生物分离工程--电泳 ppt课件
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生物分离工程第八章电泳技术ppt课件
– SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试 剂，能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠 ，破坏蛋白质分子的二级、三级结构；而强还原剂 ，如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇能使半胱氨酸残基之 间的二硫键断裂。
– 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白 质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基 酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶 束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消 除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚 合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中 分子形状对迁移率的影响。
电泳的简单原理
蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中 ，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它 大分子的相互作用。
带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺 寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学 与化学特性。
电泳迁移率
电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下 ，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
工作原理
蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象， 是一个物理化学常数。
可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析
其中区带电泳是目前常用的电泳系统。
区带电泳的主要技术
区带电泳中的常用技术
– 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、 聚焦电泳
– 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳
凝胶电泳
作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分 子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电 内渗小等特性。
– 因此，在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白 质分子被解聚为组成它们的多肽链，解聚后的氨基 酸侧链与SDS结合后，形成带负电的蛋白质-SDS胶 束，所带电荷远远超过了蛋白质原有的电荷量，消 除了不同分子间的电荷差异；同时，蛋白质-SDS聚 合体的形状也基本相同，这就消除了在电泳过程中 分子形状对迁移率的影响。
电泳的简单原理
蛋白质、核酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中 ，它们的净电荷取决于介质的H+浓度或与其它 大分子的相互作用。
带电粒子在电场中的迁移方式主要依据分子尺 寸大小和形状、分子所带电荷或分子的生物学 与化学特性。
电泳迁移率
电泳迁移率（mobility）:在电位梯度E的影响下 ，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
工作原理
蛋白质的等电点 蛋白质最主要的特性是它的带电行为，它们在不 同的pH环境中带不同数量的正电或负电，只是 在某一pH时，蛋白质的净电荷为0，此pH即为该 蛋白的等电点（isoelectric point pI）。
蛋白质的等电点取决于它的氨基酸组成和构象， 是一个物理化学常数。
可以利用等电点差异来进行蛋白质的分离、分析
其中区带电泳是目前常用的电泳系统。
区带电泳的主要技术
区带电泳中的常用技术
– 载体电泳：粉末电泳、纸电泳、凝胶电泳、 聚焦电泳
– 无载体电泳：自由电泳、毛细管电泳
凝胶电泳
作为电泳支持介质必须具有：化学惰性、不干扰大分 子的电泳过程，化学稳定性好、均匀、重复性好、电 内渗小等特性。
电泳技术参考课件_PPT幻灯片
1983年，Schwartz等人根据DNA分子弹性弛豫时间(外推为零的滞 留时间)与DNA分子大小有关的特性，设计了脉冲电场梯度凝胶，交替 采用两个垂直方向的不均匀电场，使DNA分子在凝胶中不断改变方向， 从而使DNA按分子大小分开。后来，Carle等改进了电泳技术，并发现 周期性的反转换电场(periodic inversion of the electric field) 亦能使大分子DNA通过电泳分开。电泳系统是由一个水平式电泳槽和两 组独立，彼此垂直的电极组成，一组电极负极为N，正极为S；另一组 负极为W，正极为E 。
目前多用琼脂糖为电泳支持物 (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可
(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳， 样品扩散度较自由电泳 小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨
(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测
(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长
由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析 检测血浆蛋白、脂蛋 白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其 他生物大分子。
第三节 琼脂糖凝胶电泳
天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖 (agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不 带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和 羧基的强酸性 多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产 生较强的电渗现象，加之硫 酸根可与某些蛋白质作 用而影响电泳速度及分离效果。
的泳动度。
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，
净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子
目前多用琼脂糖为电泳支持物 (1)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，样品不需事先处理就可
(2)琼脂糖凝胶结构均匀，含水量大(约占98-99%)，近似自由电泳， 样品扩散度较自由电泳 小，对样品吸附极微，因此电泳图谱清晰，分辨
(3)琼脂糖透明无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用紫外光灯监测
(4)电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。制成干膜可长
由于醋酸纤维素薄膜电泳操作简单、快速、价廉。目前已广泛用于分析 检测血浆蛋白、脂蛋 白、糖蛋白、胎儿甲种球蛋白、酶、多肽、核酸及其 他生物大分子。
第三节 琼脂糖凝胶电泳
天然琼脂(agar)是一种多聚糖，主要由琼脂糖 (agarose,约占80%)及琼脂胶(agaropectin)组成。 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不 带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和 羧基的强酸性 多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产 生较强的电渗现象，加之硫 酸根可与某些蛋白质作 用而影响电泳速度及分离效果。
的泳动度。
泳动度与带电颗粒所带净电荷的数量，颗粒大小和形状有关。一般说，
净电荷数量愈多，颗粒愈小，愈接近球形，泳动度愈大。被分离的球形分子
生物化学《电泳+离心》课件
一般低速离心，转速以r/min(revolution per minute, rpm) 表示；高速或超速离心 ，转速以相对离心力表示，真正反映颗粒 在离心管中所受到的离心力。
相对离心力（relative centrifugal force， RCF，FR ）是指在离心力场的作用下，颗 粒所受离心力相当于地球重力的倍数，单位 是重力加速度g（9.8m/s2）。
FR=1.119 ×10-5×R×（RPM）2
四、离心机的分类
按转速（每分钟转数，revolution perminute，rpm ）不同可将离心机分为三类：
①普通离心机：转速一般不超过10，000rpm，用于 收集易沉淀的大颗粒；
②高速离心机：转速一般不超过30,000rpm，用于 分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等；
PH稳定性降低。
电场强度(electric field intensity)
电场强度与电泳速率成正比 增大电场强度会引起通过介质的电流增加，从
而导致电泳过程中的热量增大，对电泳分离造 成多种影响。 冷却装置：高压电泳（500~1000V或是更高）
电渗现象（electroosmosis）
离心机 Eppendorf管放置、重量的平衡
2.注意事项
①工作转速在允许范围内。 ②严格平衡，每只离心管内的溶液量应相同，
对称放置。 ③加盖，防止离心管飞出伤人。 ④发现异常立即关机。 ⑤离心管盛液不宜过满，避免腐蚀性液体溅出
腐蚀离心机，同时造成离心不平衡。
电泳技术
electrophoresis
定义：带有电荷的微粒在电场中的移动，这种现象称 为电泳(electrophoresis)。
许多生物分子如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸等在 溶液中均带有一定的电荷，因此，电泳技术广泛应用 于这些物质的分离与鉴定。
相对离心力（relative centrifugal force， RCF，FR ）是指在离心力场的作用下，颗 粒所受离心力相当于地球重力的倍数，单位 是重力加速度g（9.8m/s2）。
FR=1.119 ×10-5×R×（RPM）2
四、离心机的分类
按转速（每分钟转数，revolution perminute，rpm ）不同可将离心机分为三类：
①普通离心机：转速一般不超过10，000rpm，用于 收集易沉淀的大颗粒；
②高速离心机：转速一般不超过30,000rpm，用于 分离各种沉淀物、细胞碎片及较大的细胞器等；
PH稳定性降低。
电场强度(electric field intensity)
电场强度与电泳速率成正比 增大电场强度会引起通过介质的电流增加，从
而导致电泳过程中的热量增大，对电泳分离造 成多种影响。 冷却装置：高压电泳（500~1000V或是更高）
电渗现象（electroosmosis）
离心机 Eppendorf管放置、重量的平衡
2.注意事项
①工作转速在允许范围内。 ②严格平衡，每只离心管内的溶液量应相同，
对称放置。 ③加盖，防止离心管飞出伤人。 ④发现异常立即关机。 ⑤离心管盛液不宜过满，避免腐蚀性液体溅出
腐蚀离心机，同时造成离心不平衡。
电泳技术
electrophoresis
定义：带有电荷的微粒在电场中的移动，这种现象称 为电泳(electrophoresis)。
许多生物分子如蛋白质、核酸、氨基酸、核苷酸等在 溶液中均带有一定的电荷，因此，电泳技术广泛应用 于这些物质的分离与鉴定。
电泳测定法ppt课件
• (18)考马斯亮蓝脱色液 取甲醇400ml 、冰醋酸100mI与水500ml混匀。
• 供试品溶液的制备 将供试品与供试品 缓冲液按3﹕1的比例混匀，100℃水浴加 热3～5分钟。
2021/6/2
• 测定法 • (1)制备分离胶溶液 按下表制成分
离胶溶液，灌入模具内至一定高度，加 水封顶，室温下聚合(室温不同，聚合 时间不同).
2021/6/2
• 将凝胶自银染液中取出，用水浸洗2次，每 次1分钟；然后将凝胶浸于显色液中，每隔 2分钟换液一次，直至蛋白条带显色完全； 将凝胶浸于终止液中10分钟后，取出凝胶 保存于水中。
• ②考马斯亮蓝法 将电泳后的凝胶浸入染 色液中过夜取出，浸入脱色液中，直至凝 胶底色几乎无色，取出凝胶保存在水中。
2021/6/2
(3) 分子质量要小，以便在等电点聚焦后 易于与被分离的高分子物质分离。
(4) 化学组成应与被分离的样品组分不同 ，以免干扰样品组分的检测。
(5) 与样品中各组分不会发生化学反应。
2021/6/2
• 两性电解质载体是由许多种多乙烯多胺( 如五乙烯六胺等)与丙烯酸进行加成反应 而制备得到的混合物。Ampholine， Pharmalyte等，相对 分子质量为300～ 1000，有不同的pH范围。如 pH3.5～5 、5～7、6～8、3～10、9～11等。
2021/6/2
用3层滤纸搭桥与巴比妥缓冲液(pH8.6) 接 触 ， 100V 恒 压 条 件 下 电 泳 2 小 时 ( 指
示 剂迁移到前沿)。电泳结束后，用0.5％ 氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背 景无色。
2021/6/2
项目 品种 白喉抗毒素
破伤风抗毒素 多价气性坏疽抗毒素
肉毒抗毒素 抗蝮蛇血清 抗眼睛蛇毒血清
• 供试品溶液的制备 将供试品与供试品 缓冲液按3﹕1的比例混匀，100℃水浴加 热3～5分钟。
2021/6/2
• 测定法 • (1)制备分离胶溶液 按下表制成分
离胶溶液，灌入模具内至一定高度，加 水封顶，室温下聚合(室温不同，聚合 时间不同).
2021/6/2
• 将凝胶自银染液中取出，用水浸洗2次，每 次1分钟；然后将凝胶浸于显色液中，每隔 2分钟换液一次，直至蛋白条带显色完全； 将凝胶浸于终止液中10分钟后，取出凝胶 保存于水中。
• ②考马斯亮蓝法 将电泳后的凝胶浸入染 色液中过夜取出，浸入脱色液中，直至凝 胶底色几乎无色，取出凝胶保存在水中。
2021/6/2
(3) 分子质量要小，以便在等电点聚焦后 易于与被分离的高分子物质分离。
(4) 化学组成应与被分离的样品组分不同 ，以免干扰样品组分的检测。
(5) 与样品中各组分不会发生化学反应。
2021/6/2
• 两性电解质载体是由许多种多乙烯多胺( 如五乙烯六胺等)与丙烯酸进行加成反应 而制备得到的混合物。Ampholine， Pharmalyte等，相对 分子质量为300～ 1000，有不同的pH范围。如 pH3.5～5 、5～7、6～8、3～10、9～11等。
2021/6/2
用3层滤纸搭桥与巴比妥缓冲液(pH8.6) 接 触 ， 100V 恒 压 条 件 下 电 泳 2 小 时 ( 指
示 剂迁移到前沿)。电泳结束后，用0.5％ 氨基黑溶液染色，再用脱色液脱色至背 景无色。
2021/6/2
项目 品种 白喉抗毒素
破伤风抗毒素 多价气性坏疽抗毒素
肉毒抗毒素 抗蝮蛇血清 抗眼睛蛇毒血清
生物分离工程 电泳65页PPT
财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
生物分离工程 电泳
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
生物分离工程 电泳
51、没有哪个社会可以制订一部永远 适用的 宪法， 甚至一 条永远 适用的 法律。 ——杰 斐逊 52、法律源于人的自卫本能。——英 格索尔
53、人们通常会发现，法律就是这样 一种的 网，触 犯法律 的人， 小的可 以穿网 而过， 大的可 以破网 而出， 只有中 等的才 会坠入 网中。 ——申 斯通 54、法律就是法律它是一座雄伟的大 夏，庇 护着我 们大家 ；它的 每一块 砖石都 垒在另 一块砖 石上。 ——高 尔斯华 绥 55、今天的法律未必明天仍是法律。 ——罗·伯顿
电泳技术(共21张PPT)
5 显色及分析 机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。
蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。
机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
第4页，共21页。
2 滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。
3 点样
分1 电离泳胶：：带小电孔粒径点子，在p圆H电8场.点中向（着与量其本少身电）荷相、反的点电极条移动状的过（程。一般），点中间（未知样品）、 点一边（已知样品） 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）
凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶） 4 操作要点
pH梯度支持介质的制备
聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去
第20页，共21页。
电泳技术思考题
1名词解释
电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、 相对迁移率、不连续凝胶电泳
2 影响泳动度的主要因素有哪些？
3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？
4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） →
CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢离子） 蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间 电泳时， Cl －超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较
低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P 压缩成层
Aa：茚三酮、靛红
干法、湿法 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。
优点：分辨率高，区带清晰、窄，加样部位自由，重现性好，可测定P或多肽的等电点。
蛋白：溴酚兰、氨黑10B、偶氮胭脂红B 根据要分离物质的相对分子质量选择合适的单体浓度。
机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。
第4页，共21页。
2 滤纸的选择与处理 层析用滤纸，纸宽2～3cm/样品组分，长短影响电场强度。
3 点样
分1 电离泳胶：：带小电孔粒径点子，在p圆H电8场.点中向（着与量其本少身电）荷相、反的点电极条移动状的过（程。一般），点中间（未知样品）、 点一边（已知样品） 点圆点（量少）、点条状（一般），点中间（未知样品）、点一边（已知样品）
凝胶（如聚丙烯酰胺凝胶） 4 操作要点
pH梯度支持介质的制备
聚焦电泳 检测 两性电解质载体的除去
第20页，共21页。
电泳技术思考题
1名词解释
电泳、电泳分离技术、泳动度、电渗、区带电泳、 相对迁移率、不连续凝胶电泳
2 影响泳动度的主要因素有哪些？
3 区带电泳的操作步骤一般有哪些？
4 如何制备聚丙烯酰胺凝胶？
CH2(NH2)COOH → (样品胶、浓缩胶pH6.7~6.8） →
CH2(NH2)COO－（0.1％～1.0％）泳动速度最慢（慢离子） 蛋白质（P）泳动速度介于快慢离子之间 电泳时， Cl －超过P走在最前面，其后形成一个离子浓度较
低的低电导区→较高电位梯度→P和慢离子加速移动→P 压缩成层
Aa：茚三酮、靛红
干法、湿法 分类：垂直管型盘状电泳、垂直板型电泳；
1 电泳：带电粒子在电场中向着与其本身电荷相反的电极移动的过程。
生物化学技术__电泳_PPT教案
固定和谱带检测
固定：7%乙酸或12.5%三氯乙酸 谱带检测
染色法 荧光探针法 特殊试剂染色法
根据支持介质形状不同，可分为： •薄层电泳 •板电泳 •柱电泳
• 据用途不同，可分为： •分析电泳 •制备电泳 •定量电泳 •免疫电泳
第一节 电泳的基本原理
▪ 电泳是在电场作用下产生的物质运动。
在一定的电场强度下，带电颗粒(分子)在电 场中的迁移方式主要依据分子大小和形状、分 子所带电荷或分子的生物学与化学特性。
核黄素经光照后再被痕量氧氧产生自由基， 引发聚合反应。
丙烯酰胺聚合时常用的催化系统
引发剂
过硫酸铵 （AP）
加速剂 N,N,N′,N′-四甲基乙二胺 （TEMED）
3-二甲胺丙腈
3-二甲胺丙腈亚硫酸盐
应用范围 AP
酸性系统
核黄素
TEMED
碱性系统 （光聚合）
化学聚合与光聚合的比较
加样需注意
制备样品时，离子浓度不宜太高 蔗糖浓度小于20% 样品液中的沉淀和混浊需除去 阴离子系统用溴酚蓝作指示剂，负极在上；
阳离子系统用甲基绿或次甲基绿作指示剂， 正级在上。
一般操作
步骤：
摆好玻璃管 制备分离胶 预电泳：除去AP、未聚合丙烯酰胺、杂质 制备浓缩胶 加样 电泳：先低电流，样品进胶后，调至所需电流 取胶 固定和谱带检测 迁移率测定 谱带保存
微量TEMED的加入，可使过硫酸铵形成自由基，这些 自由基的产生可引发丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺的聚合、 交联反应，形成有一定平均孔径的聚丙烯酰胺凝胶。
化学催化——酸性系统
引发剂：过硫酸铵(AP) 过氧化氢
加速剂：硫酸亚铁-抗坏血酸（Vc)
光聚合催化系统
引发剂：核黄素 加速剂：TEMED可以加速聚合
《生化实验电泳》PPT课件
精选PPT
7
生物化学教研室 朱欣婷
二、影响电泳速度的因素
1.样品本身：
分子带电量： Q越多，u越大； 分子大小： 分子小，r越小，u越大； 分子形状：形状越小，与支持物介质摩擦越小，u越大。
球形分子 > 纤维状分子
精选PPT
生物化学教研室
8
朱欣婷
2.缓冲溶液：
pH值：(pH-pI)越大，Q越多，u越大
精选PPT
4
生物化学教研室 朱欣婷
（一）电 泳 技 术
(electrophoresis)
电泳：带电粒子在电场的作用下向着与其电性 相反的电极移动的现象。
电泳技术:指利用电泳现象对混合物进行分离分 析的技术。
精选PPT
5
生物化学教研室 朱欣婷
一、电泳的原理
以蛋白质为例：
COO-
H＋
Pr
OH－
NH2
精选PPT
28
生物化学教研室 朱欣婷
离子强度(I)： I越大，电动电势越小，u越小； I越小，电动电势越大，u越大， 但样品易扩散。
离子强度如果过低，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH恒 定
选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围 在0.02～0.2之间。
精选PPT
9
生物化学教研室 朱欣婷
3.电场强度(X)
电场强度：电泳支持物上每厘米的电位降，也称电势梯度。
X越大，u越快。 支持物越短， X越大， u越快。
电场强度越大或支持物越短，电流将随之增加，产热也增 加，影响分离效果。
在进行高压电泳的时候必须用冷却装置，否则可引起蛋 白质等样品发生热变性而无法分离。
精选PPT
10
生物化学教研室 朱欣婷
电泳分离PPT课件
胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相， 比纸电泳分辨率高。
❖以上两种类型的电泳，由于介质的孔径 度大，没有分子筛效应，主要靠被分离 物的电荷多少进行分离。
4
第54页/共48页
③琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多
糖，一般用于核酸的分离分析。
（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应； （2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用； （3）无毒； （4）染色、脱色程序简单，背景色较低； （5）热可逆性； （6）生物中性：一般不与生物材料结合。
四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )
利用蛋白质具有不同等电点的特性，以 聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体 两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有 各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。
32
第332页/共48页
2）光催化系统：核黄素－光
催化剂: 核黄素（维生素B2）
引发剂: 光
.
TEMED的存在，可加速聚合。
15
第165页/共48页
聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成
16
第176页/共48页
凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着 度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein) 在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只 与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。
24
第254页/共48页
两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对
数呈线性关系，符合下式：logMW=C-bm MW：分子量；m：迁移率；C、b均为常数
❖以上两种类型的电泳，由于介质的孔径 度大，没有分子筛效应，主要靠被分离 物的电荷多少进行分离。
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第54页/共48页
③琼脂糖凝胶电泳：从琼脂中精制分离出的胶状多
糖，一般用于核酸的分离分析。
（1）琼脂糖凝胶孔径较小，具有分子筛效应； （2）机械强度高：可以在浓度1%以下使用； （3）无毒； （4）染色、脱色程序简单，背景色较低； （5）热可逆性； （6）生物中性：一般不与生物材料结合。
四、等电聚焦 ( isoelectric focusing，IEF )
利用蛋白质具有不同等电点的特性，以 聚丙烯酰胺为电泳支持物，在其中加入载体 两性电解质（商品名：Ampholine，一种含有 各种连续 pI 的小分子混合物）的电泳方法称 聚丙烯酰胺等电聚焦电泳（IEF-PAGE）。
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第332页/共48页
2）光催化系统：核黄素－光
催化剂: 核黄素（维生素B2）
引发剂: 光
.
TEMED的存在，可加速聚合。
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聚丙烯酰胺凝胶： 丙烯酰胺＋N,N’－甲叉双丙烯酰胺聚合而成
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凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶的机械强度、弹性和透明度、粘着 度取决于凝胶总浓度（T）和交联度（C）。
因此，蛋白质—SDS复合物(SDS-denatured protein) 在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只 与椭圆棒长度（蛋白质分子量）有关。
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两者关系：蛋白质的迁移率与分子量的对
数呈线性关系，符合下式：logMW=C-bm MW：分子量；m：迁移率；C、b均为常数
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• “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我 笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
（一）、电泳介质
丙烯酰胺（单体） + 甲叉双丙烯酰胺（交联剂）
催化剂
三维网状结构的凝胶
ppt课件
5
T=（a+b）/ m × 100% C= b /（a+b） × 100%
12
③、电位梯度的不连续性
电泳开始后，由于Cl-的迁移率最大，很 快超过蛋白质，因此在Cl-的后边形成一个离 子浓度低的区域即低电导区。在低电导区就 有较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白 质和慢离子在快离子后面加速移动。
ppt课件
13
④pH的不连续性
分离胶 12%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH8.8）
ppt课件
20
1、原理
①、SDS + 蛋白质
巯基 乙醇
蛋白质-SDS复合物
1.4g 1g
SDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，通 过断裂氢键，破坏蛋白质的空间结构。 巯基乙醇：还原剂，破坏二硫键 SDS和巯基乙醇同时作用：能将蛋白质解聚成多肽链
ppt课件
21
SDS + 蛋白质
巯基 乙醇
蛋白质-SDS复合物
第八章 电泳分离技术
ppt课件
1
一、电泳概念
电泳：是指在电场作用下，带电颗粒向带相 反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。
ppt课件
2
精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
（一）、被分离物质的本性（内部因素） 1、结构（形状） 2、电荷 3、大小
ppt课件
26
（二）、外部因素
1、支持介质 蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
ppt课件பைடு நூலகம்
27
（1）、介质可能对样品物质有吸附作用
（2）、电渗作用 电渗就是在电泳过程中，由于支持物吸
附水合离子（H3O+）或OH-，使溶液相对带正 电或负电，在电场作用下溶液向相反的方向 移动，这一现象称电渗。
ppt课件
7
（三）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
加样
样品 迁移 方向
ppt课件
8
1、不连续PAGE电泳：用浓缩胶（上层胶）和分 离胶（下层胶）两种不同浓度，不同pH的凝胶灌制 凝胶板，通过电荷效应，浓缩效应和分子筛效应， 达到蛋白质高分辨率的分离。
分离胶 12%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH8.8）
电渗方向与离子分离方向相同→加速 电渗方向与离子分离方向相反→减速
浓缩胶：大孔胶 分离胶：小孔胶
样品在大孔与小孔凝胶的界面 处浓缩，区带变窄。
浓缩胶 分离胶
ppt课件
11
②缓冲离子成分的不连续性
上电极缓冲液：（Tris+ Gly- ）
浓缩胶： 分离胶：
（Tris+ Cl-）
下电极缓冲液pH：（Tris+ Gly- ）
Cl-：为快离子
Gly-（甘氨酸，pH6.8）pp：t课件为慢离子
浓缩胶 3.5%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH6.8）
电泳缓冲液（Tris-glycine（甘氨酸）， pH8.3）
浓缩胶与分离胶之间pH的不同，可以控制甘氨
酸的解离度，从而控制ppt其课件有效迁移率。
14
浓缩胶pH=6.8：使慢离子较所有被分离样 品的有效迁移率低。 氯离子>蛋白质>甘氨酸
a：丙烯酰胺的质量（g） b：甲叉双丙烯酰胺的质量（g） m：缓冲液的终体积（mL） T：两个单体的总百分浓度 C：与总浓度有关的交联百分浓度
凝胶的机械强度和孔径大小等由T和C
两个参数决定。
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6
（二）、分类
根据凝胶孔径和缓冲体系的不同： v连续电泳 v不连续电泳
根据样品的处理方式不同： vSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 v常规（非变性）电泳
分离胶pH=8.8：使慢离子的有效迁移率比 所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离 子界面的影响。 氯离子>甘氨酸>蛋白质
甘氨酸的pI=5.97
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15
三种负离子（快离子、慢离子和蛋白 质）移动速度相同时，则快离子和慢离子 之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的 界面。由于蛋白质样品的有效迁移率恰好 介于快慢离子之间，因此也就聚焦在这个 移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的 中间层。
1.4g 1g
引入的净电荷大约为蛋白质本身的净电 荷的10倍，消除了蛋白质原有电荷的影响。
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22
②、SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象 的改变。
蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状为长 椭圆棒，短轴长度都一样，约为10Å，而长轴 则随蛋白质的分子量成正比地变化。
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23
影响PAGE电泳的内部因素： 电荷，形状和大小
影响SDS-PAGE电泳的内部因素： 大小
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24
2、应用：测定蛋白质亚基分子量
选用已知分 子量的标准 蛋白质，与 分子量未知 的待测蛋白 质样品在同 一条件下进 行SDSPA G E 电 泳 。
蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率和分子
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25
量的对数成线性关系。
三、影响电泳分离的因素
ppt课件
16
②、分子筛效应（浓缩胶没有）
分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径 的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不 同的迁移率。
③、电荷效应 每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁
移率不同。
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17
小结
样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行的， 电荷效应与分子筛效应主要是在分离胶中 进行的。
在蛋白质样品进入分离胶时，慢离子 跑到蛋白质前面去，高电势梯度消失，使 蛋白质进入到均一电势梯度和pH的分离胶 中。
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18
（四）连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
指整个电泳体系所用的缓冲液成分、pH、凝 胶孔径都相同，主要依据分子筛效应和电荷 效应分离蛋白质。
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19
（五）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
浓缩胶 3.5%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH6.8）
电泳缓冲液（Tris-glycine（甘氨酸）， pH8.3）
不同的pH，氯离子和甘p氨pt课酸件 将会在电泳中发挥作用9
2、样品分离原理 （1）样品的浓缩效应 （2）凝胶的分子筛效应 （3）电荷效应
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10
（1）样品的浓缩效应
电泳介质的四个不连续性，使样品在 电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离 。 ①、凝胶层的不连续性
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
二、聚丙烯酰胺凝胶电泳
（一）、电泳介质
丙烯酰胺（单体） + 甲叉双丙烯酰胺（交联剂）
催化剂
三维网状结构的凝胶
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T=（a+b）/ m × 100% C= b /（a+b） × 100%
12
③、电位梯度的不连续性
电泳开始后，由于Cl-的迁移率最大，很 快超过蛋白质，因此在Cl-的后边形成一个离 子浓度低的区域即低电导区。在低电导区就 有较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白 质和慢离子在快离子后面加速移动。
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④pH的不连续性
分离胶 12%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH8.8）
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1、原理
①、SDS + 蛋白质
巯基 乙醇
蛋白质-SDS复合物
1.4g 1g
SDS：十二烷基硫酸钠，一种阴离子表面活性剂，通 过断裂氢键，破坏蛋白质的空间结构。 巯基乙醇：还原剂，破坏二硫键 SDS和巯基乙醇同时作用：能将蛋白质解聚成多肽链
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SDS + 蛋白质
巯基 乙醇
蛋白质-SDS复合物
第八章 电泳分离技术
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1
一、电泳概念
电泳：是指在电场作用下，带电颗粒向带相 反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。
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精品资料
• 你怎么称呼老师？
• 如果老师最后没有总结一节课的重点的难点，你 是否会认为老师的教学方法需要改进？
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭
（一）、被分离物质的本性（内部因素） 1、结构（形状） 2、电荷 3、大小
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（二）、外部因素
1、支持介质 蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。
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（1）、介质可能对样品物质有吸附作用
（2）、电渗作用 电渗就是在电泳过程中，由于支持物吸
附水合离子（H3O+）或OH-，使溶液相对带正 电或负电，在电场作用下溶液向相反的方向 移动，这一现象称电渗。
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（三）不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
加样
样品 迁移 方向
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1、不连续PAGE电泳：用浓缩胶（上层胶）和分 离胶（下层胶）两种不同浓度，不同pH的凝胶灌制 凝胶板，通过电荷效应，浓缩效应和分子筛效应， 达到蛋白质高分辨率的分离。
分离胶 12%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH8.8）
电渗方向与离子分离方向相同→加速 电渗方向与离子分离方向相反→减速
浓缩胶：大孔胶 分离胶：小孔胶
样品在大孔与小孔凝胶的界面 处浓缩，区带变窄。
浓缩胶 分离胶
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②缓冲离子成分的不连续性
上电极缓冲液：（Tris+ Gly- ）
浓缩胶： 分离胶：
（Tris+ Cl-）
下电极缓冲液pH：（Tris+ Gly- ）
Cl-：为快离子
Gly-（甘氨酸，pH6.8）pp：t课件为慢离子
浓缩胶 3.5%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH6.8）
电泳缓冲液（Tris-glycine（甘氨酸）， pH8.3）
浓缩胶与分离胶之间pH的不同，可以控制甘氨
酸的解离度，从而控制ppt其课件有效迁移率。
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浓缩胶pH=6.8：使慢离子较所有被分离样 品的有效迁移率低。 氯离子>蛋白质>甘氨酸
a：丙烯酰胺的质量（g） b：甲叉双丙烯酰胺的质量（g） m：缓冲液的终体积（mL） T：两个单体的总百分浓度 C：与总浓度有关的交联百分浓度
凝胶的机械强度和孔径大小等由T和C
两个参数决定。
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（二）、分类
根据凝胶孔径和缓冲体系的不同： v连续电泳 v不连续电泳
根据样品的处理方式不同： vSDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 v常规（非变性）电泳
分离胶pH=8.8：使慢离子的有效迁移率比 所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离 子界面的影响。 氯离子>甘氨酸>蛋白质
甘氨酸的pI=5.97
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三种负离子（快离子、慢离子和蛋白 质）移动速度相同时，则快离子和慢离子 之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的 界面。由于蛋白质样品的有效迁移率恰好 介于快慢离子之间，因此也就聚焦在这个 移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的 中间层。
1.4g 1g
引入的净电荷大约为蛋白质本身的净电 荷的10倍，消除了蛋白质原有电荷的影响。
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②、SDS与蛋白质结合后，引起了蛋白质构象 的改变。
蛋白质-SDS复合物在水溶液中的形状为长 椭圆棒，短轴长度都一样，约为10Å，而长轴 则随蛋白质的分子量成正比地变化。
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影响PAGE电泳的内部因素： 电荷，形状和大小
影响SDS-PAGE电泳的内部因素： 大小
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2、应用：测定蛋白质亚基分子量
选用已知分 子量的标准 蛋白质，与 分子量未知 的待测蛋白 质样品在同 一条件下进 行SDSPA G E 电 泳 。
蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率和分子
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量的对数成线性关系。
三、影响电泳分离的因素
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②、分子筛效应（浓缩胶没有）
分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径 的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不 同的迁移率。
③、电荷效应 每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁
移率不同。
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小结
样品的浓缩效应是在浓缩胶中进行的， 电荷效应与分子筛效应主要是在分离胶中 进行的。
在蛋白质样品进入分离胶时，慢离子 跑到蛋白质前面去，高电势梯度消失，使 蛋白质进入到均一电势梯度和pH的分离胶 中。
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（四）连续聚丙烯酰胺凝胶电泳
指整个电泳体系所用的缓冲液成分、pH、凝 胶孔径都相同，主要依据分子筛效应和电荷 效应分离蛋白质。
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（五）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
浓缩胶 3.5%凝胶浓度 （Tris-HCl， pH6.8）
电泳缓冲液（Tris-glycine（甘氨酸）， pH8.3）
不同的pH，氯离子和甘p氨pt课酸件 将会在电泳中发挥作用9
2、样品分离原理 （1）样品的浓缩效应 （2）凝胶的分子筛效应 （3）电荷效应
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（1）样品的浓缩效应
电泳介质的四个不连续性，使样品在 电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离 。 ①、凝胶层的不连续性