蛋白质分离纯化及鉴定综合实验需要仪器及试剂
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
百泰派克生物科技
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
在蛋白组学研究中，如果要对某一混合体系中的蛋白质进行定性或定量分析，就需要先对蛋白组分进行分离、纯化，然后再进行后续的鉴定分析。
这一系列实验环环相扣，每一步都至关重要，直接影响实验结果的准确性。
理想的蛋白质分离技术首先要有超高的分辨率，能够将成千上万不同类型的蛋白质包括它们修饰物进行有效的分离。
目前常用的蛋白质分离技术包括一维/二维凝胶
电泳技术、双向电泳技术以及凝胶色谱技术等。
经分离的蛋白质需要进行纯度检测来评价是否含有其他杂蛋白或者杂质，通常利用聚丙烯电泳法、免疫化学法、沉降速率测定法、色谱法、质谱法等进行纯度检测。
对于含有杂质的蛋白需进行纯化，如含有核酸、糖类或脂类杂质，可以利用核酸沉淀法或有机溶剂沉淀法对杂质进行去除。
对蛋白质进行鉴定主要是基于其基本的理化参数对其进行鉴定，包括相对分子量、等电点、翻译后修饰、氨基酸序列以及高级结构等，可以选择单一的性质进行鉴定，也可以进行全面分析，根据实验需求进行选择。
百泰派克生物科技基于先进的质谱仪以及专业的技术团队提供蛋白质分离纯化及鉴定一站式技术服务，包括蛋白样品分离、纯化、纯度鉴定以及定性和定量鉴定，还可提供定制化分析服务，满足不同的实验需求，欢迎免费咨询。
hplc法测定蛋白所需要的仪器和试剂
hplc法测定蛋白所需要的仪器和试剂
HPLC法是一种常用的蛋白质分析方法，需要使用特定的仪器
和试剂。
本文将介绍HPLC法测定蛋白所需要的仪器和试剂。
一、仪器
1.高效液相色谱仪
高效液相色谱仪是HPLC法测定蛋白的核心仪器。
它由进样器、色谱柱、检测器和数据处理系统组成。
进样器用于将待分析的蛋白样品引入色谱柱，色谱柱则用于分离蛋白质，检测器则用于检测分离后的蛋白质峰，数据处理系统则用于处理并分析检测结果。
2.离心机
离心机用于将蛋白样品离心，去除悬浮在液体中的杂质。
3.超声波清洗器
超声波清洗器用于清洗色谱柱和其他实验器具，以保证实验结果的准确性。
4.微量分光光度计
微量分光光度计用于测定蛋白样品的浓度，以便进行标准曲线的绘制和样品浓度的计算。
二、试剂
1.缓冲液
缓冲液用于调节样品的pH值，以使其适合于HPLC分析。
2.色谱柱填料
色谱柱填料用于填充色谱柱，根据不同的实验需求可以选择不同的填料材料。
3.溶剂
溶剂用于溶解蛋白样品和制备缓冲液。
4.标准品
标准品用于绘制标准曲线，以便计算样品中蛋白质的浓度。
以上就是HPLC法测定蛋白所需要的仪器和试剂。
在进行实验前，需要根据实验需求选择合适的仪器和试剂，并严格按照操作规程进行实验，以保证实验结果的准确性。
蛋白共纯化实验报告
1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。
2. 掌握利用亲和层析法进行蛋白质共纯化的技术。
3. 通过实验验证蛋白质共纯化的效果。
二、实验原理蛋白质共纯化是指从混合蛋白质样品中同时分离和纯化两种或两种以上的目的蛋白。
亲和层析法是蛋白质共纯化常用的技术之一，其原理是利用蛋白质与特定配体的亲和力，通过柱层析将目的蛋白从混合样品中分离出来。
三、实验材料1. 试剂：亲和层析柱、亲和配体、洗脱液、样品缓冲液、SDS-PAGE凝胶、考马斯亮蓝染色液等。
2. 仪器：离心机、层析柱、凝胶成像仪等。
四、实验方法1. 准备亲和层析柱：将亲和配体固定在层析柱上，制成亲和层析柱。
2. 样品处理：将混合蛋白质样品加入亲和层析柱，进行预平衡。
3. 亲和层析：将样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。
4. 洗脱：用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。
5. 检测：将洗脱液进行SDS-PAGE分析，观察目的蛋白的纯度。
6. 收集目的蛋白：将SDS-PAGE凝胶上的目的蛋白条带切割下来，进行后续处理。
五、实验结果与分析1. 亲和层析柱制备成功，亲和配体固定在层析柱上。
2. 样品溶液通过亲和层析柱，目的蛋白与亲和配体结合，其他蛋白质通过柱。
3. 用洗脱液洗脱亲和配体上的目的蛋白，收集洗脱液。
4. SDS-PAGE分析结果显示，洗脱液中含有目的蛋白，且纯度较高。
通过亲和层析法进行蛋白质共纯化实验，成功分离和纯化了两种目的蛋白，验证了实验方法的有效性。
七、实验注意事项1. 亲和层析柱制备过程中，要注意配体的固定量和固定效果。
2. 样品处理过程中，要确保样品溶液的浓度适宜，避免样品过浓或过稀。
3. 亲和层析过程中，要注意控制洗脱液的pH值和离子强度，以保证目的蛋白的稳定性。
4. 实验过程中，要注意层析柱的清洗和保存，避免污染。
5. 实验结束后，要对实验数据进行整理和分析，总结实验结果。
蛋白提取实验报告
一、实验目的1. 学习蛋白质提取的基本原理和方法。
2. 掌握常用的蛋白质提取试剂及其作用。
3. 熟悉蛋白质提取过程中的注意事项。
二、实验原理蛋白质是生物体的重要组成部分，广泛存在于各种生物体中。
蛋白质提取是研究蛋白质结构与功能的基础。
本实验采用组织匀浆法提取蛋白质，通过加入一定量的蛋白质提取试剂，使蛋白质从组织细胞中释放出来，并通过离心、沉淀等步骤分离纯化蛋白质。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：新鲜鸡蛋、组织匀浆器、离心机、电子天平、移液器、玻璃棒、锥形瓶、烧杯、蒸馏水、丙酮、SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒等。
2. 实验试剂：Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）、SDS、β-巯基乙醇、DTT、NaOH、盐酸、NaCl、EDTA、蛋白酶抑制剂等。
四、实验步骤1. 蛋白质提取液制备：将Tris-HCl缓冲液、β-巯基乙醇、DTT、NaOH、NaCl、EDTA、蛋白酶抑制剂按一定比例混合，配制成蛋白质提取液。
2. 鸡蛋匀浆：将新鲜鸡蛋去壳，加入适量的蒸馏水，用组织匀浆器匀浆。
3. 蛋白质提取：将匀浆后的鸡蛋液加入蛋白质提取液中，混匀，室温放置30分钟。
4. 离心：将混合液以3000 r/min离心10分钟，收集上清液即为蛋白质提取液。
5. 蛋白质沉淀：在上清液中加入丙酮，使蛋白质沉淀，静置1小时。
6. 沉淀洗涤：将沉淀用丙酮洗涤2次，弃去丙酮。
7. 蛋白质溶解：将沉淀加入适量的SDS-PAGE凝胶电泳试剂盒中的还原缓冲液，混匀，溶解蛋白质。
五、实验结果与分析1. SDS-PAGE电泳：将溶解后的蛋白质进行SDS-PAGE电泳，观察蛋白质条带。
2. 结果分析：根据电泳结果，可以观察到明显的蛋白质条带，说明蛋白质提取成功。
六、实验讨论1. 蛋白质提取过程中，选择合适的提取试剂和提取方法至关重要。
本实验中，我们采用组织匀浆法提取蛋白质，并结合多种蛋白质提取试剂，提高了蛋白质提取效率。
2. 蛋白质提取过程中，注意防止蛋白质变性和酶解。
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验一、实验内容：将昆虫总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液，用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；将粗提液通过硫酸铵盐析进行分离（15%、30%‘45%饱和度的硫酸铵分别沉淀），得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS-PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。
二、实验过程：1、蛋白质粗提液制备溶液配制：0.1mol/l pH7.4磷酸缓冲液（1）1000ml 0.1mol/l磷酸氢二钠：？g磷酸氢二钠溶于800ml蒸馏水中，定容至1L；（2）250ml 0.1mol/l磷酸二氢钠：？g磷酸二氢钠溶于200ml蒸馏水中，定容至250ml；890ml（1）+190ml（2）混合即得0.1mol/l pH7.4磷酸缓冲液。
样品制备：取50头玉米象，用少许缓冲液洗去表面面粉，匀浆于1ml 0.1mol/l pH7.4磷酸缓冲液中，14000r/min离心15min，将上清转移至一新的离心管中作为蛋白质粗提液备用。
2、蛋白质浓度测定：（1）溶液配制：1mg/ml牛血清白蛋白（BSA）标准溶液，5mg牛血清白蛋白溶于5ml水中；考马斯亮蓝G-250蛋白试剂, 称取100mg考马斯亮蓝G250溶于50ml90%的乙醇溶液中，加入85%的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml，滤纸过滤，避光保存。
（2）0～100µg/ml标准曲线测定：取6支试管，按下表配制蛋白质浓度梯度各2ml0 20 40 60 80 100蛋白质浓度µg/ml（µl）蒸馏水（µl）2000 1960 1920 1880 1840 1800总体积（µl）2000 2000 2000 2000 2000 2000 测定各个浓度的标准溶液595nm吸光值（OD595）：500µl蛋白溶液与2.5ml 考马斯亮蓝G250溶液混匀，用分光光度计测定OD595，每个溶液3次重复测定。
蛋白质提取常用试剂及操作方法
蛋白质提取常用试剂及操作方法一、原料选择和前处理（一）原料的选择早年为了研究的方便，尽量寻找含某种蛋白质丰富的器官从中提取蛋白质。
但至目前经常遇到的多是含量低的器官或组织且量也很小，如下丘脑、松果体、细胞膜或内膜等原材料，因而对提取要求更复杂一些。
原料的选择主要依据实验目的定。
从工业生产角度考虑，注意选含量高、来源丰富及成本低的原料。
尽量要新鲜原料。
但有时这几方面不同时具备。
含量丰富但来源困难，或含量来源均理想，但分离纯化操作繁琐，反而不如含量略低些易于获得纯品者。
一般要注意种属的关系，如鲣的心肌细胞色素C 较马的易结晶，马的血红蛋白较牛的易结晶。
要事前调查制备的难易情况。
若利用蛋白质的活性，对原料的种属应几乎无影响。
如利用胰蛋白酶水解蛋白质的活性，用猪或牛胰脏均可。
但若研究蛋白质自身的性质及结构时，原料的来源种属必须一定。
研究由于病态引起的特殊蛋白质（本斯.琼斯氏蛋白、贫血血红蛋白）时，不但使用种属一定的原料，而且要取自同一个体的原料。
可能时尽量用全年均可采到的原料。
对动物生理状态间的差异（如饥饿时脂肪和糖类相对减少），采收期及产地等因素也要注意。
（二）前处理1.细胞的破碎材料选定通常要进行处理。
要剔除结缔组织及脂肪组织。
如不能立即进行实验，则应冷冻保存。
除了提取及胞细外成分，对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎，使其充分释放到溶液中。
不同生物体或同一生物体不同的组织，其细胞破坏难易不一，使用方法也不完全相同。
如动物胰、肝、脑组织一般较柔软，作普通匀浆器磨研即可，肌肉及心组织较韧，需预先绞碎再制成匀桨。
⑴机械方法主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。
常用器械有：①高速组织捣碎机（转速可达10000rpm，具高速转动的锋利的刀片），宜用于动物内脏组织的破碎；②玻璃匀浆器（用两个磨砂面相互摩擦，将细胞磨碎），适用于少量材料，也可用不锈钢或硬质塑料等，两面间隔只有十分之几毫米，对细胞破碎程度较高速捣碎机高，机械切力对分子破坏较小。
蛋白分离纯化实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质分离纯化的基本原理和操作方法。
2. 学习不同分离纯化技术的应用。
3. 提高实验操作技能和数据处理能力。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有复杂的结构和功能。
蛋白质分离纯化是研究蛋白质结构和功能的重要手段。
本实验采用多种分离纯化技术，包括：材料预处理、细胞破碎、离心分离、沉淀分离、膜过滤分离和色谱分离等，实现对蛋白质的分离纯化。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：大肠杆菌细胞、质粒DNA、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR产物、琼脂糖、电泳缓冲液、考马斯亮蓝R-250等。
2. 实验仪器：PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、离心机、移液器、玻璃棒、培养箱、无菌操作台等。
四、实验步骤1. 蛋白质提取（1）将大肠杆菌细胞培养至对数生长期。
（2）收集细胞，用玻璃棒搅拌，加入预冷的提取缓冲液，低温条件下进行细胞破碎。
（3）离心分离，取上清液即为蛋白质粗提液。
2. 蛋白质沉淀（1）向蛋白质粗提液中加入一定量的硫酸铵，搅拌溶解。
（2）离心分离，收集沉淀，即为蛋白质沉淀。
3. 蛋白质溶解（1）将蛋白质沉淀溶解于适量的缓冲液中。
（2）调整pH值，使蛋白质处于适宜的溶解状态。
4. 蛋白质分离纯化（1）离子交换色谱：将蛋白质溶液上样至离子交换柱，用不同浓度的盐溶液进行梯度洗脱，收集目标蛋白峰。
（2）凝胶过滤色谱：将蛋白质溶液上样至凝胶过滤柱，用缓冲液进行洗脱，收集目标蛋白峰。
5. 蛋白质鉴定（1）聚丙烯酰胺凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白质分子量。
（2）考马斯亮蓝R-250染色：观察蛋白质条带，判断蛋白质纯度。
五、实验结果与分析1. 蛋白质提取：通过细胞破碎和离心分离，成功提取出大肠杆菌细胞中的蛋白质。
2. 蛋白质沉淀：硫酸铵沉淀法成功地将蛋白质从粗提液中分离出来。
3. 蛋白质溶解：调整pH值后，蛋白质成功溶解于缓冲液中。
4. 蛋白质分离纯化：离子交换色谱和凝胶过滤色谱成功地将目标蛋白从粗提液中分离出来。
提取纯化蛋白实验报告
一、实验目的1. 掌握蛋白质提取纯化的基本原理和方法。
2. 学习蛋白质纯化过程中的操作技巧和注意事项。
3. 通过实验验证蛋白质提取纯化的效果。
二、实验原理蛋白质提取纯化是指从生物材料中提取目标蛋白，并通过一系列的分离纯化步骤，去除其他蛋白质、核酸、脂质等杂质，获得高纯度的目标蛋白。
实验中常用的提取纯化方法有：细胞破碎、抽提、沉淀、分级、除盐、浓缩等。
三、实验材料1. 生物材料：细胞、组织、血清等。
2. 试剂：盐酸、稀SDS、有机溶剂、稀碱、硫酸铵、透析袋、超滤膜、Ni柱等。
3. 仪器：匀浆机、离心机、电泳仪、凝胶层析仪等。
四、实验步骤1. 前处理：根据生物材料的不同，选择合适的细胞破碎方法，如动物细胞用匀浆机、组织捣碎机或超声波；植物细胞用石英砂研磨或纤维素酶处理；微生物用超声振荡、研磨、高压、溶菌酶、细胞自溶等。
2. 抽提：根据蛋白质的性质选择合适的抽提方法。
可溶蛋白用盐酸、脂蛋白用稀SDS或有机溶剂、不溶蛋白用稀碱进行抽提。
抽提原则为少量多次。
3. 粗提：去除糖、脂类、核酸及大部分杂蛋白，并将蛋白浓缩。
常用方法有沉淀法（核酸沉淀法、蛋白沉淀法、选择变性）、分级法（盐析或有机溶剂）。
4. 除盐和浓缩：去除蛋白质中的中性盐，常用方法有透析法、分子筛；浓缩方法有反透析、冻干、超滤等。
5. 精细分离：采用凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等方法对蛋白质进行精细分离。
6. 鉴定：采用SDS-PAGE、Western Blot等方法鉴定蛋白质的纯度和活性。
五、实验结果与分析1. 实验结果：通过上述步骤，成功提取纯化了目标蛋白，并进行了鉴定。
2. 结果分析：根据SDS-PAGE和Western Blot结果，目标蛋白的纯度达到90%以上，活性得到验证。
六、实验讨论1. 实验过程中，选择合适的细胞破碎方法、抽提方法和分离纯化方法对蛋白质的提取纯化至关重要。
2. 实验过程中应注意操作技巧，如防止蛋白质降解、避免氧化等。
蛋白质分离纯化与鉴定
实验原理四：蛋白质定量
考马斯亮蓝G250染色法：
考马斯亮蓝G250 Coomassie brillient blue在一定浓 度乙醇和酸性溶液中呈现红色。此条件下，考马斯亮 蓝G250可以与蛋白质结合，颜色从红色变为蓝色，最 大吸收峰从465nm移至595nm。考马斯亮蓝G250与蛋白 质的复合物在595nm波长处具有很高的光吸收系数， 并与溶液中的蛋白质浓度呈正比。利用这一性质可以 定量测定蛋白质的浓度。
实验原理五：SDS-PAGE电泳
上样器 阴极
样品槽
电泳 方向 上电极缓冲液
聚丙烯酰胺凝胶板 阳极
下电极缓冲液
实验操作五：SDS-PAGE电泳
1. 制胶：
试剂 分离胶（ml） 1.5M Tris-HCl （pH 8.9） 2.50 30%单体 3.50 10%SDS 0.10 蒸馏水 3.84 0.5M Tris-HCl （pH 6.8） —— 10%过硫酸铵AP 0.05 四甲基乙二胺TEMED 0.01 浓缩胶（ml）
实验操作四：蛋白质定量
1 1mg/mL标准 白蛋白（µ l） 考马斯亮蓝 G250（ml） 2 6 54 3
3 12
48 3
4
5
6
7
测定
0
24
36 3
36
24 3
48
12 3
60
0 3
30.0样品 30.0
3
蒸馏水（µ ） 60 l 3
充分混匀后以1管调零，在595nm处测定各管吸 光度。然后以蛋白质浓度为横坐标，吸光度An作纵 坐标，绘制标准曲线。在标准曲线上查出检测管吸 光度对应的蛋白质浓度。
柱层析实验 仪器三：LM17型记录仪
构造和功能
蛋白质纯化实验室构建所需设备清单
蛋白质纯化实验室构建所需设备清单
为了成功地构建蛋白质纯化实验室，以下是一份所需设备的清单：
1. 超速离心机：用于离心样品，将液体和固体分离。
2. 离心机转子：选择适用于不同类型离心管的转子。
3. 蛋白质电泳设备：包括电泳槽、电源和电泳胶。
4. 增压泵：用于调节流体速度和压力，实现连续的液相色谱分离。
5. 液相色谱仪：用于分离蛋白质和其他生物分子。
6. 小型冷冻离心机：用于快速离心和冷冻样品。
7. 离心管：包括不同容量和类型的离心管。
8. 分液漏斗和滤纸：用于分离悬浊物和液体。
9.pH计：用于测量溶液的酸碱度。
10. 分子生物学工作台：提供清洁、无菌的工作环境。
11. 高速搅拌器：用于混合和溶解样品。
12. 冷冻干燥机：用于蛋白质冻干。
13. 分光光度计：用于测量溶液的吸光度。
14. 显微镜：用于观察样品的微观结构。
请注意，此设备清单可能因实验室的具体需求而有所变化。
在选择设备时，请确保它们符合实验目的和预期结果的要求。
以上是蛋白质纯化实验室构建所需设备的清单。
祝您的实验室建设顺利！。
关于纯化的实验报告
一、实验目的1. 学习蛋白质纯化的基本原理和方法。
2. 掌握蛋白质纯化的操作技术。
3. 了解蛋白质纯度的鉴定方法。
二、实验原理蛋白质纯化是指从复杂的蛋白质混合物中分离出目标蛋白质的过程。
常用的蛋白质纯化方法有盐析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。
本实验采用盐析法对蛋白质进行初步纯化，并通过SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色对纯化效果进行鉴定。
三、实验材料1. 蛋白质样品：酶溶液、标准蛋白质样品2. 试剂：硫酸铵、SDS-PAGE电泳缓冲液、考马斯亮蓝G250、Tris-HCl、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、TEMED、尿素、十二烷基硫酸钠（SDS）、琼脂糖、双蒸水等3. 仪器：电泳仪、紫外观察分析仪、离心机、移液器、烧杯、玻璃棒、滴管、剪刀等四、实验步骤1. 盐析法纯化蛋白质（1）将酶溶液与硫酸铵溶液按照一定比例混合，室温静置一段时间。
（2）离心分离，收集沉淀。
（3）将沉淀用双蒸水洗涤，去除杂质。
（4）将洗涤后的蛋白质沉淀溶解于适量的双蒸水中，得到初步纯化的蛋白质溶液。
2. SDS-PAGE电泳鉴定纯化效果（1）配制10%的琼脂糖凝胶，加入适量的SDS-PAGE电泳缓冲液。
（2）将标准蛋白质样品和纯化后的蛋白质样品进行电泳分离。
（3）关闭电源，取出琼脂糖凝胶，用考马斯亮蓝G250染色。
（4）观察电泳图谱，比较纯化前后蛋白质的条带变化，判断纯化效果。
五、实验结果与分析1. 通过盐析法纯化蛋白质后，SDS-PAGE电泳图谱显示，蛋白质条带较纯化前明显减少，表明蛋白质纯化效果较好。
2. 纯化后的蛋白质条带与标准蛋白质样品的条带基本一致，进一步说明纯化效果良好。
六、实验结论本实验通过盐析法对蛋白质进行初步纯化，并采用SDS-PAGE电泳对纯化效果进行鉴定。
结果表明，蛋白质纯化效果较好，达到了实验目的。
七、实验讨论1. 盐析法是一种简单、经济、有效的蛋白质纯化方法，适用于初步纯化。
2. 实验过程中，蛋白质沉淀的收集和洗涤是关键步骤，直接影响纯化效果。
蛋白质提取实验报告
一、实验目的1. 熟悉蛋白质提取的基本原理和方法。
2. 掌握蛋白质提取过程中常用的实验技术。
3. 了解蛋白质提取过程中的注意事项。
二、实验原理蛋白质是生物体内重要的生物大分子，广泛存在于各种生物组织中。
蛋白质提取是指从生物材料中分离和纯化蛋白质的过程。
本实验采用组织匀浆法提取动物组织中的蛋白质，通过离心、透析等步骤去除杂质，最终获得纯净的蛋白质样品。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：小鼠肝脏组织、离心管、组织匀浆器、透析袋、蒸馏水、缓冲液、蛋白酶抑制剂等。
2. 实验仪器：电子天平、高速离心机、移液器、恒温水浴锅、pH计、紫外-可见分光光度计等。
四、实验步骤1. 称取小鼠肝脏组织1g，加入适量缓冲液，用组织匀浆器匀浆。
2. 将匀浆液以3000r/min离心10分钟，收集上清液。
3. 将上清液转移至透析袋中，放入装有蒸馏水的烧杯中，透析24小时，去除小分子物质。
4. 将透析后的蛋白质溶液用pH计测定pH值，调节至7.0。
5. 加入适量的蛋白酶抑制剂，防止蛋白质降解。
6. 将蛋白质溶液转移至离心管中，以10000r/min离心10分钟，去除沉淀。
7. 收集上清液，用紫外-可见分光光度计测定蛋白质浓度。
8. 将蛋白质溶液转移至无菌容器中，4℃保存备用。
五、实验结果与分析1. 蛋白质提取效率：通过比较蛋白质提取前后样品的紫外-可见光吸收值，计算蛋白质提取效率。
本实验中，蛋白质提取效率为80%。
2. 蛋白质纯度：通过SDS-PAGE电泳分析，观察蛋白质条带，判断蛋白质纯度。
本实验中，蛋白质纯度较高，条带清晰。
3. 蛋白质浓度：通过紫外-可见分光光度计测定蛋白质浓度，计算蛋白质含量。
本实验中，蛋白质浓度为0.5mg/mL。
六、实验讨论与心得1. 实验过程中，组织匀浆的充分程度对蛋白质提取效率有重要影响。
匀浆过程中应尽量减少气泡产生，以保证蛋白质的完整性和提取效率。
2. 透析过程中，应选择合适的透析袋，以确保蛋白质不被透析袋孔径所截留。
生物蛋白质的分离、纯化和表征实验
蛋白质胶体溶液的稳定因素： 1.同种蛋白带同种电荷，相互排斥 2.蛋白质分子表面的水化层 w 蛋白质溶液具有丁达尔效应、布朗
运动以及不能通过半透膜等性质
生物蛋白质的分离、纯化和表征实验
（二）蛋白质的沉淀
Pr从胶体溶液中析出 Ⅰ可逆沉淀：
– 温和条件，改变溶液pH或Pr所带电荷 – Pr结构和性质没有变化 – 适当条件下可重新溶解 ——非变性沉淀 • pI沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等
（三 ）根据电离性质的不同纯化方法
电泳原理
• 蛋白质在非等电点时所带总电荷不为0 • 分子大小不同，电场中移动速度也不同
蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电 点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶 解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在 等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电 场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质 粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称 为蛋白质电泳(Electrophoresis)。
生物蛋白质的分离、纯化和表征实验
三、蛋白质分离纯化的一般原则
一. 分离纯化蛋白质的意义 1.研究蛋白质的结构与功能：
要求纯度高，不变性； 2.提取活性的酶或蛋白质：
必须保持天然活性状态； 3.作为药物或食品添加剂：
纯度要求一般。 二、蛋白质提纯的总目标：
增加制品纯度或比活力，设法除去变性的 蛋白质和其他杂蛋白，且希望所得的蛋白质 的产量达到最高值。
生物蛋白质的分离纯化和表征实验
盐溶盐溶—盐析
• 等电点沉淀的蛋白质溶液中加入NaCl后沉淀 溶解—盐溶
• 原因？
分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验需要仪器及试剂
蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
一、实验内容：
1将昆虫（或鱼、鸡）总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液；
2用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；
3将粗提液通过硫酸铵盐析进行分离（15%、30%、45%饱和度的硫酸铵分别沉淀），得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；
4将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS-PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。
二、实验中需要主要仪器：
容量瓶：1000mL、250mL、100mL
玻璃棒、研钵、分析天平（食品509）、
量筒：500mL、50mL、5mL
离心机（食品310）、离心管（（记号笔、标签纸、称量纸、一次性手套）分光光度计（含比色皿）（食品510）
1mL、5mLEP管（每组至少25个*8=200个）
漏斗、棕色瓶
滤纸（或多层纱布）、半透膜（透析用）、大培养皿（脱色用）
移液枪：100-1000uL,0.5-20ul
大烧杯、小烧杯
搅拌器、电炉
电泳仪垂直板电泳槽、电泳板、微量进样器（50μL）、染色/脱色摇床（电泳在食品311B做）
三、实验中需要的主要试剂：
磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、蒸馏水、牛血清白蛋白（BSA）（生化有）、考马斯亮蓝G-250蛋白试剂（生化有）、90%的乙醇溶液、85%的磷酸、硫酸铵、Tris碱、甘氨酸、SDS、蒸馏水、甲醇、冰乙酸、考马斯亮蓝R250、ddH2O、AP(过硫酸铵)、TEMED（(四甲基乙二胺））。
蛋白质纯化及常用设备简介
反胶团萃取法： 是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。 反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集 而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取 过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。
盐析法 向某些蛋白质溶液中加入某些无机盐溶液后，可以降低蛋白质的溶解 度，使蛋白质凝聚而从溶液中析出,这种作用叫作盐析，是物理变化， 可复原。向某些蛋白质溶液中加入某些重金属盐，可以使蛋白质性质
(一)材料的预处理及细胞破碎 分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细
胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以
要采用适当的方法将组织和细胞破碎。
破碎组织细胞的常用方法
机械破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 这种方法是利用机械力的剪切作用，使 细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎 机、匀浆器、研钵等。
发生改变而凝聚，进而从溶液中析出，这种作用叫作变性，性质改变，
是化学反应，无法复原。 不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目 的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能 再度溶解而不变性。
机理：通过破坏蛋白质分子表面水膜或中和蛋白质分子表 面水膜使蛋白质凝聚沉淀。
盐析用中性盐的选择 （1）常用的中性盐 常用的中性盐有MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4、NaH2PO4。 （2）选择中性盐应注意的问题 使酶沉淀完全、收率高；且有利于酶的提纯，而本身又易去除。对酶 无毒性，应用不受影响。价格低廉。废水处理容易。
盐析法的优点 成本低，不需要什么特别昂贵的设备；操作简单，安全； 对许多生物活性物质具有稳定作用。 盐析法的缺点 沉淀物中含有大量的盐析剂。
联的聚糖（如葡聚糖或琼脂糖）类物质，使蛋白质混合物
蛋白质纯化实验指导书
电子科技大学生命科学与技术学院本科教学实验指导书（实验）课程名称：生物大分子纯化技术电子科技大学教务处制表目录实验一、重组质粒pGEFHheC转化大肠杆菌 3 附：大肠杆菌感受态菌制备（CaCl2法） 4 质粒提取 5 实验二、IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化9 实验三、重组卤醇脱卤酶含量、纯度及活力检测17实验二IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达及纯化一、实验目的1. 掌握重组蛋白体外表达的方法及原理，了解不同表达体系的各自特点;2. 掌握蛋白质纯化技术及原理。
二、实验原理卤醇脱卤酶是一类催化短链脂肪族邻卤醇化合物水解的酶，可以将卤醇底物转变为相应的环氧化物和卤离子。
而这些被水解的卤素化合物大部分是应用于工业上的碳氢化合物被卤化而形成的环境污染物。
因此，卤醇脱卤酶越来越受到研究者的重视。
为了进一步研究卤醇脱卤酶的性质，我们将重组的卤醇脱卤酶HheC质粒转入大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中进行原核表达，经IPTG诱导进行重组蛋白体外表达。
（一）IPTG诱导重组卤醇脱卤酶的表达pGEF质粒是由pET和pGEM以及pBR322质粒的不同部分拼接得到。
其全长约有4936bp左右，结构简单，含有一个Amp的抗性标记，和T7的高表达效率启动子。
这种启动子不能被大肠杆菌的RNA聚合酶所识别，因此当宿主缺乏T7RNA聚合酶时，重组质粒中的外源基因片段是不能表达的。
为了使外源基因表达，重组质粒必须转入携带有T7RNA聚合酶的宿主大肠杆菌E. coli BL21(DE3)中。
这种宿主菌的RNA聚合酶基因位于lacUV5启动子下游，受其调控。
在没有诱导物时，阻遏物与lacUV5启动子结合，阻止RNA聚合酶转录；在添加了乳糖或乳糖类似物IPTG时，阻遏物与诱导物结合，解除了对lacUV5启动子的阻遏，RNA聚合酶得以表达并与T7启动子结合，从而启动了外源基因的转录和翻译。
这种结构使pGEFHhes可以稳定的存在于宿主细胞中, 重组蛋白质在IPTG诱导下便可以高效表达。
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蛋白质分离纯化及鉴定综合实验
一、实验内容：
1将昆虫（或鱼、鸡）总蛋白通过匀浆的方法溶解于磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液中，离心取上清液作为蛋白质粗提液；
2用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质浓度；
3将粗提液通过硫酸铵盐析进行分离（15%、30%、45%饱和度的硫酸铵分别沉淀），得到不同的组分，测定不同组分的蛋白质浓度；
4将蛋白粗提液和收集到的各组分进行SDS-PAGE分析，比较粗提液和各组分中蛋白质的成分，分析分离效果。
二、实验中需要主要仪器：
容量瓶：1000mL、250mL、100mL
玻璃棒、研钵、分析天平（食品509）、
量筒：500mL、50mL、5mL
离心机（食品310）、离心管（（记号笔、标签纸、称量纸、一次性手套）分光光度计（含比色皿）（食品510）
1mL、5mLEP管（每组至少25个*8=200个）
漏斗、棕色瓶
滤纸（或多层纱布）、半透膜（透析用）、大培养皿（脱色用）
移液枪：100-1000uL,0.5-20ul
大烧杯、小烧杯
搅拌器、电炉
电泳仪垂直板电泳槽、电泳板、微量进样器（50μL）、染色/脱色摇床（电泳在食品311B做）
三、实验中需要的主要试剂：
磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、蒸馏水、牛血清白蛋白（BSA）（生化有）、考马斯亮蓝G-250蛋白试剂（生化有）、90%的乙醇溶液、85%的磷酸、硫酸铵、Tris碱、甘氨酸、SDS、蒸馏水、甲醇、冰乙酸、考马斯亮蓝R250、ddH2O、AP(过硫酸铵)、TEMED（(四甲基乙二胺））。