第三章 发酵液的预处理

第三章发酵液的预处理教学基本要求：1. 掌握预处理的概念。

2. 熟悉固液分离方法。

时间安排：3学时。

教学形式：本章以讲授为主，中间部分进行部分提问，采用PPT课件讲课。

教学内容：通常发酵液和生物溶液是高粘度的和非牛顿流体，必须进行预处理。

一、预处理的目的：1、改变发酵液的理化性质：(黏度、颗粒­、颗粒稳定性等)，固液分离速度­，分离器分离效率­。

2、目标产物转移其中一相(多数为液相)；。

3、去除发酵液中部分杂质，以利于后续各步操作。

二、预处理的方法1、加热法：最简单和最廉价的处理方法。

破坏凝胶结构、降低液体黏度、加速聚集。

去蛋白。

2、调节悬浮液的PH值：方法简单有效、成本低廉。

适当的PH值促进聚集。

3、凝聚和絮凝：凝聚：破坏溶质胶体颗粒表面的双电层，破坏胶体系统的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。

大小：1mm大小。

絮凝：在絮凝剂高分子聚合电解质的作用下，胶体颗粒和聚合电解质交连成网，形成10 mm大小的絮凝团过程。

絮凝剂主要起中和电荷、桥架和网络作用凝聚剂种类：无机盐类：Al2(SO4)3.18(H2O)，AlCl3.6(H2O)，FeCl3，ZnSO4，MgCO3金属氧化物：Al(OH)3、Fe(OH)3、Ca(OH)2、石灰等。

聚合无机盐：聚合铝、聚合铁等。

絮凝剂种类：阳离子型、阴离子型或非离子型天然聚合物：多糖类物质、海藻酸钠、明胶等人工合成聚合物：聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物、聚丙烯酸类等。

三、固液分离法类型：过滤、离心、重力沉降、气悬浮（一）过滤1概念：在一定的压力差下，将固液悬浮液通过一多孔性介质而实现固液分离的过程。

原理——筛分。

2、过滤介质无定形颗粒：颗粒活性炭、沙、无烟煤成形颗粒：烧结金属、烧结塑料非金属织物：尼龙、玻璃纤维金属织物：不锈钢丝网无纺品：纸、石棉3、助滤剂一种颗粒均匀、质地坚硬的粒状物质，用于扩大过滤表面的适应范围，减轻细小颗粒的快速挤压变形和过滤介质的堵塞。

使用方法：A、预涂层；B、按一定比率混合。

常用的助滤剂：硅藻土、膨胀珍珠岩、石棉、纤维素、未活化的炭、炉渣、重质碳酸钙，及它们的混合物等。

3、过滤类型常规过滤（死过滤）和错流过滤死过滤：当进料液的流动方向和膜的压力方向在相同时，我们称之为死过滤；水质比较好的情况下可以采用死过滤，此时能耗低，回收率极高。

错流过滤：当进料液的流动方向和膜的压力方向垂直时，我们称之为错流过滤；因为错流过滤平行于膜表面有一个回流，这个回流会有效地冲走膜表面的污染物，所以错流过滤允许进料液中可以有一定量的不溶解固体,颗粒粒径〈100微米，条件比死过滤宽松的多。

错流过滤的过滤收率高，滤液质量较好，还可以减少处理步骤。

4、过滤设备的分类根据推动力的不同可分为四类（a）重力过滤：自然过滤（b）加压过滤：板框过滤器、加压叶滤器、气压罐式连续压滤器（c）真空过滤：转鼓真空过滤器、圆盘真空过滤器、带式真空过滤器（d）离心过滤：离心过滤器5、过滤器的选择：滤液的澄清度颗粒大小的分布发酵液的黏度固体颗粒的浓度滤饼的干燥度滤饼的洗涤生产能力7、提高过滤设备过滤能力的途径①降低滤饼阻力：a.添加电解质、絮凝剂、凝固剂；悬浮固体粒子越大、硬度越高，则形成的滤饼的阻力系数越低。

实际中常使用高分子絮凝剂。

絮凝剂的分子很大，它的各个区段上具有特殊的吸附作用，它可以与悬浮的粒子起桥联作用，形成巨大的絮团。

b.助滤剂：在发酵醪中加入适当粒度的硅藻土，发酵醪中的细微粒子就可能附着在硅藻土粒子凹凸不平的表面，坚硬的硅藻土粒子就作为许多胶体粒子的载体，均匀地分布于滤饼之中，相应地改变了原悬浮液的滤饼结构，降低了滤饼的阻力系数。

②降低滤液粘度：发酵醪粘度是温度的指数函数。

一般来说，从常温升高液温，粘度明显下降，因此对非热敏性的液体，升高温度是降低粘度最简便而有效的措施。

③降低悬浮液中悬浮固体的浓度：过滤速度与单位体积醪液所形成的滤饼体积成反比④热处理：热处理能使蛋白质等胶体粒子变性凝固，使过滤速度大为提高，该法在污水处理中效果非常明显⑤提高压力差ΔP：在实际操作中，最忌一开始就加大ΔP ，这样就会在滤布表面形成一层紧密的滤饼层，使过滤速度很快就降下来。

原则上开始应在很低的ΔP下进行，ΔP的提高应缓慢逐步地调高，最适ΔP应根据实验确定（二）离心：固液分离：第一选择为过滤，第二选择离心分离。

1、定义：它是利用惯性离心力和物质的沉降系数或浮力密度的不同而进行的一项分离、浓缩或提炼操作。

原理——密度差2优缺点：(1) 优点：难过滤的发酵液：固体颗粒小、溶液粘度大、过滤速度慢、甚至不能过滤的悬浮液，以及忌用助滤剂、或助滤剂无效的悬浮液；(2) 缺点：分离得到的不是滤饼一样的半干物，而是浆状物；处理量小；设备复杂，价格贵，分离成本高。

3、离心分离的三种形式：A、离心沉降；B、离心过滤；C、密度梯度(超离心)。

4、离心沉降利用悬浮液或乳浊液中密度不同的组分在离心力场中迅速沉降分层，实现固液分离。

离心沉降的基础是固体的沉降。

(1) 离心分离因数Fr，(又称离心力强度)：离心力/重力加速度(g)的比值Fr 越大，越有利于分离意义：衡量离心设备的离心程度的重要技术参数，用于离心机的分类（常速离心机Fr < 3,000g、中速离心机Fr = 3,000 —5,0000g、高速离心机Fr>50000g、超速离心机Fr = 20,000 —1,000,000g）(2) 沉降式离心机种类：实验室用瓶式离心机工业用无孔转鼓离心机：管式、多室式、碟片式以及卧螺式(decanter)等。

5、离心过滤使悬浮液在离心力场作用下产生的离心力压力，作用在过滤介质上，使液体通过过滤介质成为滤液，而固体颗粒被截留在过滤介质表面，从而实现固液分离。

它兼有离心和过滤的双重作用，分离效率更高。

(1) 常见的离心过滤设备：间歇式：刮刀自动卸料、停机手动卸料。

连续式：活塞推料、振动卸料。

6、超离心法根据物质的沉降系数、质量和形状不同，应用强大的离心力，将混合物中各组分分离、浓缩、提纯的方法称为超离心法。

它在生物化学、分子生物学以及细胞生物学的发展中起着非常重要的作用。

应用超离心技术中的差速离心、等密度梯度离心等方法，已经成功的分离制取各种亚细胞物质、如线粒体、微粒体、溶酶体、肿瘤病毒等。

用5×105g以上的强大离心力，长时间的离心(如17h以上)，可获得具有生物活性的脱氧核糖核酸(DNA)、各种与蛋白质合成有关的酶系、各种信使核糖核酸(mRNA)和转移核糖核酸(tRNA)等，这为遗传工程、酶工程的发展提供了必需基础。

超离心法是现代生物技术领域研究中不可缺少的实验室分析和制备手段。

超速离心机：离心分离因数在100,000g以上的离心设备（1）制备性超离心：制备性超离心的主要目的是最大限度地从样品中分离高纯度目标组分，进行深入的生物化学研究。

制备性超离心分离和纯化生物样品一般用四种方法：差速离心法、一般密度梯度离心法、等密度梯度离心法及平衡等密度梯度离心法。

1)粒子差速离心：粒子差速离心法，简称差速离心法．是采用逐渐增加离心速度或低速和高速交替进行离心，使沉降粒子，在不同离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。

如取均匀悬浮液，控制离心力及时间进行离心，使最大的粒子先沉降，而上清液中不再含有这种粒子，取出上清液，增加离心力再分离较小的粒子，如此逐级分离。

差速离心一船用于分离沉降系数相差较大的粒子，如常用于细胞匀浆中细胞器的分离。

(2)一般密度梯度离心法：一般密度梯度离心法也称分级区带离心,它是把样品铺放在一个连续的液体密度梯度上，然后进行离心，并控制离心分离的时间，使得粒子完全沉降之前，在液体梯度中移动而形成不连续分离区带。

该法仅用于分离有一定沉降系数差的粒子，与粒子密度无关。

这种方法已用于RNA－DNA混合物、核蛋白体亚单位和其他细胞成分的分离。

(3)等密度离心法：当不同粒子存在密度差时，在离心力场作用下，粒子或向下沉降，或向上浮起，一直移动到与它们密度恰好相等的位置上(即等密度点)并形成区带，此即等密度离心法。

位于等密度点上的粒子没有运动，区带的形状和位置都不受离心时间的影内，体系处于动态平衡。

等密度离心的有效分离仅取决于粒子的密度差。

密度差越大，分离效果越好，与粒子的大小和形状无关。

根据梯度产生的方式，可分为预形成梯度（Preformed gradient）和自形成梯度（Self-formed gradient）的等密度离心，后者又称平衡等密度梯度离心。

①预形成梯度等密度离心：本法需要事先制备密度梯度，常用的梯度介质主要是非离子型的化合物(如蔗糖、甘油等)。

离心时把样品铺放在梯度介质的液面上，这个密度包括了所需要研究的密度范围，直到粒子的漂浮密度和梯度的密度相等时，粒子才发生沉降，并排列成不同的区带。

②自形成梯度的等密度离心(平衡等密度离心)：平衡等密度离心常用的梯度介质有粒子型盐类如铯盐或铷盐和三碘化苯衍生物等。

离心时是把密度均一的介质溶液和样品混合后装入离心管中，通过离心自形成梯度，让粒子在梯度中进行再分配。

离心达到平衡后，不同密度的粒子在梯度中各自分配到其等密度点的特定位置上，形成不同的区带。

这一方法已用于分离和分析人血浆脂蛋白。

（2）超速离心技术-应用（分析性超离心）测定分子量:用沉降速度法可测定S，再根据S求分子量。

沉降系数(S = 10-13 s)：单位离心力场中的沉降速度。

单位是秒。

因为许多生物大分子的S 很小，所以定义10-13 s为一个沉降系数单位，用S表示。

它是表示样品本身的一个特定的物理量。

大分子的纯度鉴定。

如果是匀质则是一个沉降界面，大分子的构相变化：构象发生改变，沉降速度也会改变。