细胞的冻存和复苏

背景知识：

细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。

细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜(DMSO)作保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。

细胞冻存

操作步骤：

1. 配制含6-10%DMSO的10%小牛血清的冻存培养液，冰上预冷；

2. 取对数生长期的细胞，用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则直接将细胞移至15ml离心管；

3. 离心500rpm，5min；

4. 去除胰蛋白酶及旧的培养液，由慢至快，滴入配制好的冻存培养液，用吸管轻柔吹打使细胞均匀（在冰上进行）；一般一个小方瓶冻一支或者一个10cm培养皿冻2支。

5. 将细胞分装入冻存管中，每管1ml（若冻存多于1支，则每支要均匀分装）；

6. 在冻存管上标明细胞的名称，冻存时间及操作者；

7. 冻存：放入装有异丙醇的程序降温盒中，-70℃冰箱中放3天左右，取出冻存管，移入液氮容器内。

注意事项：

1．从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞。在冻存前一天最好换一次培养液；

2．将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤；

3．冻存和复苏最好用新配制的培养液。

细胞复苏

操作步骤：

1. 从液氮容器中取出冻存管，迅速浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化；

2. 当最后一小块冰快融化时，将冻存管放在冰浴上。

3. 用吸管吸出细胞悬液，由慢至快滴入已经加10倍以上冻存液的培养皿中，轻轻混匀；

4. 第二天，换培养液

或者3. 用吸管吸出细胞悬液，由慢至快滴入已经加10倍以上冻存液的离心管中，轻轻混匀；离心， 500rpm，5min；

4. 弃去上清液，加培养液吹匀，转至培养皿。

注意事项：

1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套，护目镜。细胞冻存管可能漏入液氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。

2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作较大，因此，必须在1-2min内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO）最好选择进口产品。

3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。

4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基亚砜（DMSO），DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒净，且一定倒干净。在试验中按照常规的离心分装的方法进行复苏，结果无异常。

5. 细胞贴壁少的问题：教科书中说明冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml－15m培养液，而经验总结为培养基越少细胞越容易贴附。

6. 复苏细胞分装的问题：试验中的经验总结为复苏1管细胞一般可分装到1-2只培养瓶中，分装过多，细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。

7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是DMSO的浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞生长，从以前的资料来看，DMSO的浓度在小于%的时候对一般细胞没有什么影响，还有一个说法是1％。所以如果你的冻存液的浓度是10％DMSO的话那么加10ml 以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度。