细胞污染及处理方法

细胞污染及处理方法总结

洁净区,并不就是没有细菌，而就是细菌得数量非常少,国家标准10０级得洁净标准就是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿、而国外得标准比我国得还要高一点，要求得数量更少.

所以在我们得洁净操作台里,并不就是真正一个细菌都没有得，所以在操作得时候还就是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌得数量。

所以处理细菌污染得重要原则就就是:无限地稀释细菌得浓度,无限地减少细菌得数量!

一、细菌污染

培养基:颜色发红,液体清亮或浑浊；

显微镜下:有黑点或杆状物在到处游走，细胞部分脱落，出现细胞碎片;

成像：

图一：杆菌污染

图二:白色链球菌

以下就是摘自丁香园得处理方法：

1）、将污染得培养液倒掉，转烧瓶口,加入１0mlＰBS,适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。转烧瓶口。

2）、继续加入10mｌPBS,同样方法晃动,清洗培养瓶，然后倒掉。

3）、继续加入５ｍlPBS，同样方法洗瓶,主要就是培养面，然后倒掉。

4）、重复步骤3再洗.

5）、重复步骤3再洗。

6）、加入3－5ml双抗，洗瓶,静置3-5分钟,然后吸出。

7）、加入3ｍl双抗,洗瓶,静置3—5分钟，然后吸出。

8）、再加入5mｌPＢS洗瓶,然后吸出。

9）、加入10mｌ培养液,加入2ml双抗,放置培养箱培养,５小时之后，倒掉培养基,加入PBS洗瓶两次,然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机8００—１０00r/ｍiｎ离心,然后洗一次。置于新得培养瓶里培养，培养体系加入2ｍl双抗.

10）、24h之后,视情况换液,若仍然污染严重,培养基浑浊，重复以上步骤,若瞧不到污染物,则继续步骤1）、3）、4)、6）、８），然后加入培养液培养，培养体系加入2mｌ双抗、

11）、２4h之后，若仍污染严重,可再重复一次，若还污染只能弃之（不过一般没有出现这种情况)，若镜下不见污染物,则换液ＰBS洗瓶，正常培养.

（常见为金黄色葡萄球菌与大肠杆菌)

若细胞状态极差,尽早处理掉细胞，并找出污染源,对培养箱，生物安全柜,细胞房进行消毒处理。

二、真菌污染

培养基:有得培养液清亮，不变色；

显微镜下：有丝状物,有些真菌开始很像死细胞碎片，只就是它很多很多得小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清,慢慢得会长出很细得黑色丝状物。真菌生长得比较慢，不象细菌那么容易被发现，但就是一旦发现有它得存在细胞就被污染了,也很难救活了。

成像：

图三：瞧上去像白色念珠菌污染

处理方法:若为霉菌或者真菌污染，加入两性霉素B清洗与培养,终浓度一般为2、5μｇ／ml(在3０μg/ｍl时会有细胞毒性）。另外也可以选择在培养基里加３ug／ml得制霉菌素或放线菌素D.其它操作同细菌。

三、霉菌污染

培养基:培养液就是清亮得;

显微镜下：絮状杂质,镜下可见呈细丝状得团状漂浮物，可瞧到明显得菌丝,细胞仍可生长,但时间长之后，细胞得活力状态变差；

成像:

处理方法：预防霉菌污染，可在培养基里加3u/mｌ得两性霉素或制霉菌素或放线菌素D或双抗；（原来我们这里也有霉菌感染得,不过后面在培养基里加上了0、５%得大福康（原来得双抗各改为０、２5%得青霉素与链霉素)摘自丁香园)，效果还可以！您可以试试!！！但细胞一旦污染，很难挽救,制霉菌素或放线菌素D或双抗都于事无补,建议舍弃该污染细胞。,将环境彻底消毒,如果所有细胞都污染，可能就是系统污染,检查一下培养基与器材,如果只就是个别污染，可能就是操作问题，就要注意操作。

霉菌污染多来自空气，所以做实验时说话聊天,或瓶口敞开时间太长,还有培养箱开关频繁就是主要原因,还就是多找自身原因、

四、支原体污染

支原体污染后,不会立即使细胞死亡，可以与细胞长期共存,培养基一般不发生浑浊，细胞无明显变化，外观上给人以正常感觉，实则细胞收到多方面潜在影响,如引起细胞变形, 影响ＤＮＡ合成，抑制细胞生长等。

培养基:可能无明显表现；

显微镜下:慢慢会使细胞状态变差，生长变慢，在显微镜下观察可能会有小黑点,但培养基一般不发生浑浊.细胞传代以后就出现细胞间黑点,细胞空泡化，很多类似凋亡、坏死得细胞，最终细胞漂浮,完全死亡。细胞生长缓慢，或者出现无明显诱因脱落，凋亡，细胞碎片增多，有得甚至只表现为细胞状态日渐不佳.

成像：

处理方法：采用支原体清除剂，有同学说用泰乐处理支原体污染效果比较好。用泰乐菌素，兽用支原体病得药,但可用于细胞培养,无任何不良反应.Sｉgma公司得使用时用50ug/mｌTyloｓiｎ培养液培养6天或连续传两代即可清除支原体污染。如果作为常用得抗生素得话，建议用8ug／ml得浓度。

一般处理起来比较复杂，因此多放弃细胞重新培养。

五、黑胶虫污染

培养基：可能无明显表现，或液体颜色异样

显微镜下：大量黑点原地震动,与细菌污染相鉴别，细胞状态不佳。有得因细胞密度较高,或细胞增殖较快,细胞代谢产物增多，要注意鉴别.

成像:

处理方法:黑胶虫在科研领域还就是很未知得啊。所以没有什么好得应对方法.预防为主！！还就是要强调无菌操作啊！！尤其注意血清得质量！这个就是主要来源。一般建议用北美血清,这个黑胶虫污染会概率小.

六、原虫污染

培养基:培养液可轻微浑浊

显微镜下：细小得点状物数量非常多，轻微活动,细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好,边缘不清楚，细胞不透亮。她们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生就是非常普遍得，但她们得数量小,细胞占优势所以不会影响到细胞得正常生长,只有当她们到达一定得数量时就会影响到细胞得生长，最终形成恶性循环。

成像：

处理方法:

在操作得过程中，一定要小心操作动作，轻柔缓慢，切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。这个拯救细胞还就是主要针对无路可退得时候。污染还就是重在预防！！！!！

细胞房

培养箱每两周更换一次水(高压过得双蒸水)，条件允许得每两周可以用酒精擦洗一遍培养箱；

地面每两到三天用新洁尔灭拖洗一遍,桌面等同样用新洁尔灭擦洗一遍；

每次操作前超净台需用紫外线照射半小时，操作前后需用酒精完全擦拭超净台;

超净台得风机不能过大，风机到6-８格,否则也可能能致霉菌污染；

用显微镜观察细胞前需用新洁尔灭提前擦拭显微镜及操作台面；

枪头，EP管等需定期按时高压；