蛋白提取步骤
提蛋白质的原理及步骤
蛋白质提取是一项基础实验，通常用于从组织或细胞中提取纯度较高的蛋白质样品，以便进行各种蛋白质研究。
常规的蛋白质提取步骤包括以下几个主要步骤：
1. 细胞或组织的裂解：将待提取的样品裂解以释放出蛋白质。
裂解方法取决于被裂解的细胞类型，可使用机械法、化学法、超声波或高压等方法进行裂解。
2. 蛋白质的分离：将蛋白质与非蛋白质组分进行分离，常用的方法有沉淀、过滤、离心和柱层析等。
3. 蛋白质的纯化：通过进一步的分离和纯化来获得高纯度的蛋白质。
这些步骤通常需要进行多次，每次都使用不同的方法来分离和纯化蛋白质。
提蛋白质的原理是基于蛋白质的化学和物理特性进行分离和纯化。
蛋白质分子量大小、电荷、亲水性等特性不同，容易与不同化学试剂、柱层析介质或生物酶相互作用。
通过调节这些条件和步骤，就可以使不同的蛋白质与其它组分分离出来，并得到纯度较高的蛋白质样品。
虽然蛋白质提取步骤较多，但因为各种蛋白质的特性不同，所以实验时需要根据需要选择不同的提取和分离方法以获得更理想的效果。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤引言：WB蛋白提取是一种常用的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
本文将详细介绍WB蛋白提取的步骤，包括细胞裂解、蛋白质提取、浓缩和检测等关键步骤。
一、细胞裂解细胞裂解是WB蛋白提取的第一步，旨在破坏细胞膜、细胞核膜以及其他细胞组分，释放出目标蛋白质。
常用的细胞裂解方法有机械法、化学法和生物学方法等。
其中，最常用的方法是使用细胞裂解缓冲液，通过冷冻-解冻或超声波等方式破坏细胞结构。
二、蛋白质提取蛋白质提取是WB蛋白提取的关键步骤之一。
在细胞裂解后，目标蛋白质以及其他细胞组分被释放到裂解液中。
为了提取目标蛋白质，需要将裂解液进行离心，分离出上清液。
上清液中含有目标蛋白质，可以用于后续的蛋白质浓缩和检测。
三、蛋白质浓缩蛋白质浓缩是WB蛋白提取的重要步骤之一，旨在提高目标蛋白质的浓度，便于后续的蛋白质检测。
常用的蛋白质浓缩方法有醋酸沉淀法、酒精沉淀法和尿素沉淀法等。
在浓缩过程中需要注意控制温度和pH值，以避免蛋白质的降解和聚集。
四、蛋白质检测蛋白质检测是WB蛋白提取的最后一步，用于确定提取的蛋白质是否含有目标蛋白以及其相对丰度。
常用的蛋白质检测方法有SDS-PAGE和免疫印迹等。
其中，SDS-PAGE是一种分离蛋白质的电泳方法，可以根据蛋白质的分子量将其分离成不同的条带；免疫印迹则是通过特异性抗体与目标蛋白质结合，然后使用酶标记的二抗进行检测。
总结：WB蛋白提取是一种重要的实验技术，用于研究蛋白质的表达及其相互作用。
其步骤包括细胞裂解、蛋白质提取、蛋白质浓缩和蛋白质检测等。
通过合理选择和操作这些步骤，可以获得高质量的蛋白提取物，为后续的蛋白质研究提供可靠的基础。
参考文献：[1] Bustin SA, Benes V, Garson JA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009;55(4):611-622.[2] Towbin H, Staehelin T, Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A.1979;76(9):4350-4354.[3] Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤:1、细胞总蛋白提取A对于悬浮细胞：离心收集细胞，每106细胞加250 Ul RlPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B对于贴壁细胞：a用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b加入适当体积的RIPA （使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min,期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C 12000g离心5min,收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80 C 冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200 μ l ）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80 C短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20 C保存，避免反复精品佳作，安心下载，放心使用冻融。
遇到失意伤心事，多想有一个懂你的人来指点迷津，因他懂你，会以我心，换你心，站在你的位置上思虑，为你排优解难。
一个人，来这世间，必须懂得一些人情事理，才能不断成长。
就像躬耕于陇亩的农人，必须懂得土地与种子的情怀，才能有所收获。
一个女子，一生所求，莫过于找到一个懂她的人，执手白头，相伴终老。
蛋白提取步骤
蛋白提取步骤准备裂解液、蛋白酶抑制剂。
1、取2mlEP管加入500ul裂解液（已加入蛋白酶抑制剂）2、取0.1g组织，充分剪碎后加入研磨器中，加入适量液氮，将组织研成粉末状。
3、将研磨后的组织转至加有裂解液的2mlEP管中。
4、冰上超声（超声3s，停6s）共计20个循环，30%能量。
5、冰上静置30min，每10min震荡1次。
6、12000rpm，4℃离心30min。
7、收集上清，测浓度后-70℃保存。
8、煮蛋白时加5微升上样缓冲液。
2．培养的细胞（定量）：⑴去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
⑵加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
⑶用细胞刮刮下细胞，收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
⑷12000g离心，4℃，2min。
⑸取少量上清进行定量。
⑹将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃1~2天，每次上样前98℃，3min。
3．组织：⑴匀浆对于心肝脾肾等组织可每50~100mg加1ml裂解液，肺100~200mg加1ml 裂解液。
可手动或电动匀浆。
注意尽量保持低温，快速匀浆。
⑵ 12000g离心，4℃，2min。
⑶取少量上清进行定量。
⑷将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
wb细胞蛋白提取步骤
wb细胞蛋白提取步骤一、背景介绍WB（Western Blot）是一种常用的蛋白质分析方法，通过将蛋白质样品经电泳分离后转移到膜上，再与特异性抗体反应并检测，从而确定目标蛋白的存在与表达水平。
而WB细胞蛋白提取是WB实验的前提，本文将介绍WB细胞蛋白提取的步骤。
二、实验器材准备1. 细胞培养器：细胞培养器是培养细胞的必备设备，可提供适宜的温度、湿度和CO2浓度等环境条件。
2. 细胞离心管：用于离心细胞，分离细胞上清液和细胞沉淀。
3. 细胞裂解液：细胞裂解液是提取细胞蛋白的重要试剂，可选择RIPA缓冲液等。
4. 低温冰箱：用于保存试剂和细胞裂解液等在实验过程中需要低温保存的物品。
5. 离心机：用于离心细胞、沉淀蛋白等。
三、细胞样品准备1. 细胞培养：将需要研究的细胞株在无菌条件下培养至对数生长期。
2. 细胞收集：用PBS等缓冲液洗涤细胞，使细胞悬浮液中不含有培养基或其他杂质。
3. 细胞裂解：将细胞悬浮液加入细胞裂解液中，用震荡器或超声波仪器进行细胞裂解。
四、细胞蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞裂解液和细胞悬浮液混合，通过震荡器或超声波仪器进行细胞裂解，破坏细胞膜释放细胞内的蛋白质。
2. 离心：将细胞裂解液离心，分离出细胞碎片和细胞膜等残留物，得到上清液。
3. 蛋白含量测定：使用BCA或Bradford方法等，测定提取的蛋白液中的蛋白质浓度，以便后续实验的样品配比。
4. 储存：将提取的蛋白液分装成适量的小管，存放在低温冰箱中保存，避免蛋白质降解和污染。
五、质检和实验准备1. SDS-PAGE凝胶制备：根据需要分离的蛋白质大小，选择合适的凝胶浓度，制备SDS-PAGE凝胶。
2. SDS-PAGE电泳：将提取的蛋白液按照浓度进行加载，进行电泳分离。
3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质转移到PVDF或nitrocellulose膜上，使蛋白质固定在膜上。
4. 阻断：将转膜后的膜放入蛋白质阻断液中，阻断膜上未结合的部分空位。
ripa蛋白提取方法
ripa蛋白提取方法RIPA蛋白提取方法引言蛋白质是细胞中重要的分子组成部分，它们在细胞的结构和功能中发挥着关键作用。
为了研究蛋白质的功能和相互作用，科学家们经常需要从细胞中提取蛋白质。
RIPA（Radioimmunoprecipitation Assay）蛋白提取方法是一种常用的提取方法，本文将详细介绍该方法的步骤和注意事项。
材料和试剂1. RIPA缓冲液：包含盐、洗涤剂和缓冲剂，用于细胞裂解和蛋白质溶解。
2. 蛋白酶抑制剂：用于保护蛋白质免受降解。
3. 磷酸盐缓冲液：用于洗涤和溶解蛋白质。
4. 加热样品缓冲液：用于处理蛋白质样品。
步骤1. 收集细胞：将需要提取蛋白质的细胞收集到离心管中，可以通过离心将细胞沉淀下来。
2. 细胞裂解：向细胞中加入适量的RIPA缓冲液，使用离心机将细胞裂解开。
3. 离心：将裂解后的细胞上清液离心，以去除细胞碎片和其他杂质。
4. 收集上清液：将离心后的上清液转移到新的离心管中，这是含有蛋白质的部分。
5. 添加蛋白酶抑制剂：在上清液中添加适量的蛋白酶抑制剂，以避免蛋白质的降解。
6. 震荡和冷藏：将上清液和蛋白酶抑制剂混合均匀，并在4摄氏度下冷藏片刻。
7. 离心：将上清液离心，以去除任何未溶解的细胞碎片或沉淀。
8. 收集上清液：将离心后的上清液转移到新的离心管中，这是蛋白质的最终提取物。
9. 加热样品：将提取的蛋白质样品加入加热样品缓冲液中，进行蛋白质的加热处理。
注意事项1. 所有的操作应该在冷藏条件下进行，以避免蛋白质的降解。
2. 所有使用的器皿和工具都应该事先冷藏，以保持低温状态。
3. 在细胞裂解和上清液收集过程中，应尽量避免氧气的接触，以减少氧化反应对蛋白质的影响。
4. 在加热样品的过程中，应控制好加热时间和温度，以避免蛋白质的降解或变性。
总结RIPA蛋白提取方法是一种常用且有效的蛋白质提取方法。
通过细胞裂解和离心等步骤，可以得到含有蛋白质的上清液。
在提取过程中，需要注意保持低温、避免氧化和控制加热条件，以保证蛋白质的完整性和稳定性。
蛋白提取及WB步骤
Western blot 实验1）蛋白裂解液的配制:Urea（7 M）4.2 g，Thiourea（2 M）1.52 g，CHAPS（4% W/V）0.4 g，DTT （1% W/V）0.1 g，ddH2O加至10 ml，1 ml/管分装-20℃保存备用；1 ml分装的裂解液中用前加入Cocktail（1% V/V）10 μl，混匀后于冰上放置备用。
我们用的是国产的碧云天的全蛋白提取试剂盒2）蛋白样品制备（1）取组织，称重，按照W:V = 1:6的比例加入蛋白裂解液；（2）用匀浆器对组织进行匀浆，匀成糊状。
（3）4 ℃，冰上放置30min，每10 min振荡一次；（4）4 ℃，12000 g 离心30 min，吸上清，分装置于-70 ℃待用。
3）蛋白浓度测定（Bradford法）试剂配制：考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝G250 0.05 g，95%乙醇25 ml，H3PO4 50 ml，ddH2O加至500 ml，过滤后储存于4 ℃。
牛血清白蛋白（BSA）：1 mg/ml步骤：按下列体系配置溶液，混匀后，静置5 min后，测OD值（波长595 nm），将OD值输入Excel进行数据处理，计算出相关系数，当相关系数>0.99才具有可信度。
取待测标本，正确设置reference，取适量标本，进行浓度测定。
管号BSA（1 mg/ml）0.9% NaCl/0.1 M PBS 考染液0 0 200 μl 1 ml1 5 195 μl 1 ml2 10 190 μl 1 ml3 15 185 μl 1 ml4 20 180 μl 1 ml5 25 175 μl 1 ml我们用的是国产碧云天的BCA蛋白浓度测定试剂盒。
4）聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）（1）凝胶制备：30.8%丙烯酰胺：丙烯酰胺30 g，甲叉双丙烯酰胺0.8 g，ddH2O加至100 ml，置于通风橱内搅拌直至丙烯酰胺完全溶解，用0.45 μm微孔滤膜过滤后4 ℃保存于棕色瓶中备用。
组织蛋白提取步骤
组织蛋白提取步骤标题：组织蛋白提取步骤：从样本收集到蛋白质溶解的全面解析引言：组织蛋白提取是生物学和生物化学领域中非常重要的实验步骤之一。
它是为了研究组织中的蛋白质表达、功能和相互作用而必不可少的前提。
本文将从样本收集到蛋白质溶解的全过程，详细介绍组织蛋白提取的步骤和要点，旨在帮助读者更全面、深入地了解该领域的相关内容。
第一部分：样本收集与处理1.1 样本预处理：在进行组织蛋白提取前，首先需要进行样本预处理。
这包括以无菌的方法收集样本，如组织切片、细胞培养等，同时需避免样本受到污染和降解。
1.2 样本保存：为了保持蛋白质的完整性和稳定性，样本应尽快保存在适当的温度下，如低温或液氮中。
选择合适的保存缓冲液也是至关重要的。
第二部分：样品裂解与溶解2.1 细胞破碎：细胞破碎是为了破坏细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
可以选择化学法、物理法或酶解法等方法进行细胞破碎，其中磁珠法和超声法是常用的技术。
2.2 组织破碎：与细胞破碎类似，组织破碎旨在释放组织内的蛋白质。
取决于样本特性，可以使用搅拌器、研钵、超声或高压等方式进行组织破碎。
2.3 组织裂解：组织裂解是将细胞或组织中的蛋白质从细胞核、细胞器等结构中溶解出来。
常用的方法有机械法、酸法、碱法以及使用细胞裂解液等。
具体的选择取决于研究的目的和样本特性。
2.4 蛋白质溶解：蛋白质溶解是将裂解后的蛋白质完全溶解于适当的缓冲液中，以便后续的实验操作，如电泳、质谱等。
在溶解过程中，需要注意取决于蛋白特性而添加的表面活性剂、螯合剂和保护剂。
第三部分：总结与回顾在本文中，我们详细介绍了组织蛋白提取的各个步骤。
我们强调了样本收集和处理的重要性，包括样本预处理和正确的保存方法。
我们着重介绍了细胞破碎和组织破碎的常用方法。
我们强调了组织裂解和蛋白质溶解的关键环节。
通过了解和掌握这些关键步骤，我们可以更好地提取和保护样本中的蛋白质，为后续的实验操作提供高质量的样品。
这对于研究蛋白质组学、蛋白质功能研究以及药物研发等领域都具有重要意义。
蛋白提取实验步骤
蛋白提取实验步骤：1、细胞总蛋白提取A、对于悬浮细胞: 离心收集细胞，每106细胞加250 ul RIPA （在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂），振荡。
如果需要提高蛋白浓度，可以适当减少细胞总蛋白提取试剂体积。
B、对于贴壁细胞:a、用TBS冲洗细胞2-3次。
最后一次彻底吸干残留液。
b、加入适当体积的 RIPA（使用前数分内加入蛋白酶抑制剂）于培养板、瓶内3-5分钟。
期间反复晃动培养板、瓶，使试剂与细胞充分接触。
c、用细胞刮刀将细胞及试剂刮下，收集到1.5ml离心管中。
C、冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
D、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
2、组织蛋白提取：A、组织块用冷TBS洗涤2-3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器。
加入10倍组织体积本试剂（使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂）冰上彻底匀浆。
如果需要提高蛋白浓度，可以适量减少该试剂体积。
B、将匀浆液转移至1.5ml离心管中，振荡。
冰浴30min，期间用移液器反复吹打，确保细胞完全裂解。
C、12000g离心5min，收集上清，即为总蛋白溶液。
1、组织尽可能新鲜，若不能及时提蛋白，组织标本应保存在-80℃冰箱，并避免反复冻融。
2、全程必须在冰上进行，避免蛋白降解。
3、蛋白酶抑制剂在水溶液中不稳定，需在RIPA使用前数分钟加入蛋白酶抑制剂。
4、裂解过程中如有溶液粘稠现象可用移液器（200μl）反复吹打，或再加入适量裂解液以保证充分裂解。
5、总蛋白溶液不稳定（蛋白酶依旧有活性）可在-80℃短时间保存，建议立即加入蛋白上样缓冲液变性后与-20℃保存，避免反复冻融。
（注：文档可能无法思考全面，请浏览后下载，供参考。
可复制、编制，期待你的好评与关注）。
蛋白提取步骤
提蛋白及WB得步骤整个过程细胞或蛋白都必须放冰上准备工作：前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、当天准备:洗玻璃板、开紫外，冰块、碎冰、标记1、5ｍl 离心管及0、6ml离心管、细胞刮板、开低温高速离心机细胞裂解液配制:1ml cｅll lysｉs10ul NP-40（离心机后)25uｌ焦磷酸钠４0uｌNaF１ul β-甘油磷酸2 ul Na3VO41ul 蛋白酶抑制剂（用完即放回冰箱)１0ul PＭSF(最后加，随加随用,有毒）细胞裂解与收集1.观察细胞状态,并准备提蛋白：吸走培养基、用ＰＢS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBＳ，左右轻轻摇)，倾斜贴壁吸走ＰＢS。
2.将细胞盘拿到外间冰上，加裂解液（体积网上推荐:一般1０6加0、1mｌ），冰上静置1-2ｍｉn。
3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从上往下全面刮，(刮得时候要迅速），最后用枪吸取裂解液至离心管.细胞破碎4.超声波破碎细胞：准备三个小烧杯，加满冰块,三个小夹子。
(超声波破碎仪得铁棒不要碰到离心管得壁与底部）超声波设置:工作功率5％工作时间3min开机时间15ｓ,关机时间３０s温度０度,报警温度1度5.４℃、1300０ｒ／ｍin,离心15min。
(离心机用后一直保持打开得状态,）蛋白保存6.蛋白保存及分装:吸上清液至０、6ml离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。
—80℃保存。
注意事项：PＭSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30ｍin内就会降解一半.样品处理超过1ｈ，补加一次。
BCA测定蛋白浓度1、测空白板，选差异较小得孔。
BCA测定法波长570,Bｒacfｏrd:5952、标准蛋白得稀释(5mg/uｌ):分装1ml PBＳ来使用,稀释标准蛋白至０、5mg/ul。
取5uｌ标准蛋白＋45ul PBS5、配BCA：每个孔２００ul，一个样品2个重复，Ａ:B=５0：１，根据样品数来计算BCA得用量，一般防止损耗,多算一个样。
蛋白提取步骤
碧云天裂解液
对于培养细胞样品：
1. 融解RIPA裂解液，混匀。
取适当量的裂解液，在使用前数分钟
内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
(PMSF水中不稳定，60分钟完全降解，若实验超过60分钟，应补加PMSF)。
2. 对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液
洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。
按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。
用枪吹打数下（或者用细胞刮），使裂解液和细胞充分接触。
通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。
对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。
按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。
再用手指轻弹以充分裂解细胞。
充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。
如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。
3. 充分裂解后，10000-14000g 4℃离心10分钟，取上清，即可进
行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
wb蛋白提取步骤
wb蛋白提取步骤WB蛋白提取步骤一、引言WB（Western Blot）蛋白提取是一种常用的蛋白质分析方法，通过将样品中的蛋白质分离、定量和检测，可以研究蛋白质的表达水平、功能和相互作用等。
本文将介绍WB蛋白提取的步骤及操作要点。
二、样品准备1. 收集样品：根据研究目的，选择合适的样品进行提取。
样品可以是细胞、组织、血清、培养基等。
2. 样品处理：对于细胞和组织样品，可先用PBS缓冲液洗涤去除残留的培养基或组织液。
对于血清样品，可离心去除悬浮的细胞或血小板。
三、蛋白提取1. 细胞裂解：将细胞沉淀离心后，加入细胞裂解液，使细胞膜破裂释放蛋白质。
可以选择不同的细胞裂解液，如RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。
2. 组织裂解：将组织样品切碎后，加入组织裂解液，将组织细胞破碎并释放蛋白质。
组织裂解液可以选择RIPA缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。
3. 蛋白质提取：将裂解液离心，收集上清液，即为蛋白提取物。
可以通过BCA方法或Lowry方法等测定蛋白质的浓度。
四、蛋白质分离与检测1. SDS-PAGE凝胶电泳：将蛋白样品加热变性，然后加载到凝胶孔中，施加电场使蛋白质在凝胶中进行分离。
常用的凝胶浓度为8%~15%。
2. 转膜：将凝胶中的蛋白质转移到膜上，常用的转膜方法有湿式转膜和半干式转膜。
常用的膜材料有PVDF膜和NC膜。
3. 阻断与孵育：将转膜后的膜放入阻断液中进行孵育，阻断非特异性结合位点，避免假阳性结果的产生。
4. 一抗和二抗孵育：将目标蛋白特异性抗体（一抗）孵育于膜上，然后孵育与一抗结合的二抗，二抗中带有标记物，例如辣根过氧化物酶（HRP）等。
5. 显色与成像：使用化学发光法或染色法，使膜上特定蛋白质形成显色带，然后使用成像系统进行成像和分析。
五、结果分析通过观察显色带的位置和强度，可以初步判断蛋白质的表达水平。
根据需要可以进行定量分析，使用专业软件测量带的强度，并与内参蛋白进行比较分析。
六、注意事项1. 样品保存：样品提取后应及时保存，避免蛋白质降解。
血清中蛋白提取方法
血清中蛋白提取方法血清中蛋白提取方法引言：血清中蛋白质的提取是生物化学和生物医学研究中非常重要的步骤之一。
血清中蕴含着丰富的信息，包括生物标志物、生长因子和激素等，这些成分对于研究疾病的发生机制以及诊断和治疗具有重要意义。
本文将介绍一些常用的血清中蛋白提取方法，帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
一、盐析法盐析法是一种常用的分离和富集蛋白质的方法。
该方法通过在高盐浓度下使蛋白质发生沉淀，实现了与其他杂质的分离。
具体步骤如下：1. 准备工作：在试管中加入一定量的样品血清，并加入适量的盐溶液（如氯化铵溶液）。
2. 混匀：用试管摇床等设备将样品充分混匀，使盐溶液与血清充分接触。
3. 沉淀：将试管置于低温环境（如冰浴或低温离心机中）进行沉淀。
此时，沉淀的是蛋白质，而其他大部分成分仍溶于上清液中。
4. 离心：使用高速离心机将试管进行离心，离心速度和时间可根据样品的具体情况进行调整。
5. 分离：将上清液倒入新的试管中，留下的沉淀即为富含蛋白质的组分。
二、电泳方法电泳方法是一种常用的蛋白质分离和富集技术。
通过在电场的作用下，根据蛋白质的大小和电荷差异将其分离。
以下是一种常见的电泳方法：1. 准备样品：将一定量的血清样品进行处理，如去除脂肪和其他杂质。
2. 电泳凝胶：制备聚丙烯酰胺凝胶，并根据需要选择合适的凝胶浓度和孔径大小。
3. 样品加载：将样品血清溶液加载到凝胶孔中。
4. 电泳操作：将电泳装置连接到电源，并设定适当的电场强度和时间。
5. 分析和分离：在电泳运行后，通过染色或质谱等方法对蛋白带进行观察和分析，以确定所需蛋白质的位置。
三、亲和层析法亲和层析法是一种基于蛋白质与特定配体的亲和作用进行分离和富集的方法。
以下是该方法的一般步骤：1. 准备亲和层析柱：将具有亲和性的配体固定在柱子内部。
2. 样品准备：将血清样品进行前处理，如去除异物和杂质。
3. 样品加载：将经处理的血清样品加载到亲和层析柱中。
4. 洗脱：通过更改溶液条件或引入特定的试剂，洗脱所需的蛋白质。
细胞蛋白提取步骤
细胞蛋白提取步骤
细胞蛋白提取是为了获取细胞中的可溶性蛋白质，以进行后续的分析和研究。
以下是一般的细胞蛋白提取步骤：
1. 细胞采集：选择需要提取蛋白的细胞种类，并通过离心等方法将细胞收集。
2. 细胞裂解：将细胞使用裂解缓冲液裂解，以释放细胞内的蛋白质。
常见的裂解缓冲液包括RIPA缓冲液、NP-40缓冲液等。
3. 超声处理：将细胞裂解液进行超声处理，以进一步破碎细胞结构，释放蛋白质。
超声处理可以通过超声波清洗机或超声波细胞破碎仪进行。
4. 离心：将超声处理后的细胞裂解液进行离心，以去除细胞碎片和其他杂质。
5. 收集上清液：将离心后的上清液转移至新的离心管中，作为细胞蛋白提取的样品。
6. 蛋白含量测定：使用蛋白含量测定方法（如BCA、Lowry 等）测定提取的蛋白质浓度，以便后续实验设计的参考。
细胞蛋白提取步骤可能因实验目的或细胞种类的不同而有所差异。
在进行细胞蛋白提取之前，可以参考相关文献或实验方案，选择适合自己研究的步骤和试剂。
6孔板细胞提取蛋白步骤
6孔板细胞提取蛋白步骤一、引言蛋白质是生物体中最重要的分子之一，对于研究细胞功能和生物学过程起着至关重要的作用。
在细胞实验中，提取细胞蛋白是进行后续分析的基础。
本文将介绍一种常用的方法，即以6孔板细胞提取蛋白的步骤。
二、实验步骤1. 细胞培养需要将待提取蛋白的细胞在6孔板中进行培养。
在培养过程中，需要注意细胞的密度和状态，以保证后续提取蛋白的质量和效果。
2. 细胞裂解当细胞生长到适当的密度后，可以开始进行细胞裂解。
可以选择使用细胞裂解缓冲液对细胞进行裂解，其中缓冲液的成分应根据实验需求进行调整。
裂解过程中，可以使用震荡器或超声波仪等设备来促进细胞裂解。
3. 离心将裂解后的细胞上清液离心，以去除细胞碎片和细胞核等杂质。
离心的条件应根据实验需求进行调整，一般情况下，以12000 rpm离心10分钟即可。
4. 收集上清液将离心后得到的上清液收集，并转移到新的离心管中。
注意避免带入细胞残渣和沉淀物。
5. 蛋白浓度测定使用蛋白浓度检测方法（如BCA或Lowry方法）对上清液中的蛋白浓度进行测定。
根据测定结果，可以调整蛋白浓度，以满足后续实验的要求。
6. 蛋白质保存将蛋白质分装到适当的离心管中，并在-80℃的冰箱中保存。
为了避免蛋白质降解和污染，可以添加适量的蛋白酶抑制剂或保存缓冲液。
三、实验注意事项1. 在细胞培养过程中，需要注意细胞的培养密度和培养时间，以保证细胞的健康状态和蛋白质表达水平。
2. 在细胞裂解过程中，可以选择适当的裂解缓冲液和裂解方法，以保证细胞蛋白的完整性和提取效果。
3. 在离心过程中，要注意离心条件的选择，以保证上清液中的蛋白质不受细胞碎片和细胞核等杂质的影响。
4. 在蛋白浓度测定过程中，要严格按照测定方法的步骤进行操作，以确保测定结果的准确性和可靠性。
5. 在蛋白质保存过程中，要避免蛋白质的降解和污染，可以添加适量的蛋白酶抑制剂或保存缓冲液，并将蛋白质储存于低温冰箱中。
四、实验应用通过以6孔板细胞提取蛋白的步骤，可以得到大量高质量的细胞蛋白，为后续的蛋白质分析和研究提供了可靠的基础。
蛋白提取原理
蛋白提取原理
蛋白质是生命体内最基本的物质之一，它参与了生物体内的几乎所有生命活动。
因此，蛋白质的提取和纯化对于生物学研究、食品加工、药物开发等领域具有重要意义。
蛋白提取的原理主要包括细胞破碎、蛋白质溶解和分离纯化三个步骤。
首先，细胞破碎是蛋白提取的第一步。
细胞膜的破裂是蛋白质提取的前提条件，只有将细胞完全破碎，才能使蛋白质充分暴露在溶液中，有利于后续的溶解和分离。
常用的细胞破碎方法包括机械破碎、超声波破碎、冻融破碎等，这些方法可以有效地破坏细胞壁和细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
其次，蛋白质的溶解是蛋白提取的关键步骤。
细胞破碎后，蛋白质通常以固体形式存在于细胞溶液中，需要将其溶解到溶液中。
蛋白质的溶解受到多种因素的影响，如pH值、离子强度、温度等。
在蛋白质的溶解过程中，需要选择合适的缓冲液和溶解条件，以保证蛋白质的完整性和活性。
最后，蛋白质的分离纯化是蛋白提取的最终目的。
在蛋白质溶液中，通常含有大量的杂质和其他蛋白质，需要通过分离纯化的方
法将目标蛋白质从混合溶液中分离出来。
常用的分离纯化方法包括离心、凝胶过滤、离子交换、亲和层析等，这些方法可以根据蛋白质的特性和目的进行选择，最终得到纯度较高的目标蛋白质。
总之，蛋白提取的原理是一个复杂的过程，需要综合运用生物化学、生物物理学、分子生物学等多个学科的知识。
只有深入理解蛋白提取的原理，才能选择合适的方法和条件，从而获得高质量的蛋白质样品。
希望本文对您有所帮助，谢谢阅读！。
组织蛋白提取步骤
组织蛋白提取步骤组织蛋白提取是一种常见的实验方法，在生物医学研究中广泛应用。
通过组织蛋白提取，可以获取到目标蛋白质，并进行后续的分析和研究。
本文将详细介绍组织蛋白提取的步骤及注意事项。
一、实验前准备1.准备所需材料：待提取组织样本、PBS缓冲液、RIPA裂解缓冲液、PMSF（丙烯酰氨基苯甲酸）、SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒等。
2.消毒工作台和实验器具，保证实验环境干净卫生。
3.根据所需样本量选择合适的试管或离心管，标注好编号和样品信息。
二、样品收集1.收集新鲜组织样品，尽可能避免冷冻保存，因为长时间冷冻会对蛋白质结构产生影响。
2.将组织放置在PBS缓冲液中进行清洗和去除表面污物。
3.将组织切成小块或粉碎成粉末状，以便更好地进行裂解。
三、裂解1.将组织样品加入RIPA裂解缓冲液中，按比例加入PMSF，PMSF的浓度一般为1mM。
2.将混合物放置在冰上静置30分钟，使细胞膜破裂，并释放出蛋白质。
3.使用离心机进行离心，离心速度一般为12000rpm，离心时间约为10-15分钟。
四、收集蛋白1.将上清液收集到新的离心管中，去除沉淀和杂质。
2.使用SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒进行蛋白质浓度检测和电泳分析。
3.根据实验需要进行后续处理，如Western blot、ELISA等实验。
五、注意事项1.操作过程中需保持洁净卫生，避免污染样品。
2.PMSF是一种有毒化学物质，在使用时需佩戴手套和防护眼镜，并注意避免吸入或接触皮肤。
3.组织样品应尽可能新鲜，并在保持完整性的情况下进行裂解。
如果组织保存时间过长或受到损伤，则可能会影响蛋白质提取的效果。
4.离心时应注意离心速度和时间，避免过度离心导致蛋白质损失。
5.在蛋白质浓度检测和电泳分析中，应根据实验需要选择合适的试剂盒和仪器，并按照说明书进行操作。
总之，组织蛋白提取是一项重要的实验技术，在生物医学研究中具有广泛的应用。
通过正确的操作步骤和注意事项，可以提高蛋白质提取的效率和准确性，为后续实验打下坚实的基础。
蛋白质提取详细步骤
三色竹芋Ctenanthe oppenheimiana‘Quadricdor’的蛋白质组学研究一、蛋白质的提取1、100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)在预冷后的研钵中加入液氮研磨2、粉末转入5ml离心管中，加入1.5 ml的提取液在-20℃的条件下过夜，然后离心（4℃8000rpm以上1小时）弃上清。
3、加入等体积的冰浴丙酮（含0.07%的β-巯基乙醇），摇匀后离心（4℃8000rpm以上1小时），然后真空干燥沉淀，备用。
4、上样前加入裂解液，室温放置30分钟，使蛋白充分溶于裂解液中，然后离心（15℃8000rpm 以上1小时或更长时间以没有沉淀为标准），可临时保存在4℃待用。
5、用Brandford法定量蛋白，然后可分装放入-80℃备用。
药品：提取液：含10%TCA和0.07%的β-巯基乙醇的丙酮裂解液：2.7g尿素0.2g CHAPS溶于3ml灭菌的去离子水中（终体积为5ml），使用前再加入1M的DTT65ul/ml。
种苗蛋白质样品的提取按Davermal等（1986）的方法进行。
100mg材料剪碎后加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配制，含10mM即0.07%β-巯基乙醇），混匀，-20℃沉淀1小时，4℃，15000 r/min离心15 min，弃上清，沉淀复溶于1.5ml冷丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇)，再于-20℃沉淀1小时，同上离心弃上清，（有必要再用80％丙酮(含10 mMβ-巯基乙醇所得沉淀低温冷冻真空抽干。
按每mg干粉加入20μl（可调）UKS液[9.5 M尿素，5mM碳酸钾，1.25%SDS，0.5%DTT(二硫苏糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃温育30min，期间搅动几次，28度（温度低，高浓度的尿素会让溶液结冰）16000 r/min 离心15 min，离心力越大时间长一点越好！上清即可上样电泳。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
提蛋白及WB得步骤
整个过程细胞或蛋白都必须放冰上
准备工作:前一天准备:借钥匙、检查细胞裂解液相关试剂就是否充足、
当天准备:洗玻璃板、开紫外,冰块、碎冰、标记１.５ｍl 离心管及0。
6ｍl离心
管、细胞刮板、开低温高速离心机
细胞裂解液配制:
1ml celｌlｙsis
10ul NP－40(离心机后)
25ul 焦磷酸钠
４0ul ＮaＦ
1ul β—甘油磷酸
2 ul Na3VO４
1ul 蛋白酶抑制剂(用完即放回冰箱)
10ul PMＳＦ(最后加,随加随用,有毒)
细胞裂解与收集
1.观察细胞状态,并准备提蛋白:吸走培养基、用PBS洗细胞两次(倾斜贴壁加PBS,左右轻轻
摇),倾斜贴壁吸走PBS。
2.将细胞盘拿到外间冰上,加裂解液(体积网上推荐:一般1０6加0。
１ml ),冰上静置１-２min。
3.刮细胞:细胞刮板每次用之前拿水涮一涮,甩干,然后从中间到外面打圈刮,再从下往上,从
上往下全面刮,(刮得时候要迅速),最后用枪吸取裂解液至离心管、
细胞破碎
4.超声波破碎细胞:准备三个小烧杯,加满冰块,三个小夹子。
(超声波破碎仪得铁棒不要碰到
离心管得壁与底部)
超声波设置:
工作功率5% 工作时间３min
开机时间15s,关机时间３０s
温度０度,
报警温度1度
5.4℃、13００0r／mｉｎ,离心１5mｉn、(离心机用后一直保持打开得状态,)
蛋白保存
6.蛋白保存及分装:吸上清液至0。
6ｍl离心管,涡旋、吸一半至另一个管中,涡旋。
-80℃保
存。
注意事项:PMSF一定要现用现加,PMSF在水溶液中不稳定,30min内就会降解一半。
样品处理超过１ｈ,补加一次。
ＢCA测定蛋白浓度
1、测空白板,选差异较小得孔。
BCA测定法波长570,Bｒacforｄ:595
2、标准蛋白得稀释(5mｇ/ul):分装1ml PBS来使用,稀释标准蛋白至0.5mg/uｌ。
取5ｕｌ标准蛋白+４5ul ＰＢS
4、样品蛋白稀释2０倍:2ul蛋白+18ｕl PBＳ
5、配BCA:每个孔200uｌ,一个样品2个重复,Ａ:Ｂ＝５０:1,根据样品数来计算BＣA得用量,
一般防止损耗,多算一个样。
6、加BCA:悬空加、３7℃孵育30 miｎ。
(手不能碰板得底部,影响测定结果)
7、计时30min
8、配分离胶,灌胶,加水封。
9、计时2０min。
10、测蛋白:先振板、再设置参数。
11、计算上样体积:
12、配浓缩胶,灌胶,加梳子,等1—２ｍin,出现缩胶得地方补上。
13、打开干式加热器
10、蛋白质上样:根据计算结果乘以稀释倍数,算出蛋白浓度,以体积最大得为准,其她用水补足。
(最大上样量为20ｕl,除去buffｅｒ得体积,蛋白质最大上样体积为16ul)
标记0.6mｌ离心管
加样顺序:水、ｂuffer(１/４)、蛋白、离心—涡旋－离心。
100℃变性10miｎ(迅速,确保变性程度一致)
11、计时10min ,变性１０ｍｉn。
12、安装电泳槽:
电泳液(１Ｘ):配制:90ml(１0X)+8１０ml水(只能用一次)
液面刚覆盖胶,不能有气泡。
1３、上样:ｍaker 上样量为3uｌ。
依次上样(吸样品时最好一次吸完)枪头不能撬板,笔直打进去
１4、电泳
分离胶10０V,２0mｉn左右、条带都跑开即可。
浓缩胶14５V 1h 有等紫色部分跑到底结束。
转膜
准备工作:转移缓冲液(只能用2次)、三层滤纸、海绵、ＰVDF膜
ＰＶDＦ膜用之前用甲醇浸泡数秒。
用海绵与滤纸之前先浸湿、
转膜:负极(黑板)海绵—三层滤纸－胶-PVDＦ膜—三层滤纸—海绵－正极(白板)、
三层滤纸与膜都需要赶气泡。
安装转移槽:加转子、冰盒,安装时夹子面朝上
15、转膜电压１00V 90min。
(视蛋白大小而定,蛋白分子小得可适当缩短时间)
１６、取膜晾干、剪个角作为标记,保鲜膜保存４℃。
孵育抗体
1、膜得活化:把膜晾干,甲醛浸泡(回收)膜数秒、无菌水洗3次、TBST洗２次。
2、封闭:配封闭液:３％得牛奶:4ｍl TBSＴ+ 0、12ｇ脱脂奶粉,混匀、涡旋。
3、4℃封闭一小时、盖盖子。
4、TBSＴ洗三次、每次１0 min 。
(封闭液与一抗相同则不用洗)
5、一抗孵育:加一抗,1:100０(比例视情况定)、密封孵育、盖盖子。
6、4℃过夜孵育。
7、回收一抗(回收到对应得离心管,立即放回4℃冰箱)
8、TBST洗三次、每次1０mｉn、
9、二抗孵育:加二抗,室温孵育１h。
１0、回收二抗,TBST洗3次,每次１0 ｍｉn(最后一次不要倒掉)(可以准备洗膜用得东西:检查显影液就是否能用)
显影
１1。
准备显影得东西:显影液、镊子、剪刀、光片、保鲜膜、计时器、
配发光液:Ａ:B 1:1、放小黑屋里、剪好保鲜膜、铺在板上,做好准备。
1２、最后一次TBＳT洗完后,拿到小黑屋,关门、开红灯。
13、先剪X光片、右上角做个记号(位置瞧个人习惯),
14、将膜上得液体吸干(卫生纸上稍微吸干),放板上,定一个3min 计时器,加上发光液,开始计时、观察发光现象,当瞧到发光时,压片。
１5。
压片:将膜反扣在保鲜膜上,不能产生气泡、每次压片都记时,先从２min开始。
1５、压片结束后,放在显影液里,轻轻摇晃至瞧到条带,用镊子夹至水中浸泡,清洗数秒,再放置定影液内、
16.等膜洗完后,拿至外间,用自来水清洗光片,晾干。