter amino acids by capillary electrophoresis laser-induced fluorescence detection in biological fluids
12.5 ~ 200 Y=0.005X+0.032 12.5 ~ 200 Y=0.016X+0.053 12.5 ~ 100 Y=0.009X+0.024
天冬氨酸 1 ~ 40
Y= 0.006X+0.002 0.999
精密度实验显示了该方法有着很好的可重复性：
批内 批间 迁移时间 峰面积 回收率 CV<4.93% CV<7.16% CV<2.08% CV<3.91% 97-103%
Anal Bioanal Chem (2010) 398:1973–1978
为什么要进行此项研究？ 为什么要进行此项研究？
1、对神经递质氨基酸进行测定有着重要的作用 神经递质氨基酸在生理机能上扮演着重要角色，例 如谷氨酸和天冬氨酸都是兴奋性神经递质。对生物体中 氨基酸含量的测定在生理学上有着重要的意义。 2、测定有难度、先前的方法存在缺陷 测定有难度、 神经递质氨基酸在血浆、细胞等生物基质中都有分 布，但由于含量低以及基质的复杂性使得其测定异常艰 难。之前都是使用常规的方法进行测定，比如HPLC、酶 反应及免疫组织化学等。但这些方法都需要很长的衍生 化时间、产生过多的副产物、灵敏性较低且不能运用于 大量的样品。且每种方法所能分析的氨基酸种类有限。
各氨基酸的线性范围：
氨基酸 丙氨酸 丝氨酸 甘氨酸 牛磺酸 谷氨酸 线性范围 (μmol/L) 50 ~ 800 25 ~ 400 回归方程 Y=0.009X+0.140 Y=0.015X+0.094 R2 0.999 0.998 0.999 0.999 0.999 检测限 (μmol/L) 0.15 0.2 0.075 0.075 0.15 0.2
启发：
1、尝试改变实验条件以缩短时间 2、扩大方法的应用范围 3、查文献时须注意关键词的选取