第十一章 基因重组蛋白包涵体的分离和复性
包涵体的复性总结
包涵体的复性总结关于包涵体的复性是一个令人头疼的问题,已经成为生物制药的瓶颈,包涵体的复性前期准备工作尤为重要,关于包涵体的处理一般包括这么几步:菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化,实验内容比较庞杂、繁琐。
一、菌体的裂解菌体的破碎方法很多:高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法。
无论用哪一种方法破碎组织细胞,都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中,使大分子生物降解,导致天然物质量的减少,不同的菌体蛋白需要加入不同的抑制剂:二异丙基氟磷酸(DFP)可以抑制或减慢自溶作用;碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性,苯甲磺酰氟化物(PMSF)也能清除蛋白水解酶活力,但不是全部,而且应该在破碎的同时多加几次;另外,还可通过选择pH、温度或离子强度等,使用这些条件时都要适合于目的物质的提取。
在实验室研究多采用超声波处理法和匀浆器匀浆法。
二、包涵体的洗涤通常的洗涤方法一般是难以洗干净的,包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒DNA和其它杂质。
洗涤常用1%以下的中性去垢剂,如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA反复多次进行,因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强,在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。
也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。
洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜。
根据不同的菌体选用与之相应的洗涤液,比如:2 M尿素+50mm Tris-HCl+0.2 mM NaCl +1%Triton x-100+2mmEDTA PH8.0,再用缓冲洗涤一次。
此外,刚处理完的包含体好溶解,冷冻后难溶解,且溶解时间和比例都会加大。
三、包涵体的溶解强的变性剂如尿素、盐酸胍,是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。
重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究
表达重组包涵体蛋白的变性溶解及复性研究概述高应瑞（译）目前，由于基因组序列数据库的快速扩增，重组蛋白的规模化生产已经成为迫切需要。
因此，通过基因重组生产蛋白质，必须考虑其蛋白特性和活性构象，以确定它们的生物学功能。
如果蛋白质的功能以及其基因的生物学功能未知，无论该蛋白质是在天然结构或在非天然结构，都不能通过生物活性评估来对其进行评估。
至今为止,有越来越多的异源重组蛋白成功得到表达。
其中大肠埃希氏菌（大肠杆菌）是最常使用的表达系统。
然而, 在大肠杆菌中异源表达外源基因往往会导致表达蛋白形成不溶性包涵体（IBS）。
包涵体必须经过变性溶解及复性过程后才会恢复其蛋白的生物活性。
包涵体复性过程的是一个非常复杂的过程，往往需要经过大量的反复试验才能确定其复性工艺参数。
在无活性的包涵体到具有生物活性蛋白的过程中，有两个最重要的影响因素:即包涵体的变性与复性。
包涵体蛋白的溶解必须使其蛋白肽链单分子进行分散并使最大程度减少蛋白质分子肽链内以及肽链之间的相互作用。
溶剂的选择，如尿素，盐酸胍，或洗涤剂等，在包涵体溶解过程中起关键作用，蛋白质变性溶解之后进行复性。
包涵体蛋白溶解后,即可进行蛋白复性。
蛋白复性过程不是单一反应,而蛋白的正确折叠与错误折叠和蛋白聚集的竞争过程。
在蛋白复性的竞争过程中,蛋白的复性率主要取决于变性剂的最终浓度以及溶剂的条件。
本文主要讨论的重点是复性工艺中对变性剂去除方式、溶剂、小分子添加剂以及工艺条件。
小分子添加剂的作用来自其在体内的功能定位。
小分子添加剂能够在生物体缺水的情况下维持体内蛋白质的稳定性，因此被命名为渗透剂[1,2]。
在另一个实例中，基因突变，蛋白的错误折叠常常导致蛋白的失活，从而导致机体生长的异常或某些细胞功能的异常。
实验已证明在某些小分子添加剂的存在时，这些失活蛋白质能够恢复正常功能，而且细胞能够生长正常。
由于小分子能够帮助蛋白质正确折叠，因此他们也被称为化学伴侣。
许多小分子添加剂都是渗透剂和化学伴侣。
包涵体蛋白的纯化和复性
包涵体蛋白的纯化和复性包涵体蛋白的纯化和复性1．菌体的收集和破碎用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min。
沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。
【备注】超声破菌缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶）重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。
破碎后的匀浆，4℃、 12000 rpm离心15 min。
分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。
2．包涵体的处理洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
重复一次。
再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。
【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）2％Triton X-100溶液：量取2mlTriton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)液，加M缓冲液98ml即可。
溶解：沉淀用适量的包涵体溶解缓冲液重悬，室温搅拌5-6小时或过夜。
12000 rpm 4℃离心15 min，收集上清液。
【备注】包涵体溶解缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，8 mol/L尿素，0.2 mmol/L DTT或100 mmol/L β-巯基乙醇，2％Triton）3．目的蛋白的纯化亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
谷胱甘肽S-转移酶（GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：首先，蛋白上的GST必须能合适的折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
如何对包涵体蛋白进行表达与复性
如何对包涵体蛋白进行表达与复性包涵体即在某些生长条件下，在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
关于包涵体的复性一直是生物制药的瓶颈，包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化。
一、包涵体蛋白的表达在平板上挑取单菌落，接种于含有氨苄青霉素和卡那霉素抗性的5 ml LB培养基中，37 ℃过夜培养，然后转接到100 ml LB 培养基中，37 ℃培养至A600 为0.4~0.6时，加入IPTG 至终浓度为0.5mmol/L 诱导3.5 h。
8000 r/min 离心5 min 收集菌体，加入10 ml 50 mmol/LTris-HCl，冰浴下超声波破碎后12000 r/min离心30 min收集沉淀。
二、包涵体的洗涤在包涵体中加入包涵体洗涤液：50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50 mmol/LNaCl，w=0．5％TritonX-100，pH 8．0；，37℃振荡洗涤1～2 h，然后8 000 r/min 离心15 min，收集沉淀。
三、包涵体的溶解洗涤后的包涵体加入适量的(包涵体溶解液)：6 mol/L 尿素，50 mmol/L Tris—HCl，1 mmol/L EDTA，50mmol/L NaCl，10 mmol/L β-ME，pH 8．0(注：β-ME用时现加)，于磁力搅拌器上搅拌过夜，1000 r/min离心30 min，取上清即得包涵体溶解液。
四、包涵体的复性包涵体的复性目前常用的主要有两种方式：1，稀释溶液，但是操作的液体量大，蛋白稀释；2，透析，超滤或电渗透析去除变性剂。
1.包涵体的稀释复性设定不同的复性条件：蛋白质量浓度、尿素浓度、温度、氧化还原条件、加入Ttiton X-100与环糊精的量、复性时间等，使变性溶解的包涵体稀释复性，复性一定时间后取样测酶活性。
包涵体蛋白复性的方法简介与操作
活性蛋白整体方案包涵体蛋白复性的方法简介与实验操作摘要：本文主要讲解了包涵体蛋白复性的技术的原理及操作方法，并附有相关案例。
包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。
蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也含有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA 等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。
包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。
此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。
同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。
包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。
盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。
SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。
另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。
这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。
二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。
常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。
包涵体蛋白复性的几种方法
基因重组蛋白包涵体的复性研究
蛋白质与介质的疏水 性相互结合
rhIFN-γ，rhIFN-β， 重组人粒细胞集落刺激因子rhGC-CSF
离子交换色谱 蛋白质与介质间存在 Papiloma virus(HPV)， E7MS2 fusion protein，
（IEC）
电荷作用力
重组白细胞分泌抑制因子rSLPI，抗原疫苗蛋白
亲和色谱 （AFC）
需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有生物 活性的基因工程蛋白
基因重组蛋白包涵体的复性研究
51％
基因重组蛋白包涵体的复性研究
8.2 包涵体的形成
在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式 沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物
包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各 种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽 然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包 涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高 浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。
• 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长 的一段时间，I就可以慢慢地向N转化
基因重组蛋白包涵体的复性研究
影响复性效率的因素
• 4）氧化还原环境
• 复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形 成S-S的环境→合适的氧化还原环境
• 采用配对的氧化型和还原型巯基物质 • 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基
基因重组蛋白包涵体的复性研究
包涵体形成的几种可能性
• 研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成包涵体。 • 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在细胞
内溶解度时沉淀； • 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能
包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。
关键词包涵体蛋白质复性Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules.Key words inclusion body , protein , renaturation外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
包涵体蛋白的提取与纯化
包涵体蛋白的提取与纯化摘要：随着基因重组技术的发展及越来越多的功能基因被发现和克隆, 蛋白质异源表达已被广泛应用。
大肠杆菌因遗传背景清楚、成本低、操作简单, 且能高效表达外源基因等特点, 是基础研究、临床应用及工业生产蛋白和多肽的首选表达系统。
然而, 重组蛋白在大肠杆菌中表达经常形成无活性的不溶性聚集物即包涵体。
包涵体的形成有一定的优势, 如具有高蛋白密度、易分离、易于毒性蛋白和宿主细胞致死蛋白表达等特点[1~ 3] 。
因此, 如何将包涵体蛋白转变为具有活性的可溶蛋白是备受关注的问题。
从包涵体中获得天然活性的重组蛋白一般包括三个步骤: 包涵体的分离和洗涤、包涵体的溶解、包涵体蛋白的复性。
本文综述了近年来包涵体蛋白分离纯化和色谱法复性技术研究进展,期望包涵体蛋白体外折叠这一难题早日解决。
正文：1．包涵体的形成重组蛋白不论在原核细胞还是真核细胞中表达时，都可形成包涵体[4]。
通常所说的包涵体是指重组蛋白在大肠杆菌中高效表达时形成的无活性蛋白聚集体，一般含有50%以上重组蛋白，其余为核糖体组分、RNA聚合酶，外膜蛋白等杂蛋白，以及质粒DNA、RNA片断、脂质、肽聚糖、脂多糖等成分[5，6]。
由于包涵体在相差显微镜下为黑色斑点，所以也称为折射体(Refractilebody)[7]。
包涵体形成的原因主要有以下几点:蛋白合成速度太快，以致于没有足够的时间进行折叠。
蛋白折叠的动力学模型表明:蛋白质天然构象形成的速率取决于肽链的合成速率、折叠速率和聚集速率几个因素。
中间体正确折叠是分子内的一级反应，而中间体的聚集是发生在分子间的二级或高级反应，因此，折叠中间体的浓度对聚集反应影响非常大[8]；¦重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺少真核生物的翻译后修饰系统(如糖基化等)，致使中间体大量积累，容易形成包涵体[9]；培养条件不佳和重组蛋白所处的环境也可导致包涵体形成，如发酵温度高，胞内pH接近蛋白的等电点等[10]；¨二硫键在蛋白折叠中有重要作用，而大肠杆菌胞内的还原环境不利于二硫键的形成[2]；©包涵体不溶可能由于分子间无活性的B-片层含量高于天然结构或盐沉淀蛋白[11]。
包涵体复性方法
包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。
）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。
与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。
复性过程始终发生在溶液中。
蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。
脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。
用层析法分离、复性包涵体
用层析法分离、复性包涵体谷振宇Jan-Christer Janson 苏志国中国科学院过程工程研究所摘要这里提出了一种用柱层析直接从Ecoli破碎原浆中分离纯化及复性包涵体的新方法。
将传统的离心分离一步凝胶过滤所取代。
分离的原则是选择合适的介质，使之仅排阻包涵体颗粒，而其它的组份都可以进入并穿过凝胶介质。
在新的复性方法中，逐步递减的变性剂(urea或Gu-HCl) 梯度与逐步递增的pH梯度相结合，通过凝胶过滤(排阻上限小于蛋白质分子量) 层析来进行复性。
溶解在高浓度变性剂及低pH中的变性样品，然后加入到梯度形成好的层析柱中。
在层析过程中，变性蛋白质的下行速度大约是变性剂下行速度的3 倍。
因此，变性蛋白会经过已经形成好的变性剂和pH梯度，并逐步脱除变性剂，逐步地升高pH，这样可以促进正确的折叠。
梯度的形状和程度，及流速都会影响复性率，而且可以针对不同蛋白质进行调节，以得到优化的条件。
我们在此实验中选择的目标蛋白质为大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白包涵体。
Rudolph和Lile的综述已经对蛋白质的体外复性做详细的介绍[1]。
传统的分离、复性方法如：分步离心，稀释和透析通常很耗时且复性率低。
本文中介绍了以凝胶过滤为基础发展起来的分离及复性方法。
此方法的一个优势是变性剂的脱除，流速及pH的变化可以很容易的调节。
大肠杆菌表达的scFv 融合蛋白质包涵体。
ScFv 片段在Eocli 中表达量很高，但经常会形成包涵体。
因此需要进行复性。
材料与方法脲(urea )、DTT、PMSF、溶菌酶(lysozyme)、精氨酸(arginine)、Triton X-100和DNAse购于Sigma。
GSSG，GSH购于Roche。
Berol 185 购于Akzo Nobel 表面化学公司，Sweden。
所有层析介质均为Amersham Pharmacia Biotech公司产品。
其它试剂均为分析纯。
实验用水为Millipore 纯水系统生产。
蛋白质复性
重组包涵体蛋白质复性邹平基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。
但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。
随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。
一、包涵体蛋白1、包涵体的形成包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。
2、减少包涵体形成的策略降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。
低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。
在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。
添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。
在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。
利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。
筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。
3、包涵体破菌、分离、洗涤常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。
包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。
重组蛋白包含体的复性
重组蛋白包含体的复性[摘要]：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。
不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。
变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。
近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。
[关键词]：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成Abstract：Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in the formation of insoluble inclusion bodies. Active protein can be recovered by solubilization of inclusion bodies followed by renaturation of the solubilized protein. The process of renaturation is established in the understanding to the mechanism of protein folding in vitro. In recent years, With the understanding of mechanisms of protein folding, many renaturation methods were developed, which can increase the yield of active proteins.Key word: protein folding、inclusion body 、renaturation 、the forming of disulfide bond大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。
包涵体复性方法
包涵体复性方法：一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。
（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。
）1. 透析、稀释和超滤复性法：这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。
透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。
2. 凝胶过滤层析复性凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。
与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。
凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。
复性过程始终发生在溶液中。
蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。
脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。
包涵体的纯化和复性总结-推荐下载
包涵体的纯化和复性包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂一、菌体的裂解1、怎样裂解细菌？细胞的破碎方法1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。
此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。
2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。
3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。
对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。
4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。
5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。
无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
这是标准配方:裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。
以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化策略
以包含体形式表达的基因重组蛋白的纯化策略点击：112 添加时间： 2007-7-27 9:29:25 分离纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白的步骤为：细胞破碎→包含体洗涤→包含体变性→蛋白复性→层析纯化。
一、包含体的洗涤：纯化以包含体形式表达的基因重组蛋白，包含体的洗涤至关重要，实验室最常用的破碎细胞的方法是超声破碎，超声处理时，DNA被切断无需再加DNA酶I，超声时产生大量的热，需在冰水浴中间断进行，一般选择超声强度和次数与包含体表达状况有关，表达量高，包含体致密的可以反复多次超声，和多次用超声缓冲液吹洗，8000－10000 rpm/min 10min弃上清，留取沉淀；对于表达量低，包含体不够致密的，在洗涤时就应注意，超声条件要温和，离心速度要提高12000－15000rpm/min 10－15min，必要时可以加入1－5％的TritonX－100和1－4M尿素浸泡过夜，或进行磁力搅拌以增加洗涤强度和净度。
二、包含体的变性常用的变性剂有8M尿素、6M盐酸胍、SDS。
尿素因价格低廉、呈电中性，变性条件温和，稀释复性后可以直接过离子交换剂进行纯化，常作为包含体变性剂的首选。
盐酸胍是强变性剂，复性时易出现沉淀，影响回收，且复性液中必须透析除净盐酸胍后，方可进行离子交换层析分离，不作首选；SDS与蛋白形成带负电的阴离子复合物，并与阴离子交换剂有强吸附，与阳离子交换剂不结合，更致命的弱点是常常会影响蛋白质的生物学活性，不常使用。
变性条件的选择，包含体变性完全与否直接影响进一步的复性，因此包含体的变性一定要完全。
对于易变性的包含体，室温放置或37℃1－3hr，甚至过夜变性，不易变性的包含体，可选择60℃3hr变性。
对于含有二硫键的蛋白质，为了变性完全，使二硫键完全打开，还应加入还原剂ß－ME和DTT。
三、蛋白质的复性蛋白质复性的最大问题，是在复性过程中形成中间体和多聚体，中间体阻碍作用大的使蛋白质正确折叠困难，复性就困难；阻碍小或无阻碍的容易复性。
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包涵体溶解后，蛋白质成为失去了生物学活性伸展肽链
快
慢
天然态N
局部肽段先由氢键形成一些 二级结构构象单元，如α螺 旋、β折叠、β转角等
蛋白质复性机理
伸展态U
中间体I
蛋白质复性过程中，涉及两种疏水相互作用：
一是分子内的疏水相互作用
聚集体A
→促使蛋白质正确折叠 二是肽链分子间的疏水相互作用→导致蛋白质分子间聚集，形 成寡聚体和多聚体→再进一步聚集形成沉淀
复性液 浓 缩 ( 用 截 留 10kDa 的 超 滤 器 浓 缩 100 倍 ) ， 透 析 后 离 心 (15000r/min离心30min) 浓缩上清液
Sephacryl s-200柱层析分离：层析柱2100cm，pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 平衡洗脱
蛋白质体外复性的常用方法
(包涵体+8M 尿素 pH 8.0 50mM Tris-HCl buffer 0.2 mM EDTA, 10mM DTT室温搅拌2h, 离心(15000r/min, 30min)
例：人-干扰素的后处理工艺
变性蛋白液
稀释(取1份变性液+99份上述buffer(不含DTT与尿素)，使尿 素终浓度小于0.1M，4C下搅拌24h）
影响复性效率的因素
3）变性剂浓度和复性时间
在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L 盐 酸胍、8mol/L Urea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐 酸胍和Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的 疏水相互作用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用 →A方向被阻止。 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长 的一段时间，I就可以慢慢地向N转化
Refolded bioactive monomer
aggregate
IB in E.coli
固相复性的流程
多聚-Lys蛋白对肝素
变性剂去除 -琼脂糖凝胶具有较 强亲和活性
吸 附
固相基质： 肝素-琼 脂糖凝胶
柱上复性
洗脱
亲和层析
离子交换
用离子交换层析复性马细胞色素C、卵清蛋白、 凝乳酶原
疏水层析
影响复性效率的因素
2）蛋白质的复性浓度
I向N的转化是一级反应，而聚沉是二级或多级反应
聚沉的反应速度与蛋白质浓度的平方或高次方成正比 而复性反应过程与蛋白质浓度的一次方成正比，故浓度越 大，聚沉反应越明显。 →复性时蛋白质浓度宜低（低浓度时，获得的蛋白质复性 效率比高浓度要好的多） 另一方面浓度过低又给后处理带来不便，一般选择10－ 100μg／ml，以避免分子间相互作用力引起聚集。
下游加工过程的一般流程
不溶物的去除
理 与 固 液 分 离 1 发 酵 液 的 预 处
发酵液预处理
路线二
细胞－胞内产物 细胞破碎
细胞分离
路线一
清液－胞外产物
路线二B
包涵体
路线二A
碎片分离
溶解(盐酸胍、脲)
复 性 2、初步纯化(盐析、萃取、超滤等) 3、高度纯化(层析、电泳)脱盐浓缩 4、成品加工精制(结晶、干燥)
3）供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、 pH等。
包涵体形成：Advantages
1、包涵体形式表达的蛋白质浓度比较高，有时甚至可以达 到细胞总蛋白含量的40% 2、重组蛋白质以包涵体形式存在→包埋了酶攻击的位点， 可以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击 3、分离比可溶蛋白质的分离方法简便，造价低，使用简单 的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白 质成分进行有效的分离 4、有些表达的外源蛋白质对细胞有毒性或者致死，大量表 达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低； 而包涵体形式的蛋白质因丧失了生物活性→高效地表达
影响复性效率的因素
4）氧化还原环境
复性不仅要降低或去除变性剂，同时必须提供SH-氧化形 成S-S的环境→合适的氧化还原环境
采用配对的氧化型和还原型巯基物质 配对低分子量巯基试剂包括GSSG/GSH、半胱氨酸或巯基 乙醇/胱氨酸等。通常还原型巯基物质的使用浓度为 l~3mmol/L，还原型/氧化型的摩尔比为10：1或5：1。
影响复性效率的因素
6）折叠促进剂
能够促进蛋白再折叠的化学物质统称为折叠促进剂，折叠 促进剂的作用原理在于稳定复性蛋白质的天然结构、抑制 肽链间的疏水相互作用。 应用于蛋白质复性并具有显著效果的折叠促进剂有表面活 性剂、聚乙二醇PFG、L－精氨酸、抗体、分子伴侣等。
包涵体的分离和蛋白质的复性
一、包涵体的形成
在大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以包涵体的形式 沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物 包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各 种原因导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽 然正确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包 涵体。包涵体直径约0.5-1μm，具有很高的密度（约1.3 mg/ml），相差显微镜下有折光性，呈非水溶性，只溶于高 浓度变性剂如尿素、盐酸胍等。
由于蛋白质的多样性、结构和折叠过程的复杂性，使得人 们不能对一种复性方法进行简单的移植，也很难找到具有 普适性而又低成本的高效复性方法。 实际操作过程中必须针对每种目标蛋白的特点 对影响复性的各个因素逐一优化 才能最终确定适用于该种蛋白质的复性方法
一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率 在20%左右
包涵体形成的几种可能性
研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成 包涵体。 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其在 细胞内溶解度时沉淀； 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键 不能正确配对；
3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译 后修饰酶及分子伴侣等)不足；
影响复性效率的因素
5）pH和温度
最适宜的复性pH值应大于7.0（一般8.0-9.0），以防止自 由SH-的质子化作用影响正确配对的S-S的形成。 应避免在蛋白质pI处进行复性（蛋白质的静电排斥力几乎 为零，相互间疏水作用区域就容易作用而形成A）。 温度过高，蛋白质的聚集将十分严重，低温下聚集和折叠 反应都很慢，随着温度的上升二者的速度都加快→常在室 温下进行
例：人-干扰素的后处理工艺
发酵液 离心(发酵液冷却至10C以下，4000r/min离心10min) 菌体
细胞破碎(1倍体积细胞+10倍体积PBS buffer, 冰浴超 声破碎5次, 30s/次, 4000r/min离心30min)，洗涤(0.1% Triton X-100溶液，1000r/min离心20min，重复三次) 包涵体提取变性
包涵体加工流程
机械破碎法
包涵体 提取
离
心
去除细胞碎片
（ 膜蛋白和脂类等）
如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产 业化经常面临的一个难题
包涵体的洗涤
为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀 常用去污剂Triton X-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如 2mol/L尿素或盐酸胍等，注意：过高浓度的尿素或盐酸胍 会使包涵体溶解）洗涤以除去脂类和膜蛋白。 如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，1mM EDTA
Using GF 凝胶过滤
由于凝胶基质微孔的体积排阻效应和减少的扩散效应，部 分折叠的蛋白质之间的相互作用受到有效的阻挡 →降低了发生聚集的可能性 可溶性的聚集物、复性的蛋白、变性剂和氧化还原剂依次 流出
固相复性（柱上复性）优缺点
优点：在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白
分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；便于回收 变性剂，降低废水处理成本。
缺点：一旦复性时发生聚沉副反应，使得柱堵塞且不可
再生→经济损失较大
固相复性（柱上复性）装置
补充：蛋白质在E.coli中的表达
E.coli表达系统优点：
操作方便
遗传背景清楚 廉价培养基中迅速生长→发酵成本低、周期短 目的蛋白可获高水平表达 →E.coli是生产重组蛋白的首选表达系统，特别是对那 些不需要进行蛋白质翻译后修饰（如糖基化）就具有 生物活性的基因工程蛋白
51％
稀释和透析复性法 折叠促进剂协助复性法：表面活性剂、PEG、分子伴侣等 反相胶团复性法、双水相体系复性法 层析折叠复性（固相复性）：凝胶过滤层析（GF）、亲 和层析（AFC） 、离子交换层析（IEC） 、疏水层析 （HIC）等
refolding Solubilized IB(unfolded)
→两者互相竞争，影响蛋白质复性收率。 →复性过程中，抑制肽链间的疏水相互作用以防止聚集，是提 高复性收率的关键。
影响复性效率的因素
1）蛋白质本身的性质
有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键， 在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些 蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11； 一般说来，在优化的条件下，大多数蛋白质体外复性效率 在20%左右
生化分离工程
第十一章 基因重Biblioteka 蛋白包涵体的分离和复性基因工程表达产物后处理的特殊性
包涵体的分离和蛋白质复性
随着基因工程技术的迅猛发展，人们可以在外来宿主 细胞中控制目的蛋白质的生产，从而为临床和工业生 产提供一些因自然原料缺乏而无法大量获得的蛋白质 多肽产品。 迄今为止，人们已经成功地实现了用多种原核、真核 表达系统生产基因工程蛋白