慢病毒载体及其应用的研究进展_毛颖佳

中国图书分类号Q782R392.11文献标识码A文章编号1004-5503（2009）02-0196-05【综述】慢病毒载体及其应用的研究进展毛颖佳综述郑源强石艳春审校【摘要】与其他载体相比，慢病毒载体具有携带基因片段容量大、转染效率高、可感染分裂细胞及非分裂细胞、目的基因可在宿主细胞中长时间稳定表达以及安全性好等诸多优点，现已成为转移目的基因的理想载体。

本文主要就慢病毒载体及其在基因治疗、生物医药与科学研究等领域的研究进展作一综述。

【关键词】慢病毒载体；基因治疗Progress in Study on Lentiviral Vectors and Their ApplicationMAO Ying-jia,ZHENG Yuan-qiang,SHI Yan-chun（Research Center of Molecular Biology,Inner Mongolia Medi－cal College,Huhehot010059,China）【Abstract】Nowadays lentiviral vectors（LVs）is the only desire ideal genetic vector system which affords both efficient and sta－ble gene delivery.In contrast to other vectors,LVs can persist in dividing and non-dividing cells.Their virtues also include large ca－pacity of interested gene fragment and satisfied safety.The development of LVs and their application in gene therapy,biological prod－ucts and scientific research are reviewed in this paper.【Key words】Lentiviral vector;Gene therapy慢病毒（Lentivirus）属逆转录病毒科（Retrovidae），为RNA病毒。

慢病毒载体（Lentiviral vector／len-tivector，LV）来源于包括人类免疫缺陷病毒、猫免疫缺陷病毒、猴免疫缺陷病毒、马传染性贫血病毒在内的许多物种，由于与其他载体相比有诸多优势，现已成为理想的基因转移载体，广泛应用于基因治疗、疫苗生产以及科学研究等领域。

1.慢病毒载体的发展1.1病毒载体概述：载体是供插入目的基因并将其导入宿主细胞内表达或复制的运载工具。

目前所用的载体按来源，可分为病毒载体和非病毒载体。

与非病毒载体相比，病毒载体具有转染效率高、可在体内稳定表达等优点。

目前，最常用的病毒载体是经过人工改建、携带有正常人类DNA的病毒。

它充分利用了病毒高度进化所具有的靶细胞定向感染性、宿主细胞寄生性以及高转导效率的特点，因而成为基因治疗研究和临床应用的主要工具。

但目前常用的病毒载体如逆转录病毒载体，由于可因随机整合引起插入突变、病毒颗粒可经免疫反应而迅速降解、经其携带进入宿主基因组的外源基因容易发生基因沉默等原因，限制了其应用；而腺相关病毒由于感染效率低，目的基因瞬时表达以及单链基因组在整合之前需要形成双链DNA而限制了其应用。

因此，很多学者把目光投向了以Ⅰ型人类免疫缺陷病毒（HIV-1）为代表的慢病毒载体的研究［1］。

1.2慢病毒载体：慢病毒属逆转录病毒科，为二倍体RNA病毒。

早期的慢病毒载体主要来源于HIV-1［2］，之后出现了以猫免疫缺陷病毒（Feline imm-unodeficiency virus，FIV）为代表的非灵长类慢病毒载体系统［3］。

随着生物技术的发展，慢病毒载体系统得到了极大的发展，相继发现了各种有蹄类动物的慢病毒，包括马传染性贫血病毒（Equine infectious anemiavirus，EIAV）［4］、山羊类关节炎-脑炎病毒（Caprine arthritis-encephalitis virus，CAEV）［5］、牛免疫缺陷病毒（Bovineimmunodeficiency virus，BIV）［6］和绵羊髓鞘脱落病毒（Visna virus）［7］等。

非灵长类慢病毒载体在人类基因治疗中的相关生物安全性问题尚需进一步研究和证实，例如亲代病毒能否在人体完成复制或引起人类疾病。

而随着人们对HIV-1更加深入的了解，现已有20多种抗逆转录病毒药物可以用于抑制HIV-1来源的具复制活性的逆转录病毒（Re-plication competent retrovirus，RCR）［8］。

因此，目前最令人关注的是以HIV-1为基础构建的慢病毒载体。

慢病毒载体是以慢病毒基因组为基础，除去其复制所需的基因，以治疗性基因和选择性标记物构建而成，转移基因片段容量大，无毒性且不易诱发宿主免疫反应，安全性较好，不仅能感染分裂细胞，且能基金项目：教育部"春晖计划"（Z2007-1-01004）；内蒙古医学院重大项目（NY2006ZD005）.作者单位：内蒙古医学院分子生物学研究中心（呼和浩特010059）.通讯作者：石艳春，E-mail：ycshi5388@转染终末分化细胞和非分裂细胞（如神经细胞、干细胞、肌纤维细胞、视网膜和肝细胞等），整合于靶细胞基因组的目的基因能够长期、稳定表达［9］。

基于上述优点，慢病毒载体已成为当前基因转移载体研究的热点。

2.慢病毒载体的应用2.1用于肿瘤治疗2.1.1慢病毒载体联合RNA干扰技术（RNAi）治疗肿瘤：RNAi技术的出现为恶性肿瘤的治疗带来新的希望，同时慢病毒载体以其宿主广泛、能够稳定转染复制及静止期细胞等独特的优势，在基因治疗的研究中得到了广泛的应用［10］。

慢病毒载体能够高效地传递肿瘤相关基因的短发夹RNA（shRNA），进行转录后沉默，使目的基因的表达受到抑制，减少其在肿瘤发展以及肿瘤侵袭中的促进作用，因而起到治疗作用。

在胰腺癌的治疗中，用慢病毒载体携带在胰腺癌中高表达的高迁移率蛋白（HMGA1）的shRNA，即shHMGA1，转染高度恶性胰腺腺癌细胞系（MiaPaCa2和PANC1），可使90%的HMGA1基因表达沉默［11］。

2.1.2提高肿瘤对传统化疗药物的敏感性：很多恶性肿瘤对于化疗药物敏感性低，或者经过短期治疗后，对药物易产生耐受，这是许多恶性肿瘤难以治愈的原因之一。

高度耐药性已经成为人类肿瘤的一个重要的特点，通常是由多药耐药性（Multidrug resis-tance，MDR）相关基因引起的。

Siming等［12］在鼻咽癌的研究中，选择在人类多种恶性肿瘤中高表达的ABCC2（一种ATP结合盒多药耐药转录蛋白），用慢病毒载体携带其shRNA，转染化学依赖性抗顺铂的鼻咽癌细胞系CNE2细胞，使CNE2细胞对化疗药物顺铂的敏感性得到了提高。

提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性可大大提高治疗效果。

进展期卵巢癌对铂类药物和紫杉醇类药物的联合化疗在初期具有敏感性，但不久后在大多数病例中都会产生耐药性。

有学者证明，在体外肝细胞生长因子（Hepatocyte growth factor，HGF）能够促进经顺铂和紫杉醇治疗的人卵巢癌细胞系死亡。

用慢病毒载体携带HGF基因，转染SK-OV-3和NIH: OVCAR-3卵巢癌细胞，获得了稳定的自分泌和旁分泌HGF活性。

体外培养的HGF分泌细胞未显示出增殖率和生存率的变化，但是对顺铂和紫杉醇激发的杀伤作用具有高敏感性。

在体内适当的治疗范围内，自分泌及旁分泌HGF使肿瘤细胞对低剂量的药物敏感，而对正常细胞没有影响［13］。

上述结果表明，体内HGF基因治疗可能会使卵巢癌细胞对传统化疗药物更为敏感。

2.1.3促进肿瘤细胞凋亡：肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（Tumor necrosis factor related apoptosis indu-cing ligand，TRAIL）是近年来发现的一种凋亡分子，其只诱导肿瘤细胞凋亡，而不会对机体正常组织产生毒性效应，这一特点使其在肿瘤的免疫治疗中具有潜在的应用价值，联合其他药物能够提高对肿瘤的治疗效果。

在神经胶质瘤的研究中，Kock等［14］构建了携带shBcl-2和分泌型TRAIL，即S-TRAIL的慢病毒传递系统进行体外转导，结果在Bcl-2表达下调的同时表达S-TRAIL，起到了诱导神经胶质瘤细胞凋亡的目的，使神经胶质瘤完全根除。

因此，通过TRAIL 介导的死亡受体途径和shRNA下调Bcl-2的表达促进神经胶质瘤的消亡可作为一个模板，促进耐药性恶性肿瘤的治疗。

2.1.4过继疗法用于肿瘤治疗：慢病毒载体介导的T细胞受体（Tcell receptor，TCR）基因转导可用于肿瘤过继细胞疗法。

然而，现有过继细胞疗法中很多因素还需要优化，如特异性、亲和力、分化水平和T淋巴细胞的转移数量等，这些因素会影响其免疫活性和体内功能。

特别是需要缩短体外扩增周期，并获得大量的肿瘤反应性T细胞，来促进恶性肿瘤的退化，使TCR基因转移成为一个可行的策略，以克服过继细胞疗法的限制性。

HIV的慢病毒载体具有其他载体系统无法比拟的优势，更适合于供者T细胞在体外进行操作［15］。

Yang等［16］用VSV-G假型第3代慢病毒载体携带特异抗肿瘤TCR，转染外周血淋巴细胞，结果经TCR转化的外周血淋巴细胞出现了特异性抗肿瘤活性，包括释放γ-干扰素和细胞溶解。

2.1.5在肿瘤疫苗中的应用：慢病毒载体免疫原性低，且可用于转导不同的细胞种类，包括树突状细胞。

树突状细胞能够有效地激活初始T细胞，在肿瘤的免疫治疗中得到了广泛的应用。

用慢病毒载体转染的树突状细胞经过一系列不同的肿瘤抗原刺激后，能够充分发挥其作为抗原提呈细胞的作用，对目的肿瘤相关抗原进行有效摄取、加工处理和提呈，诱导抗原特异性T细胞的强烈反应［17］。

这种方法给树突状细胞疫苗的研究带来了希望，理论上可用于所有患者，并能显著降低慢病毒载体疫苗的生产与应用的成本。

2.2用于HIV感染的治疗HIV感染需要持续性的治疗来抑制病毒的复制。

研究证明，目前使用的抗逆转录病毒药物能够有效延长从病毒感染到艾滋病症状出现的时间［18］。

然而，化学治疗具有其固有的缺陷，包括毒性及病毒突变，使患者对抗逆转录病毒药物表现出抗药性。

因此，许多研究者将目光集中在HIV的基因治疗上，并进行了深入的研究。

慢病毒载体用于治疗HIV-1感染具有以下优势：首先，慢病毒载体能够稳定转染分裂细胞及非分裂细胞，特别是那些与HIV-1复制和免疫恢复（Immune restoration）相关的细胞，如T细胞、造血干细胞、树突状细胞等。