蛋白提取步骤

提蛋白及WB得步骤

整个过程细胞或蛋白都必须放冰上

准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、

当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。6ｍl离心

管、细胞刮板、开低温高速离心机

细胞裂解液配制:

1ml celｌlｙsis

10ul NP－40(离心机后)

25ul 焦磷酸钠

４0ul ＮaＦ

1ul β—甘油磷酸

2 ul Na3VO４

1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱)

10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒)

细胞裂解与收集

1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻

摇),倾斜贴壁吸走PBS。

2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。１ml ),冰上静置１-２min。

3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从

上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、

细胞破碎

4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。(超声波破碎仪得铁棒不要碰到

离心管得壁与底部)

超声波设置:

工作功率5% 工作时间３min

开机时间15s,关机时间３０s

温度０度,

报警温度1度

5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,)

蛋白保存

6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。-80℃保

存。

注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。样品处理超过１ｈ,补加一次。

ＢCA测定蛋白浓度

1、测空白板,选差异较小得孔。

BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595

2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。

取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS

4、样品蛋白稀释2０倍:2ul蛋白+18ｕl PBＳ

5、配BCA:每个孔200uｌ,一个样品2个重复,Ａ:Ｂ＝５０:1,根据样品数来计算BＣA得用量,

一般防止损耗,多算一个样。

6、加BCA:悬空加、３7℃孵育30 miｎ。(手不能碰板得底部,影响测定结果)

7、计时30min

8、配分离胶,灌胶,加水封。

9、计时2０min。

10、测蛋白:先振板、再设置参数。

11、计算上样体积:

12、配浓缩胶,灌胶,加梳子,等1—２ｍin,出现缩胶得地方补上。

13、打开干式加热器

10、蛋白质上样:根据计算结果乘以稀释倍数,算出蛋白浓度,以体积最大得为准,其她用水补足。

(最大上样量为20ｕl,除去buffｅｒ得体积,蛋白质最大上样体积为16ul)

标记0.6mｌ离心管

加样顺序:水、ｂuffer(１/４)、蛋白、离心—涡旋－离心。100℃变性10miｎ(迅速,确保变性程度一致)

11、计时10min ,变性１０ｍｉn。

12、安装电泳槽:

电泳液(１Ｘ):配制:90ml(１0X)+8１０ml水(只能用一次)

液面刚覆盖胶,不能有气泡。

1３、上样:ｍaker 上样量为3uｌ。依次上样(吸样品时最好一次吸完)枪头不能撬板,笔直打进去

１4、电泳

分离胶10０V,２0mｉn左右、条带都跑开即可。

浓缩胶14５V 1h 有等紫色部分跑到底结束。

转膜

准备工作:转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、ＰVDF膜

ＰＶDＦ膜用之前用甲醇浸泡数秒。

用海绵与滤纸之前先浸湿、

转膜:负极(黑板)海绵—三层滤纸－胶-PVDＦ膜—三层滤纸—海绵－正极(白板)、

三层滤纸与膜都需要赶气泡。

安装转移槽:加转子、冰盒,安装时夹子面朝上

15、转膜电压１00V 90min。(视蛋白大小而定,蛋白分子小得可适当缩短时间)

１６、取膜晾干、剪个角作为标记,保鲜膜保存４℃。

孵育抗体

1、膜得活化:把膜晾干,甲醛浸泡(回收)膜数秒、无菌水洗3次、TBST洗２次。

2、封闭:配封闭液:３％得牛奶:4ｍl TBSＴ+ 0、12ｇ脱脂奶粉,混匀、涡旋。

3、4℃封闭一小时、盖盖子。

4、TBSＴ洗三次、每次１0 min 。(封闭液与一抗相同则不用洗)

5、一抗孵育:加一抗,1:100０(比例视情况定)、密封孵育、盖盖子。

6、4℃过夜孵育。

7、回收一抗(回收到对应得离心管,立即放回4℃冰箱)

8、TBST洗三次、每次1０mｉn、

9、二抗孵育:加二抗,室温孵育１h。

１0、回收二抗,TBST洗3次,每次１0 ｍｉn(最后一次不要倒掉)(可以准备洗膜用得东西:检查显影液就是否能用)

显影

１1。准备显影得东西:显影液、镊子、剪刀、光片、保鲜膜、计时器、

配发光液:Ａ:B 1:1、放小黑屋里、剪好保鲜膜、铺在板上,做好准备。

1２、最后一次TBＳT洗完后,拿到小黑屋,关门、开红灯。

13、先剪X光片、右上角做个记号(位置瞧个人习惯),

14、将膜上得液体吸干(卫生纸上稍微吸干),放板上,定一个3min 计时器,加上发光液,开始计时、观察发光现象,当瞧到发光时,压片。

１5。压片:将膜反扣在保鲜膜上,不能产生气泡、每次压片都记时,先从２min开始。

1５、压片结束后,放在显影液里,轻轻摇晃至瞧到条带,用镊子夹至水中浸泡,清洗数秒,再放置定影液内、

16.等膜洗完后,拿至外间,用自来水清洗光片,晾干。