第七章食品中兽药残留检验.

1. 2 净化
净化即将待测物与提取液中的样本干扰杂质分离。兽 药残留分析中常用的净化方法是液- 液分配和固相萃 取。
液- 液分配:等体积的分配体系中溶质分配平衡后溶解在非极
性或极性较弱的溶剂中溶质的百分比称为p值,利用p值可以选 择萃取系统、计算萃取次数和抽出率。通过调节溶液的pH值、 极性、离子对形成等手段选择性地改变待测物的p值.
免疫分析技术
免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基 础的新型分析技术。兽药残留免疫分析方法的建立步骤包 括待测物选择、半抗原及人工抗原的合成、抗体制备和测 定方法建立免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手 段还是样本净化方法,都能使分析过程特别是前处理步骤 大大简化。目前几乎所有重要的兽药已建立或试图建立免 疫测定法(多数是ELISA) ,ELISA 缺点在于影响因素较多， 易出现假阳性结果。
②在定量分析上的新技术包括毛细管电泳、超临界流体色谱、 液相色谱-质谱联用技术、免疫分析技术和生物传感器等。
样本前处理
1. 1 提取
提取是使用适当溶剂将待测物连同部分样本基质从固态样 本转至易于净化或分析的液态,通常可除去99%的样本杂 质。根据样本的性质选择溶剂,如脂肪或水分含量。使用 水溶性有机溶剂(乙腈、甲醇、丙酮等)有许多优点:溶剂和 动物样本易混合,提取速度快;溶剂溶解作用强;提取液pH值 可以调节,适用范围广;提取的同时兼脱蛋白和脱脂;待测物 在样本提取液中均匀分布,可只移取部分上清液或滤液进 行分析,无需 反复提取将待测物全部转出。
四环素类
四环素类抗生素是由放线菌产生的一类广谱抗生素，包括金
霉素、土霉素、四环素等，其结构均含并四苯基本骨架。广 泛用于多种细菌及立克次氏体、衣原体、支原体等所致之感 染。
名称 理化性质
Βιβλιοθήκη Baidu
用途
土霉素 淡黄色粉末,盐酸盐易溶于水,溶液不稳定, 腹泻、气喘病、产道疾
OTC
临用现配
病等
金霉素 盐酸盐为黄色结晶，微溶于水，水溶液不 与土霉素相似
1. 3浓缩
浓缩是待测物富集或转溶的常用方法。前处理中以浓缩过程 待测物损失最大。应避免样品液被直接蒸干,否则待测物可能 附着于器皿上或与样本基质结合使回收率下降,高极性待测物 如磺胺类药物较为严重。
1. 4衍生化
衍生化提高检测的灵敏度和选择性已成为残留分析中衍生化 的最主要目的,如给待测物连接强电负性基团以适于气相色谱 的电子捕获检测器检测、HPLC的紫外或荧光衍生化等。
二.我国出口食品到国外检出问题：
• 90年输欧冻兔肉因农残超标，被拒之门外，致出口 量从7万吨锐减至2万吨
• 90年出口日本的冻鸡肉，被检出克球酚残留，上万 吨货在日本被扣留，国内库存上万吨货不能出口
• 96年因残留监控和防疫体系方面的问题，欧盟从当 年8月1日起禁止中国所有禽肉进口，直到2001年5月 才对中国开放市场。受其波及，我国出口到日本的 冻鸡腿出口价格从＄ 2100/T降到＄1450/T
色谱-质谱连用技术
药物残留研究中，常用的色谱法具有高效的分离能力和高 灵敏度的定量检测能力，但仅显示色谱峰和保留值，不能 提供待测物残留组分的结构信息或对未知化合物进行结构 鉴定。质谱等具有很强的结构鉴定能力，但只适用于纯物 质的分析，自身不具备分离能力，两者结合特别是联用仪 器可以集高效分离和结构鉴定于一体，是生物样品复杂混 合物中痕量组分定性和定量分析的最有效手段之一。
高效薄层色谱(HPTLC)
HPTLC的出现使TLC进入了复兴时期,现已成为仅次于 HPLC和GC的残留分析方法。HPTLC的斑点原位扫描定 量、定性和高效分离材料(Φ3～10μm) 。改变了常规TLC 在灵敏度和重现性方面的不足,但保持了TLC的简便、快速 和样品容量大的优点,可使用正相或反相板,分辨率几乎与 HPLC相当。HPTLC在兽药残留的快速筛选性检测方面应 用广泛。
①样品分离纯化技术（提取和净化方法）的简单化、微型化 和自动化，提高了提取或净化效率及自动化水平。如固相 萃取法（SPE）、固相微萃取（SPME），超临界流体萃 取(SFE)、微波萃取法（MAE）、免疫亲和色谱（IAC） 技术、基质固相分散（MSPD）技术，凝胶渗透色谱 （GPC）净化，分子印迹技术等。
超临界流体色谱( SFC)
SFC可弥补GC和HPLC的不足,但不可能取代二者。SFC 最大优点是可以方便地连接各种灵敏的检测器(MS, ECD 等) ,如猪组织中磺胺类药物等抗菌素残留的SFC -MS分析。
毛细管区域电泳(CZE)
CZE是20世纪90 年代以来研究最活跃的分析技术之一。 CZE不同于传统的凝胶电泳技术, CZE使用直径仅25～ 50μm的毛细管而不用载体,待测组分在高压(20～30 kV)下 泳动,截面积小,热量和泳速均匀。所以, CZE兼有高压电泳 的高速、高分辨和HPLC灵活、高效的优点,柱效高达106 塔板/m。向电解质中加入超临界胶束浓度的表面活性剂, 如十二烷基硫酸钠( SDS) ,即为毛细管胶束电动色谱( cap illarymi - cellarelectrokineticchromatography,CMEC) ,分 离范围可扩展至中性或两性分子,分离效能亦进一步提高。 CZE将在简化样本前处理、多残留分析和分析自动化方面 发挥重要作用。目前CZE的主要问题是样品量太小,限制 了检测的灵敏度。
① 可用于食品动物，不需要制定最高残留量限量的药物有88 种
② 可用于食品动物，需要制定最高残留限量的药物有94种
③ 可以使用，但不得在动物性食品中检出兽药残留的药物有9 种
④ 禁止使用，且在动物性食品中不得检出的药物有31种
兽药残留产生的原因
• 养殖环节用药不当是产生兽药残留的最主要原因。产生兽 药残留的主要原因大致有以下几个方面
固相萃取: 其基本原理与开放式柱色谱相同。固相萃取中样
本与微细颗粒填料(Φ70～150μm)接触面积大,净化速度快,分离 效能高;操作简便,溶剂用量少,回收率高。
薄层色谱 :具有直观、速度快、样本容量大和分离效能高(颗
粒Φ30～50 μm)等优点。但对紫外- 可见区无吸收的待测物却 难以定位,有些待测物可通过标准品显色来解决。
五.激素类药物
这类药物主要用于提高动物的繁殖和加快生长发育速度， 使用于动物的激素有性激素和皮质激素，而以性激素最常 用，如孕酮、睾酮、雌二醇等。正常情况下，动物性食品 中天然存在的性激素含量是很低的，因而不会干扰消费者 的激素代谢和生理机能。 但摄入性激素残留超标的动物性食品，可能会影响消费者 的正常生理机能，并具有一定的致癌性，可能导致儿童早 熟、儿童发育异常、儿童异性趋向等。
测定方法
气相色谱法 ：气相色谱法 有许多高灵敏、通用性或 专一性强的检测器供选用, 如氢焰离子化检测( FID) 、 氮磷检测器(NPD)等,检测 限一般为μg/kg级。但是大 多数兽药极性或沸点偏高, 需繁琐的衍生化步骤,限制 了GC的应用。
高效液相色谱法
几乎所有的化合物均可用HPLC进行测定。HPLC的 分离机制与常规柱色谱相同,但填料更加精细(Φ5～ 10μm) ,可重复进样,分析速度快。HPLC至今仍缺乏 可满足兽药残留分析要求的通用型检测器。紫外检测 器(UVD)最普及,其次是荧光检测器和电化学检测器。 大部分抗生素在高于230 nm的光谱区无吸收,而在低 于230 nm的紫外区许多样本基质和流动相产生干扰, 需衍生化后测定,限制了紫外检测器的应用。(大多数 动物源性食品中兽药残留分析采用HPLC法，但是对 于某些兽药残留，HPLC的检出限达不到要求）
兽药多残留的IAC 分离纯化技术是LC-MS-MS 和GC-MS 检测兽药残留时最有效的分离纯化手段。建立动物性食品 中药物多残留的定量确证检测技术（IAC-GC-MS、IACLC-MS-MS），是残留分析研究领域的一个重要发展方向。
一.抗生素类药物
这类药物多为天然发酵产物，是临床应用最多的 一类抗菌药物，如青霉素类、氨基糖苷类、大环 内酯类、四环素类、螺旋霉素、链霉素、土霉素、 金霉素等。青霉素类最容易引发超敏反应，四环 素类、链霉素有时也能引起超敏反应。轻至中度 的超敏反应一般表现为短时间内出现血压下降、 皮疹、身体发热、血管神经性水肿、血清病样反 应等，极度超敏反应可能导致过敏性休克甚至死 亡。长期摄入含氨基糖苷类残留超标的动物性食 品，可损害听力及肾脏功能。
检测见GB/T18932.19-2003
二.磺胺类药物
主要用于抗菌消炎，如磺胺嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺眯、 菌得清、新诺明等。近年来，磺胺类药物在动物性食品中 的残留超标现象，在所有兽药当中是最严重的。长期摄入 含磺胺类药物残留的动物性食品后，药物可不断在体内蓄 积。磺胺类药主要经肾脏排出，在尿中浓度较高，其溶解 度又较低，尤其当尿液偏酸性时，可在肾盂、输尿管或膀 胱内析出结晶，产生刺激和阻塞，造成泌尿系统损伤，引 起结晶尿、血尿、管型尿等。
主要用于驱虫或杀虫，而常用的苯并咪唑类抗寄生虫药物 有丙硫苯咪唑、丙氧咪唑、噻苯咪唑、甲苯咪唑、丁苯咪 唑等。食用残留有苯并咪唑类药物的动物性食品，对人主 要的潜在危害是致畸作用和致突变作用。对于妊娠期的孕 妇有可能发生胎儿畸形，如短肢、兔唇等；对所有消费者 来说，可能由于其致突变作用使消费者发生癌变和性染色 体畸变，从而其后代有发生畸形的危险。
盐酸克伦特仑残留的检验
一种平喘药。该药物既不 是兽药，也不是饲料添加 剂，而是肾上腺类神经兴 奋剂.能够促进瘦肉生长抑 制肥肉生长的饲料添加剂。 理化特性：白色或类白色 的结晶粉末，无臭、味苦， 熔点161℃，溶于水、乙 醇，微溶于丙酮，不溶于 乙醚。
检测方法GB/T 5009.1922003
四.抗寄生虫类药物
三.硝基呋喃类药物
主要用于抗菌消炎，如呋喃唑酮、呋喃西林、呋喃妥因等。 通过食品摄入超量硝基呋喃类残留后，对人体造成的危害 主要是胃肠反应和超敏反应。剂量过大或肾功能不全者， 可引起严重毒性反应，主要表现为周围神经炎、嗜酸性白 细胞增多、溶血性贫血等。长期摄人可引起不可逆性末端 神经损害，如感觉异常、疼痛及肌肉萎缩等， 中国和欧美大多数国家规定禁止使用此类兽药，在动物性 食品和饲料中不得检出。
• 兽药最高残留限量(MRLVD)是指某种兽药在食物中或食物表 面产生的最高允许兽药残留量(单位μg／kg，以鲜重计)。
• 兽药残留可分为7类：①抗生素类;②驱肠虫药类;③生长促 进剂类;④抗原虫药类;⑤灭锥虫药类;⑥镇静剂类;⑦β-肾 上腺素能受体阻断剂
• 2002年农业部颁布《动物性食品中最高残留限量》规定：
第七章 食品中兽药残留检验
一 、概述
• 典型的兽药是指用于预防和治疗畜禽疾病的药物。但是， 随着集约化养殖生产的开展，一些化学的、生物的药用成 分被开发成具有某些功效的动物保健品或饲料添加剂，也 属于兽药的范畴。兽药的主要用途有防病治病、促进生长、 提高生产性能、改善动物性食品的品质等。
• 兽药残留(residues of veterinary drug)是指用药后蓄 积或存留于畜禽机体或产品(如鸡蛋、奶品、肉品等)中原 型药物或其代谢产物，包括与兽药有关的杂质的残留。
• 非法使用违禁或淘汰药物 • 不遵守休药期规定 • 滥用药物 • 违背有关标签的规定 • 屠宰前用药
兽药残留的危害
• 1.毒性作用：急、慢性中毒，致畸、致突变或致 癌作用（简称“三致”作用）
• 2.耐药性 • 3.过敏反应 • 4.激素样作用 • 5.污染环境影响生态
兽药残留分析技术
• 兽药残留分析是复杂混合物中痕量组分的分析技术。残留 分析既需要精细的微量操作手段,又需要高灵敏的痕量检 测技术。
CTC
稳定
四环素 盐酸盐为黄色结晶粉末，有引湿性，溶于 腹泻、气喘病、产道疾
TC
水
病等
欧盟与中国关于四环素类抗生素的最大残留限量 （GB/T5009.116-2003)
氯霉素类抗生素
包括有氯霉素、甲砜霉素及无味氯霉素等。（现已被禁用 的氯霉素对哺乳动物的大肠杆菌病基本失去治疗作用，且 能抑制蛋白质合成和骨髓造血功能，导致血小板减少性紫 斑、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血和溶血性贫血。）