第十一章 基因重组蛋白包涵体的分离和复性

影响复性效率的因素


3）变性剂浓度和复性时间
在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L 盐 酸胍、8mol/L Urea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐 酸胍和Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的 疏水相互作用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用 →A方向被阻止。 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长 的一段时间，I就可以慢慢地向N转化

包涵体形成的几种可能性

研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成 包涵体。 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在 细胞内溶解度时沉淀； 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键 不能正确配对；



3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译 后修饰酶及分子伴侣等)不足；

影响复性效率的因素


4）氧化还原环境
复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形 成S-S的环境→合适的氧化还原环境
采用配对的氧化型和还原型巯基物质 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基 乙醇/胱氨酸等。通常还原型巯基物质的使用浓度为 l~3mmol/L，还原型/氧化ห้องสมุดไป่ตู้的摩尔比为10：1或5：1。

稀释和透析复性法 折叠促进剂协助复性法：表面活性剂、PEG、分子伴侣等 反相胶团复性法、双水相体系复性法 层析折叠复性（固相复性）：凝胶过滤层析（GF）、亲 和层析（AFC） 、离子交换层析（IEC） 、疏水层析 （HIC）等
refolding Solubilized IB(unfolded)
复性液 浓 缩 ( 用 截 留 10kDa 的 超 滤 器 浓 缩 100 倍 ) ， 透 析 后 离 心 (15000r/min离心30min) 浓缩上清液
Sephacryl s-200柱层析分离：层析柱2100cm，pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱
蛋白质体外复性的常用方法

补充：蛋白质在E.coli中的表达

E.coli表达系统优点：


操作方便
遗传背景清楚 廉价培养基中迅速生长→发酵成本低、周期短 目的蛋白可获高水平表达 →E.coli是生产重组蛋白的首选表达系统，特别是对那 些不需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有 生物活性的基因工程蛋白
51％


3）供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、 pH等。
包涵体形成：Advantages
1、包涵体形式表达的蛋白质浓度比较高，有时甚至可以达 到细胞总蛋白含量的40% 2、重组蛋白质以包涵体形式存在→包埋了酶攻击的位点， 可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击 3、分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单 的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白 质成分进行有效的分离 4、有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表 达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低； 而包涵体形式的蛋白质因丧失了生物活性→高效地表达
由于蛋白质的多样性、结构和折叠过程的复杂性，使得人 们不能对一种复性方法进行简单的移植，也很难找到具有 普适性而又低成本的高效复性方法。 实际操作过程中必须针对每种目标蛋白的特点 对影响复性的各个因素逐一优化 才能最终确定适用于该种蛋白质的复性方法

一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率 在20%左右
一、包涵体的形成

在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式 沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物 包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各 种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽 然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包 涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高 浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。
包涵体加工流程
机械破碎法
包涵体 提取
离
心
去除细胞碎片
（ 膜蛋白和脂类等）

如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产 业化经常面临的一个难题
包涵体的洗涤

为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀 常用去污剂Triton X-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如 2mol/L尿素或盐酸胍等，注意：过高浓度的尿素或盐酸胍 会使包涵体溶解）洗涤以除去脂类和膜蛋白。 如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，1mM EDTA
4）重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多、Pro含 量越高越容易形成包涵体。 5）重组蛋白所处的环境：发酵温度高时容易形成包涵体。 6）有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培 养条件不佳时，容易形成包涵体。


减少包涵体形成的策略

1）降低重组菌的生长温度：较低的生长温度降低了无 活性聚集体形成的速率和疏水相互作用，从而可减少包 涵体的形成。 2）添加可促进重组蛋白质可溶性表达的添加剂，如： 培养E.coli时添加乙醇（诱导热休克蛋白的表达）、低 分子量的巯基或二硫化合物（影响细胞周质的还原态， 从而影响二硫键的形成）等。
下游加工过程的一般流程
不溶物的去除
理 与 固 液 分 离 1 发 酵 液 的 预 处
发酵液预处理
路线二
细胞－胞内产物 细胞破碎
细胞分离
路线一
清液－胞外产物
路线二B
包涵体
路线二A
碎片分离
溶解(盐酸胍、脲)
复 性 2、初步纯化(盐析、萃取、超滤等) 3、高度纯化(层析、电泳)脱盐浓缩 4、成品加工精制(结晶、干燥)

影响复性效率的因素


6）折叠促进剂
能够促进蛋白再折叠的化学物质统称为折叠促进剂，折叠 促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、抑制 肽链间的疏水相互作用。 应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活 性剂、聚乙二醇PFG、L－精氨酸、抗体、分子伴侣等。

包涵体的分离和蛋白质的复性

包涵体的溶解

大多数在pH8的条件下，用强变性剂如8mol/L尿素、 6mol/L盐酸胍， 打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展

对于含有S-S的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形 成的二硫键和链内的非活性二硫键 →为将包涵体充分溶解，需加入还原剂（如二硫苏糖醇 DTT、 GSH、β－巯基乙醇 β-ME）打开蛋白质中所有二硫键，一般是 50-100mM β-ME或DTT（对于目标蛋白没有二硫键的有时也应 使用还原剂，因为含S-S的杂蛋白会影响包涵体的溶解） 同时还应加入金属螯合剂，如EDTA，用来螯合Cu2+、Fe3+等 金属离子，防止已经处于还原状态的SH-与之发生氧化反应。
生化分离工程
第十一章 基因重组蛋白包涵体的分离和复性
基因工程表达产物后处理的特殊性
包涵体的分离和蛋白质复性

随着基因工程技术的迅猛发展，人们可以在外来宿主 细胞中控制目的蛋白质的生产，从而为临床和工业生 产提供一些因自然原料缺乏而无法大量获得的蛋白质 多肽产品。 迄今为止，人们已经成功地实现了用多种原核、真核 表达系统生产基因工程蛋白
Refolded bioactive monomer
aggregate
IB in E.coli
固相复性的流程
多聚-Lys蛋白对肝素
变性剂去除 -琼脂糖凝胶具有较 强亲和活性
吸 附
固相基质： 肝素-琼 脂糖凝胶
柱上复性
洗脱
亲和层析
离子交换
用离子交换层析复性马细胞色素C、卵清蛋白、 凝乳酶原
疏水层析

→两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。 →复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提 高复性收率的关键。
影响复性效率的因素


1）蛋白质本身的性质
有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键， 在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些 蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11； 一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率 在20%左右

缺点：一旦复性时发生聚沉副反应，使得柱堵塞且不可
再生→经济损失较大
固相复性（柱上复性）装置

影响复性效率的因素


5）pH和温度
最适宜的复性pH值应大于7.0（一般8.0-9.0），以防止自 由SH-的质子化作用影响正确配对的S-S的形成。 应避免在蛋白质pI处进行复性（蛋白质的静电排斥力几乎 为零，相互间疏水作用区域就容易作用而形成A）。 温度过高，蛋白质的聚集将十分严重，低温下聚集和折叠 反应都很慢，随着温度的上升二者的速度都加快→常在室 温下进行
(包涵体+8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 0.2 mM EDTA, 10mM DTT室温搅拌2h, 离心(15000r/min, 30min)
例：人-干扰素的后处理工艺
变性蛋白液
稀释(取1份变性液+99份上述buffer(不含DTT与尿素)，使尿 素终浓度小于0.1M，4C下搅拌24h）

影响复性效率的因素


2）蛋白质的复性浓度
I向N的转化是一级反应，而聚沉是二级或多级反应
聚沉的反应速度与蛋白质浓度的平方或高次方成正比 而复性反应过程与蛋白质浓度的一次方成正比，故浓度越 大，聚沉反应越明显。 →复性时蛋白质浓度宜低（低浓度时，获得的蛋白质复性 效率比高浓度要好的多） 另一方面浓度过低又给后处理带来不便，一般选择10－ 100μg／ml，以避免分子间相互作用力引起聚集。
例：人-干扰素的后处理工艺
发酵液 离心(发酵液冷却至10C以下，4000r/min离心10min) 菌体
细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积PBS buffer, 冰浴超 声破碎5次, 30s/次, 4000r/min离心30min)，洗涤(0.1% Triton X-100溶液，1000r/min离心20min，重复三次) 包涵体提取变性
Using GF 凝胶过滤

由于凝胶基质微孔的体积排阻效应和减少的扩散效应，部 分折叠的蛋白质之间的相互作用受到有效的阻挡 →降低了发生聚集的可能性 可溶性的聚集物、复性的蛋白、变性剂和氧化还原剂依次 流出

固相复性（柱上复性）优缺点

优点：在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白
分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；便于回收 变性剂，降低废水处理成本。


包涵体溶解后，蛋白质成为失去了生物学活性伸展肽链
快
慢
天然态N
局部肽段先由氢键形成一些 二级结构构象单元，如α螺 旋、β折叠、β转角等
蛋白质复性机理

伸展态U
中间体I
蛋白质复性过程中，涉及两种疏水相互作用：
一是分子内的疏水相互作用
聚集体A
→促使蛋白质正确折叠 二是肽链分子间的疏水相互作用→导致蛋白质分子间聚集，形 成寡聚体和多聚体→再进一步聚集形成沉淀