现代色谱分离技术(中国海洋大学)
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目的
仅够检测用即可
获得样品组成信息，研 究大部分或全部样品组 分 DAD全波长检测，以保 证色谱峰分离度
检测
（三） HPLC的使用
•未经预纯化的样品，尤其是天然产物，含有 大量可能在填料表面不可逆吸附的组分，直 常用流动相：甲醇：水(酸水) 接进样，可导致昂贵的填料很快失效。 乙腈：水（酸水） •此外，大量的杂质降低对目标产物的分离度， 常用色谱柱：C18，C8 半制备柱 因此限制了进样量和生产效率。 波长：全波长分析，确定最优制备波长。 •因此，HPLC前利用薄层色谱、柱色谱等进行 按用分析HPLC确定的色谱条件， 初步纯化很有必要。 目标：通过改变流动相的配比，在尽量短的时 逐渐增大进样量，通过监测检 间内，使目的组分的分离度达到1.5。 测谱图，依次收集洗提液，制 成纯品。
3 操作步骤
装柱
将色谱柱洗净、干燥，底部塞一小块脱脂棉。
（1）干装法：将硅胶通过小漏斗倒入柱内，应不间断 加样
地形成一细流慢慢加入柱内，同时用橡皮槌轻轻敲打色谱 柱，使装填均匀。柱装填好后，打开下端活塞，从上端倒 入洗脱剂冲柱，以排尽柱内空气，并保留一定液面。
（2）湿装法：将硅胶加入适量最初使用的洗脱剂，超
wenku.baidu.com
检测
合并
3 操作步骤
装柱
加样
洗脱
多采用干法加样（拌样法）：将样品用尽 量少的易挥发溶剂溶解，加入样品约5倍量 的硅胶拌匀，置空气中挥尽溶剂，或在旋 转蒸发器里于适温下蒸干，研匀后均匀置 于装好硅胶的柱顶，尽量使样品平整，并 在柱顶放一块圆形滤纸。
检测
合并
3 操作步骤
装柱
加样
•将通过TLC选择好的洗脱剂加入 分液漏斗或者加液球中，使之不 断缓慢加于样品之上，注意始终 保持洗脱剂液面在硅胶之上，切 勿流干。
点样位置：距底边约1-2cm的起始线上，点与点的距离为 0.5-1cm。 点样方式：定性分析-点状点样。 （直径3-5mm的圆点）
制备薄层-条状点样。
2 展开
石油醚 环己烷 四氯化碳 展开剂选用原则 1 对所需组分有良好的溶解性（相似相溶）。 2 可使成分间分开。 3 待测组分Rf在0.2~0.8之间。
2 准备工作：
1 吸附剂的选择 •硅胶G 100~200目（拌样用） 200~300目（上柱用） •硅胶H
2 色谱柱的选择
•下端有活塞的玻璃柱 • 柱子大小视分离样品的量 而定 3 洗脱剂的选择
• 洗脱剂多一般由一元或二元溶剂按一定的比例配比组成，通 过不同的配比调节溶剂系统的极性，较复杂成分常用梯度洗脱。 •初始洗脱剂配比的选择：薄层试验，使待分离组分的Rf值介 于0.1~0.2之间的展开系统可选为柱色谱的洗脱剂。
制备
(制备HPLC)
初步 纯化
优化
色谱条件 （分析HPLC）
DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 mAU
100%甲醇
A, B, C, D, E,
Si g=254,10 Si g=230,10 Si g=210,10 Si g=320,10 Si g=280,10
Ref=360,10 Ref=360,10 Ref=360,10 Ref=360,10 Ref=360,10
使 用 目 的
分析型HPLC 制备型HPLC
分析型HPLC
制备型HPLC
分析HPLC与制备HPLC比较
分析HPLC
色谱柱 柱内径1~5mm
制备HPLC
柱内径1~10mm（或更 大） 尽可能加大进样量 纯品的制备，只对一种 或几种样品组分感兴趣。 分析HPLC确定条件后 VWD单波长检测即可
进样量
DA D1 DA D1 DA D1 DA D1 mA U
薄层板
固定相：硅胶为使用最广泛的薄层材料。
除此之外还有氧化铝、硅藻土等。
常用薄层硅胶的特征：
硅胶商品名 称 硅胶H 硅胶G 硅胶GF254 黏合剂 无 有 有 荧光添加剂 无 无 有 应用 薄层色谱，柱色谱 薄层色谱，柱色谱 在254nm紫外灯下看荧光
薄层板的制备方法
湿法：平铺法和涂铺法。
薄层色谱分类
洗脱
声搅拌，调成混悬液，打开柱子下端活塞，徐徐将混悬液 倒入柱子，使洗脱剂慢慢流出，带动硅胶缓慢沉于柱的下 端。待加完吸附剂后，继续使洗脱剂流出，直到硅胶的沉 降不再变动。注意整个操作过程要慢慢进行，不要将气泡 压入硅胶中，而且要始终保持吸附剂上端有溶剂，切勿流 干。最后在硅胶上面加少许棉花，将多余洗脱剂放出至上 面保持有1cm高液面为止，关上活塞。
样品的收集
切割：用刮刀刮下带有样品的吸附剂。 回收：将刮下的吸附剂装入玻璃柱中，用 极性尽可能低的溶剂洗脱，丙酮和氯仿常 用。
TLC的特点 方法简便易行,价格低廉； 分析快速；
检出灵敏度高；
分离能力强；
检测手段多样化；
应用广泛；
二
柱 色 谱
柱色谱
硅胶柱色谱
凝胶柱色谱
ODS柱色谱
（三）大孔树脂柱色谱
1 原理：
大孔树脂为新型非离子型分子聚合物吸附剂， 白色球形颗粒，每个颗粒都是由许多彼此间存在 孔穴的微观小球组成，称之为“大孔”。 大孔树脂色谱是以大孔树脂为吸附剂，利用 其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选 用适宜的吸附和解析条件以分离、提纯某一或某 一类化合物的色谱。 可分为极性、中极性、非极性三大类，根据 分离物质极性的大小，通过所选择的与之相适应 的大孔树脂的选择性吸附而达到分离目的。
大孔树脂柱色谱
(一)硅胶柱色谱
1 原理：
根据物质在硅胶柱上的吸附力不同而分离。
一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性
较弱的物质不易被硅胶吸附。流动相流过时各组 分以不同的速率向下移动，吸附弱的组分随着流 动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，各 种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现化合物
的分离。
3 操作步骤
预处理
乙醇浸泡24h ，充分溶胀→湿法装柱，用乙醇洗至流出液加等 量蒸馏水无白色浑浊 →蒸馏水洗至无醇味且水液澄清。 将样品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端进行吸附。 上样液以澄清为好，上样前要配合一定的处理工作，如上样液 的预先沉淀、滤过处理、PH调节，使部分杂质在处理过程中 除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品。
（一） HPLC工作原理
检测过程是非破坏性的，经过检测的洗提液可以依次 收集起来，制成纯品，供进一步化学定性和结构鉴定。
液相色谱柱分类 正相柱：以硅胶为填料。或者硅胶表面键合CN,-NH2等官能团。
反相柱：以硅胶为基质，在其表面键合碳十 八（ODS） 、碳八、碳四等官能团的非极 性填料。
（二） HPLC分类
苯
氯仿 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 甲醇 水 乙酸 极 性 增 强
常用展开剂体系 一元：石油醚，甲醇 等。 二元：石油醚：丙酮，石油醚：乙酸乙酯， 氯仿：甲醇 等。 三元：氯仿：甲醇：水 等。
2 展开
应注意：
a 展开剂不淹没样点。 b 薄层板呈倾斜状。 C 展开过程应在密闭容器中进 行。 d 展开剂前沿上升到一定高度 时取出，尽快标出展开剂前 沿位置，以便计算Rf值。
•打开色谱柱下端活塞，控制流速， 等份收集洗脱液，也可用自动收 集器收集。 •通过上端加压或者下端减压可以 提高洗脱速度，但是可能会降低 塔板数影响分离效果。
洗脱
检测
合并
3 操作步骤
装柱
加样
洗脱
检测
每份洗脱液采用薄层色谱法检查。
合并
3 操作步骤
装柱
加样
洗脱
检测 成分相同（斑点相同）的洗 脱液合并，回收溶剂。
现代色谱分离技术
中国海洋大学医药学院 海洋药物教育部重点实验室
李国强
For 博兴京博控股股份有限公司
2011-12-20
主要内容
1 薄层色谱（TLC） 柱色谱（CC） 高效液相色谱（HPLC）
2
3
一
薄 层 色 谱
引言
薄层色谱(Thin Layer Chromatography)，又称薄层层析，常用TLC表示。 将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁的 表面上均匀的铺成薄层，试样点在薄层的一 端，流动相借毛细作用流经固定相，使被分 离的物质展开。 •固定相：吸附剂。 •流动相：展开剂。 •分离原理：吸附与解吸附。
(二)制备薄层色谱（PTLC）
用于制备的薄层色谱。
特点： 1 较分析薄层样品液的浓度大。 2 板较大，较厚（吸附剂用量多） 3 点样多点成直线。
样品的检测
有色物质直接观察斑点。
荧光物质紫外灯下观察。 如必须采用化学试剂显色时，可将薄层板的大部分用另一块 玻璃板盖住，留出一条进行显色，将需要的部分作出记号。
ODS(octadecyl bonded silica) , 十八烷基键合硅胶，是以硅胶为基质 键合的C18填料, ODS适用于分离中等 偏大的化合物。
与HPLC不同，开放式ODS是将ODS 装入玻璃柱内，不加压或者用加压泵 加压。
2 操作步骤
装柱
上样
洗脱
•将ODS用甲醇浸 泡，具体装柱方法 与硅胶柱相同。 •用甲醇装柱完成 后，置换成起始流 动相系统。
(ZHY \11051001.D) (ZHY \11051001.D) (ZHY \11051001.D) (ZHY \11051001.D) (ZHY \11051001.D)
YMC C18
2500
2000
1500
1000
500
0
0DA D1 A , S i g=254,10 Ref=360,10 (ZHY \11051004.D) 10 5
合并
1 2 3 4 5 6
7
小极性的组分先被洗脱下来 大极性组分后被洗脱下来
（二）凝胶柱层析
1 原理
2 凝胶层析中常用的凝胶
葡聚糖凝胶 （Sephadex）
聚丙烯酰胺凝胶
琼脂糖凝胶
3 凝胶柱的使用
溶胀 装 柱 上 样
洗脱
湿法上样： 将层析柱垂直固定在铁架上，打开柱下口开关。将溶胀好 羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）为干粉，装柱前 打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的多余溶液， 的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等。 量好柱体积，再根据凝胶的吸水量计算干重， 称重后足 •控制流速，过快或过慢影响分离效果。 使液面与凝胶表面相平齐。 用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一 量用有机溶剂（常用氯仿：甲醇=1：1）溶胀。 边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地 将样品加在凝胶表面，打开下口开关，控制流速，使样 •流出液分步收集，分析、合并。 品慢慢渗入凝胶内。当慢慢渗入凝胶的样品溶液面与凝胶柱 沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶高度时，立即关 闭下口，使凝胶完全沉降。 面相平齐时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一 层（3—5cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。
3 定位与显色
展开后将溶剂吹干。 常见的定位方法：
光学检出法
254nm，365nm（使用方便，被检测物不易被破
坏）
蒸气检出法
展开剂挥发干净后放入储有晶体碘并充满碘蒸气的密闭 容器中，放置一段时间后取出薄层板，标出斑点位置。
试剂检出法
利用化学试剂与被测物质斑点在薄层板上发生化学反应 通用显色剂：10%硫酸乙醇、茴香醛、香草醛。
使 用 目 的
定性薄层色谱 制备薄层色谱
（一）定性薄层色谱
点 样
展 开
定位与显色
1 点样
样品溶解：用甲醇、氯仿、石油醚、丙酮等挥发性有机溶 剂，最好选用与展开剂极性相似的溶剂。
点样工具：玻璃毛细管，微量点样器。
点样量：与薄层的厚度、吸附剂的种类、显色剂的灵敏度 等因素有关，若因样品溶液太稀，可重复点样。
•湿法：用起始流 动相溶解样品装柱 。 •干法：对于一些 溶解性较差的样品 ，用挥发性溶剂拌 入ODS中，挥干 溶剂。
•常用梯度洗脱： 10%甲醇/水→ 30%甲醇/水→ 50%甲醇/水→ 70%甲醇/水→ 90%甲醇/水→ 100%甲醇。 •根据样品情况细分 调整。
三
高效液相色谱
引 言
以液体为流动相的色谱法称为液相色谱 法。HPLC是以经典的液相柱色谱为基础，流 动相改为高压输送，采用高效固定相及在线 检测等手段，发展而成的分离分析方法。该 法具有分离效能高、分析速度快及仪器化等 特点，因而称为高效液相色谱法。
上样
洗脱
一般先用水洗，再用梯度递增的乙醇溶液进行洗脱，并控制洗 脱液的用量与流速，使提取液由上而下通过树脂柱。收集、合 并洗脱液，减压蒸馏，回收溶剂至干，低温真空干燥，得精制 产品。 95%乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡，用水洗至中性， 再用2%NaOH浸泡，再用水洗至中性。
再生
(四) ODS反相柱层析 1填料:
仅够检测用即可
获得样品组成信息，研 究大部分或全部样品组 分 DAD全波长检测，以保 证色谱峰分离度
检测
（三） HPLC的使用
•未经预纯化的样品，尤其是天然产物，含有 大量可能在填料表面不可逆吸附的组分，直 常用流动相：甲醇：水(酸水) 接进样，可导致昂贵的填料很快失效。 乙腈：水（酸水） •此外，大量的杂质降低对目标产物的分离度， 常用色谱柱：C18，C8 半制备柱 因此限制了进样量和生产效率。 波长：全波长分析，确定最优制备波长。 •因此，HPLC前利用薄层色谱、柱色谱等进行 按用分析HPLC确定的色谱条件， 初步纯化很有必要。 目标：通过改变流动相的配比，在尽量短的时 逐渐增大进样量，通过监测检 间内，使目的组分的分离度达到1.5。 测谱图，依次收集洗提液，制 成纯品。
3 操作步骤
装柱
将色谱柱洗净、干燥，底部塞一小块脱脂棉。
（1）干装法：将硅胶通过小漏斗倒入柱内，应不间断 加样
地形成一细流慢慢加入柱内，同时用橡皮槌轻轻敲打色谱 柱，使装填均匀。柱装填好后，打开下端活塞，从上端倒 入洗脱剂冲柱，以排尽柱内空气，并保留一定液面。
（2）湿装法：将硅胶加入适量最初使用的洗脱剂，超
wenku.baidu.com
检测
合并
3 操作步骤
装柱
加样
洗脱
多采用干法加样（拌样法）：将样品用尽 量少的易挥发溶剂溶解，加入样品约5倍量 的硅胶拌匀，置空气中挥尽溶剂，或在旋 转蒸发器里于适温下蒸干，研匀后均匀置 于装好硅胶的柱顶，尽量使样品平整，并 在柱顶放一块圆形滤纸。
检测
合并
3 操作步骤
装柱
加样
•将通过TLC选择好的洗脱剂加入 分液漏斗或者加液球中，使之不 断缓慢加于样品之上，注意始终 保持洗脱剂液面在硅胶之上，切 勿流干。
点样位置：距底边约1-2cm的起始线上，点与点的距离为 0.5-1cm。 点样方式：定性分析-点状点样。 （直径3-5mm的圆点）
制备薄层-条状点样。
2 展开
石油醚 环己烷 四氯化碳 展开剂选用原则 1 对所需组分有良好的溶解性（相似相溶）。 2 可使成分间分开。 3 待测组分Rf在0.2~0.8之间。
2 准备工作：
1 吸附剂的选择 •硅胶G 100~200目（拌样用） 200~300目（上柱用） •硅胶H
2 色谱柱的选择
•下端有活塞的玻璃柱 • 柱子大小视分离样品的量 而定 3 洗脱剂的选择
• 洗脱剂多一般由一元或二元溶剂按一定的比例配比组成，通 过不同的配比调节溶剂系统的极性，较复杂成分常用梯度洗脱。 •初始洗脱剂配比的选择：薄层试验，使待分离组分的Rf值介 于0.1~0.2之间的展开系统可选为柱色谱的洗脱剂。
制备
(制备HPLC)
初步 纯化
优化
色谱条件 （分析HPLC）
DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 DAD1 mAU
100%甲醇
A, B, C, D, E,
Si g=254,10 Si g=230,10 Si g=210,10 Si g=320,10 Si g=280,10
Ref=360,10 Ref=360,10 Ref=360,10 Ref=360,10 Ref=360,10
使 用 目 的
分析型HPLC 制备型HPLC
分析型HPLC
制备型HPLC
分析HPLC与制备HPLC比较
分析HPLC
色谱柱 柱内径1~5mm
制备HPLC
柱内径1~10mm（或更 大） 尽可能加大进样量 纯品的制备，只对一种 或几种样品组分感兴趣。 分析HPLC确定条件后 VWD单波长检测即可
进样量
DA D1 DA D1 DA D1 DA D1 mA U
薄层板
固定相：硅胶为使用最广泛的薄层材料。
除此之外还有氧化铝、硅藻土等。
常用薄层硅胶的特征：
硅胶商品名 称 硅胶H 硅胶G 硅胶GF254 黏合剂 无 有 有 荧光添加剂 无 无 有 应用 薄层色谱，柱色谱 薄层色谱，柱色谱 在254nm紫外灯下看荧光
薄层板的制备方法
湿法：平铺法和涂铺法。
薄层色谱分类
洗脱
声搅拌，调成混悬液，打开柱子下端活塞，徐徐将混悬液 倒入柱子，使洗脱剂慢慢流出，带动硅胶缓慢沉于柱的下 端。待加完吸附剂后，继续使洗脱剂流出，直到硅胶的沉 降不再变动。注意整个操作过程要慢慢进行，不要将气泡 压入硅胶中，而且要始终保持吸附剂上端有溶剂，切勿流 干。最后在硅胶上面加少许棉花，将多余洗脱剂放出至上 面保持有1cm高液面为止，关上活塞。
样品的收集
切割：用刮刀刮下带有样品的吸附剂。 回收：将刮下的吸附剂装入玻璃柱中，用 极性尽可能低的溶剂洗脱，丙酮和氯仿常 用。
TLC的特点 方法简便易行,价格低廉； 分析快速；
检出灵敏度高；
分离能力强；
检测手段多样化；
应用广泛；
二
柱 色 谱
柱色谱
硅胶柱色谱
凝胶柱色谱
ODS柱色谱
（三）大孔树脂柱色谱
1 原理：
大孔树脂为新型非离子型分子聚合物吸附剂， 白色球形颗粒，每个颗粒都是由许多彼此间存在 孔穴的微观小球组成，称之为“大孔”。 大孔树脂色谱是以大孔树脂为吸附剂，利用 其对不同成分的选择性吸附和筛选作用，通过选 用适宜的吸附和解析条件以分离、提纯某一或某 一类化合物的色谱。 可分为极性、中极性、非极性三大类，根据 分离物质极性的大小，通过所选择的与之相适应 的大孔树脂的选择性吸附而达到分离目的。
大孔树脂柱色谱
(一)硅胶柱色谱
1 原理：
根据物质在硅胶柱上的吸附力不同而分离。
一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性
较弱的物质不易被硅胶吸附。流动相流过时各组 分以不同的速率向下移动，吸附弱的组分随着流 动相移动在前面，吸附强的组分移动在后面，各 种化合物在色谱柱中形成带状分布，实现化合物
的分离。
3 操作步骤
预处理
乙醇浸泡24h ，充分溶胀→湿法装柱，用乙醇洗至流出液加等 量蒸馏水无白色浑浊 →蒸馏水洗至无醇味且水液澄清。 将样品溶于少量水中，以一定的流速加到柱的上端进行吸附。 上样液以澄清为好，上样前要配合一定的处理工作，如上样液 的预先沉淀、滤过处理、PH调节，使部分杂质在处理过程中 除去，以免堵塞树脂床或在洗脱中混入成品。
（一） HPLC工作原理
检测过程是非破坏性的，经过检测的洗提液可以依次 收集起来，制成纯品，供进一步化学定性和结构鉴定。
液相色谱柱分类 正相柱：以硅胶为填料。或者硅胶表面键合CN,-NH2等官能团。
反相柱：以硅胶为基质，在其表面键合碳十 八（ODS） 、碳八、碳四等官能团的非极 性填料。
（二） HPLC分类
苯
氯仿 乙醚 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 甲醇 水 乙酸 极 性 增 强
常用展开剂体系 一元：石油醚，甲醇 等。 二元：石油醚：丙酮，石油醚：乙酸乙酯， 氯仿：甲醇 等。 三元：氯仿：甲醇：水 等。
2 展开
应注意：
a 展开剂不淹没样点。 b 薄层板呈倾斜状。 C 展开过程应在密闭容器中进 行。 d 展开剂前沿上升到一定高度 时取出，尽快标出展开剂前 沿位置，以便计算Rf值。
•打开色谱柱下端活塞，控制流速， 等份收集洗脱液，也可用自动收 集器收集。 •通过上端加压或者下端减压可以 提高洗脱速度，但是可能会降低 塔板数影响分离效果。
洗脱
检测
合并
3 操作步骤
装柱
加样
洗脱
检测
每份洗脱液采用薄层色谱法检查。
合并
3 操作步骤
装柱
加样
洗脱
检测 成分相同（斑点相同）的洗 脱液合并，回收溶剂。
现代色谱分离技术
中国海洋大学医药学院 海洋药物教育部重点实验室
李国强
For 博兴京博控股股份有限公司
2011-12-20
主要内容
1 薄层色谱（TLC） 柱色谱（CC） 高效液相色谱（HPLC）
2
3
一
薄 层 色 谱
引言
薄层色谱(Thin Layer Chromatography)，又称薄层层析，常用TLC表示。 将固定相在玻璃、金属或塑料等光洁的 表面上均匀的铺成薄层，试样点在薄层的一 端，流动相借毛细作用流经固定相，使被分 离的物质展开。 •固定相：吸附剂。 •流动相：展开剂。 •分离原理：吸附与解吸附。
(二)制备薄层色谱（PTLC）
用于制备的薄层色谱。
特点： 1 较分析薄层样品液的浓度大。 2 板较大，较厚（吸附剂用量多） 3 点样多点成直线。
样品的检测
有色物质直接观察斑点。
荧光物质紫外灯下观察。 如必须采用化学试剂显色时，可将薄层板的大部分用另一块 玻璃板盖住，留出一条进行显色，将需要的部分作出记号。
ODS(octadecyl bonded silica) , 十八烷基键合硅胶，是以硅胶为基质 键合的C18填料, ODS适用于分离中等 偏大的化合物。
与HPLC不同，开放式ODS是将ODS 装入玻璃柱内，不加压或者用加压泵 加压。
2 操作步骤
装柱
上样
洗脱
•将ODS用甲醇浸 泡，具体装柱方法 与硅胶柱相同。 •用甲醇装柱完成 后，置换成起始流 动相系统。
(ZHY \11051001.D) (ZHY \11051001.D) (ZHY \11051001.D) (ZHY \11051001.D) (ZHY \11051001.D)
YMC C18
2500
2000
1500
1000
500
0
0DA D1 A , S i g=254,10 Ref=360,10 (ZHY \11051004.D) 10 5
合并
1 2 3 4 5 6
7
小极性的组分先被洗脱下来 大极性组分后被洗脱下来
（二）凝胶柱层析
1 原理
2 凝胶层析中常用的凝胶
葡聚糖凝胶 （Sephadex）
聚丙烯酰胺凝胶
琼脂糖凝胶
3 凝胶柱的使用
溶胀 装 柱 上 样
洗脱
湿法上样： 将层析柱垂直固定在铁架上，打开柱下口开关。将溶胀好 羟丙基葡聚糖凝胶（Sephadex LH-20）为干粉，装柱前 打开层析柱的下口开关，放出凝胶柱面上的多余溶液， 的凝胶放在烧杯中，使凝胶表面的水层与凝胶体积相等。 量好柱体积，再根据凝胶的吸水量计算干重， 称重后足 •控制流速，过快或过慢影响分离效果。 使液面与凝胶表面相平齐。 用玻璃棒搅匀凝胶液，顺玻璃棒灌入柱内。此时柱下口一 量用有机溶剂（常用氯仿：甲醇=1：1）溶胀。 边排水，上口一边加入搅匀的凝胶，可见凝胶连续均匀地 将样品加在凝胶表面，打开下口开关，控制流速，使样 •流出液分步收集，分析、合并。 品慢慢渗入凝胶内。当慢慢渗入凝胶的样品溶液面与凝胶柱 沉降，逐步形成凝胶柱。当到达所需凝胶高度时，立即关 闭下口，使凝胶完全沉降。 面相平齐时，关闭下口，完成上样。然后在凝胶柱面上加一 层（3—5cm）洗脱液，接上洗脱瓶准备洗脱。
3 定位与显色
展开后将溶剂吹干。 常见的定位方法：
光学检出法
254nm，365nm（使用方便，被检测物不易被破
坏）
蒸气检出法
展开剂挥发干净后放入储有晶体碘并充满碘蒸气的密闭 容器中，放置一段时间后取出薄层板，标出斑点位置。
试剂检出法
利用化学试剂与被测物质斑点在薄层板上发生化学反应 通用显色剂：10%硫酸乙醇、茴香醛、香草醛。
使 用 目 的
定性薄层色谱 制备薄层色谱
（一）定性薄层色谱
点 样
展 开
定位与显色
1 点样
样品溶解：用甲醇、氯仿、石油醚、丙酮等挥发性有机溶 剂，最好选用与展开剂极性相似的溶剂。
点样工具：玻璃毛细管，微量点样器。
点样量：与薄层的厚度、吸附剂的种类、显色剂的灵敏度 等因素有关，若因样品溶液太稀，可重复点样。
•湿法：用起始流 动相溶解样品装柱 。 •干法：对于一些 溶解性较差的样品 ，用挥发性溶剂拌 入ODS中，挥干 溶剂。
•常用梯度洗脱： 10%甲醇/水→ 30%甲醇/水→ 50%甲醇/水→ 70%甲醇/水→ 90%甲醇/水→ 100%甲醇。 •根据样品情况细分 调整。
三
高效液相色谱
引 言
以液体为流动相的色谱法称为液相色谱 法。HPLC是以经典的液相柱色谱为基础，流 动相改为高压输送，采用高效固定相及在线 检测等手段，发展而成的分离分析方法。该 法具有分离效能高、分析速度快及仪器化等 特点，因而称为高效液相色谱法。
上样
洗脱
一般先用水洗，再用梯度递增的乙醇溶液进行洗脱，并控制洗 脱液的用量与流速，使提取液由上而下通过树脂柱。收集、合 并洗脱液，减压蒸馏，回收溶剂至干，低温真空干燥，得精制 产品。 95%乙醇洗脱至无色，再用2%盐酸浸泡，用水洗至中性， 再用2%NaOH浸泡，再用水洗至中性。
再生
(四) ODS反相柱层析 1填料: