蛋白质复性的条件及影响因素
蛋白质变性与复性
蛋白质相互作用与复合物分离
蛋白质变性
利用变性剂分离和纯化蛋白质复合物 中的各个组分，有助于研究蛋白质之 间的相互作用和复合物的组成。
蛋白质复性
在研究蛋白质相互作用和复合物分离 后，通过复性技术将蛋白质恢复其天 然状态，可用于进一步的功能和结构 研究。
蛋白质优化与改造
蛋白质变性
通过蛋白质变性技术可以去除非必需的氨基酸残基或引入突 变，从而优化蛋白质的稳定性、活性或选择性。
蛋白质复性
复性后的蛋白质可用于进一步的功能和结构研究，以验证优 化和改造的效果。
人工酶设计与合成
蛋白质变性
在人工酶设计与合成过程中，利用变性技术可以去除天然酶中的非必需部分，提 高酶的活性和选择性。
蛋白质复性
复性后的酶可用于催化特定化学反应，以验证人工酶的活性和效果。
生物制药与疫苗开发
蛋白质变性
医疗领域
改进蛋白质检测和诊断技术，提高疾病诊断的准 确性和效率，为患者提供更好的医疗服务。
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蛋白质变性与复性
目录
CONTENTS
• 蛋白质变性 • 蛋白质复性 • 蛋白质变性与复性的应用 • 蛋白质变性与复性的研究进展 • 蛋白质变性与复性的挑战与前景
01 蛋白质变性
定义
蛋白质变性是指蛋白质在某些物理和 化学因素作用下，其特定的空间构象 被破坏，导致理化性质发生改变，生 物学活性丧失的现象。
复性后的蛋白质溶解度增加，有利于其在溶液中的稳 定性。
Байду номын сангаас
03 蛋白质变性与复性的应用
蛋白质结构与功能关系
蛋白质变性
通过改变蛋白质的理化条件，使其空间构象发生改变，从而改变其生物学活性。 有助于研究蛋白质的结构与功能关系，深入了解蛋白质在生物体内的生理作用。
蛋白质复性名词解释
蛋白质复性名词解释蛋白质是由氨基酸组成的生物大分子，是构成生物体各种组织和器官的重要成分。
蛋白质的功能多样，可以参与生物体内的酶催化、结构支持、运输、通信、能量存储、免疫防御等重要生理过程。
蛋白质的复性是指它的折叠状态和三维结构。
蛋白质synthesized 是在生物体内通过一系列复杂的生物化学反应合成的，但它不是以线性链的形式存在，而是经过折叠和组装形成复杂的三维结构。
这个过程被称为蛋白质的折叠，而折叠之后形成的三维结构就是蛋白质的复性。
蛋白质的复性是非常关键的，因为它决定了蛋白质的功能和稳定性。
如果蛋白质的复性受到破坏，它可能失去原有的生物活性和功能。
例如，当蛋白质的复性受到变性剂（如酸、碱、高温等）的作用时，蛋白质的结构可能会发生改变，导致其在生物体内无法正常发挥作用。
蛋白质的折叠和复性是一个自发的过程，在正常生理条件下，蛋白质可以自行正确地折叠成其稳定的复性。
但有时蛋白质的折叠过程会出现错位或失败，导致其形成不正确的复性。
这种情况下，被称为蛋白质的错折，错误复性的蛋白质可能会失去原有的功能，甚至产生有害的效应。
蛋白质折叠和复性的控制是一个复杂的过程，涉及到多个层面的调节。
通常，蛋白质的折叠主要由其氨基酸序列所决定，不同氨基酸之间的相互作用力（如氢键、离子相互作用、范德华力等）在折叠过程中扮演重要的角色。
此外，还有一些蛋白质专门参与蛋白质折叠和复性的分子辅助工具，如分子伴侣和分子伴侣辅助因子等，它们能够帮助蛋白质正确折叠和达到稳定的复性。
总之，蛋白质的复性是指其折叠和组装成稳定的三维结构的过程，它对蛋白质的功能和稳定性起着关键作用。
探索蛋白质复性的机制对于理解生物大分子的结构与功能具有重要意义，也对于研究蛋白质相关疾病和开发药物具有重要价值。
(整理)包涵体表达的蛋白的复性
包涵体表达的蛋白的复性外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。
一、包涵体：1.1包涵体的定义、组成与特性：包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。
一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。
NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。
[1]1.2包涵体的形成：主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。
1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。
研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。
原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。
1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。
1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。
1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。
名词解释蛋白质的复性
名词解释蛋白质的复性蛋白质的复性：现象与意义在生物化学领域中，蛋白质的复性是一个广泛而重要的研究课题。
复性是指蛋白质经历一系列空间结构和功能的调整，重建其原有的三维结构以及所能发挥的功能。
本文将探讨蛋白质复性的现象、机制以及其在生物体内的意义。
1. 蛋白质的复性现象复性是蛋白质遭受外部环境的一系列不良条件（如高温、极酸或极碱性条件、化学变性剂等）后，通过一定机制修复并重获原有结构与功能的过程。
在这个过程中，蛋白质的一级、二级和三级结构受到损伤，导致其失去正常功能。
蛋白质的复性可以发生在细胞内部和细胞外部。
在细胞内，复性通常由分子伴侣和分子伴侣系统促进，如分子伴侣热休克蛋白HSP70、HSP90等。
这些分子伴侣通过与蛋白质相互作用，引导失去结构的蛋白质重新折叠成正确的形式，并防止其在复性过程中发生聚集。
2. 蛋白质的复性机制复性过程涉及多个事件和步骤，其中最为关键的是解聚和折叠。
解聚是指复性过程中产生的不正常和不稳定的蛋白质聚集体分解为单体。
这个步骤由分子伴侣和其他调节蛋白质负责。
折叠是指蛋白质通过一系列无序到有序的结构变化，重新将其折叠成正确的三维构象。
折叠的过程中，分子伴侣系统与其他辅助蛋白质（如折叠辅助酶和蛋白激酶等）相互作用，协助和促进正确的二级和三级结构的形成。
此外，糖基化也被认为是蛋白质复性的关键机制之一。
在糖基化过程中，糖链与特定氨基酸残基结合，形成糖蛋白复合物。
这种复合物不仅能帮助维持蛋白质的稳定性，还可促进正确的折叠。
3. 蛋白质复性的意义蛋白质的复性在维持生物体内正常的生理功能中起着至关重要的作用。
在细胞内，复性可以防止异常蛋白质的聚集和沉积，减轻内环境的毒性。
此外，蛋白质复性还与许多重要的生物过程密切相关。
例如，蛋白质折叠失常与多种神经性疾病，如阿尔茨海默病和帕金森病相关。
了解复性过程可以帮助我们深入了解这些疾病的发生机制，并为研发相关的治疗方法提供新的思路。
另外，蛋白质复性也对生物技术领域具有重要意义。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
10蛋白质复性
200
180
160
Spe,不被任何膜 所包围。细胞破碎后,包含体呈颗粒状,致密,低 速离心就可获得。欲获得天然活性态的目标产 物,必需分离包含体后,溶解包含体并使其中的目 标蛋白恢复应有的天然活性。
包含体的形成和性质
1 包含体的形成 2 包含体的性质 3 包含体的优点
包含体形成的原因
主要是高水平表达的结果。 在高水平表达时，新生肽链的聚集速率超过蛋白
包含体的纯化和溶解
溶解
变性剂： 5～8mol/L盐酸胍、8mol/L尿素 硫氰酸盐、表面活性剂（十二烷基磺酸钠，十六 烷基三甲基氯化胺等）
还原剂： 1～100 mmol/L的二硫苏糖醇； 1～200 mmol/L的β-巯基乙醇或半胱氨酸
蛋白质复性
热力学驱动； 分子内折叠和分子间聚集的动力学竞争过程。
体外复性研究的核心问题：
1、模仿体内蛋白质折叠过程： 构建适于蛋白质正确折叠的环境，设计能够促进蛋 白质正确折叠、抑制折叠中间体聚集的折叠助剂 （Folding aids，folding modulators）
2、发挥体外折叠的独特优势： 构建体内不可能存在的独特环境，实现高效复性和 分离纯化：
色谱、反胶团、膜、双水相系统、沉淀……
盐酸胍 < 2 mol/L 脲 < 4 mol/L
－GSH/GSSG 4/0.4 mmol/L ~ 5/5 mmol/L ✓ 直接稀释、透析、流加
直接稀释（Direct dilution）：
将少量变性蛋白质溶液直接加入到较大体积的 复性缓冲液中，变性剂浓度降低，蛋白质开始 复性；
蛋白质浓度一定的条件下，稀释倍数和混合效 率是影响复性收率的重要因素。
活性剂） （4）离心沉降回收包含体 （5）根据需要，重复上述步骤（3）和（4），直至达
12 蛋白质复性
复性有关理论
两个理论都认同：蛋白质的折叠是蛋白质自身分 子内作用的结果，是由于暴露在溶液中的疏水侧链的 疏水作用而互相靠近，形成了具有特定三维空间结构 的蛋白质分子。 按拓扑学观点认为：虽然蛋白质内部基团相互作 用复杂，使得不同蛋白质的折叠复性过程不相同，但 不同蛋白质多肽链穿越空间的形式可能会是相同或类 似。实验中也发现，蛋白质拓扑结构的氨基酸序列不 改变对蛋白质的折叠速度等参数影响很很少。因此， 该理论认为，蛋白质的折叠过程的许多参数及其折叠 机理可能与蛋白质的拓扑结构有密切关系。
包涵体加工流程
机械破碎法
包涵体提 取
离
心
去除细胞碎片 （ 膜蛋白和脂类等）
如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产业化 的一个难题
包涵体的洗涤
• 为除去包涵体上粘附的杂质，应用洗涤液洗涤包涵体沉淀 • 常用去污剂Triton X-l00或脱氧胆酸钠和低浓度变性剂（如 2mol/L尿素或盐酸胍等，注意：过高浓度的尿素或盐酸胍 会使包涵体溶解）洗涤以除去脂类和膜蛋白。 • 如：50mM Tris-HCl， pH7.0-8.5， 2M尿素，1mM EDTA
• 3）变性剂浓度和复性时间
• 在高浓度变性剂存在时，蛋白质主要以U存在（6mol/L 盐酸胍、 8mol/L Urea等）；在中间浓度时（较低浓度的盐酸胍和 Urea），主要以I存在，即能抑制蛋白质分子间的疏水相互作 用，又不会妨碍蛋白质分子内疏水相互作用的形成。
• 由于I向N转化是一个慢的过程，当蛋白质在此时放置较长的一 段时间，I就可以慢慢地向N转化
包涵体形成的几种可能性
研究发现：低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成 包涵体。 1）少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高，积聚量超过其 在细胞内溶解度时沉淀； 2）合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫 键不能正确配对； 3）蛋白产生量过多，所需其他成分(如折叠酶和一系列翻译 后修饰酶及分子伴侣等)不足； 4）重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多、Pro 含量越高越容易形成包涵体。 5）重组蛋白所处的环境：发酵温度高时容易形成包涵体。 6）丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不 佳时，容易形成包涵体。
[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦
![[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦](https://img.taocdn.com/s3/m/b6184610ef06eff9aef8941ea76e58fafbb04554.png)
[原创]工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化-秦第八章工程菌生产的蛋白包涵体的复性与纯化分子生物学的发展使蛋白质的表达和生产进入到一个新的时代。
大肠杆菌由于遗传背景清晰，容易培养，可以大规模发酵，以及大量可供选择利用的克隆和高效表达载体而成为目前人们克隆和表达外源基因的首选菌株。
但是，在实际操作中重组蛋白质在大肠杆菌中的高水平表达往往导致蛋白质聚集形成不溶性的包涵体。
包涵体的形成虽有不少优点，如可溶性形式存在的外源蛋白在细胞内容易受到蛋白酶的攻击，而包涵体形式存在的外源蛋白则不易被蛋白酶降解;包涵体的形成降低了细胞内外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高;包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于分离纯化;包涵体对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离等。
但是，无活性的包涵体蛋白质需经过复性使其折叠成为具有天然构象和生物活性的蛋白质，这通常是一件很困难的事情，而且不同的蛋白质其复性方法也各不相同，因此基因重组蛋白质的复性一直是生物工程下游纯化技术的研究热点之一。
现有的生物技术研究和产业化过程表明，重组蛋白包涵体的变性及复性是重组蛋白类药物生产中最为关键的技术之一，是基因工程产品商业化的瓶颈，也是一个世界性难题。
第一节包涵体形成的原因,(什么是包涵体所谓包涵体是指由于表达部位低电势及外源蛋白质分子的特殊结构(如Cys含量高)，如低电荷，无糖基化等，使得重组蛋白质与核酸，周围杂蛋白质(如核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白质ompC、ompF和ompA等)，以及脂体、脂多糖等形成的聚合体(图8-1)。
包涵体一般大小为0.1~3.0 μm，具有很高的密度(约1.3 mg/ml)，无定形，呈非水溶性，只溶于尿素、盐酸胍等变性剂。
包涵体中重组蛋白质一般占包涵体总成分的50%以上，它们没有生物学活性，因为蛋白质分子没有形成正确的构象。
有报道表明成熟的分子相比包涵体内蛋白质含有更多的β结构而较少的,结构，也有报道表明包涵体中的肽链已获得与天然蛋白质分子非常接近的空间构象。
蛋白质变性与复性
3、变性剂的影响
尿素、盐酸胍， 甲基乙酰胺、 尿素、盐酸胍，N-甲基乙酰胺、甲基胺等 蛋白质构象破坏（肽链伸展） 蛋白质构象破坏（肽链伸展） 蛋白质寡聚体解离成亚基(巯基乙醇) 蛋白质寡聚体解离成亚基(巯基乙醇) 有些蛋白质还发生凝集和沉淀 变性机制：破坏氢键？？？ 变性机制：破坏氢键？？？ 用途？ 用途？
牛胰核糖核酸酶的变性与复性 （rancreatic ribonuclease)
不少蛋白质的变性之所以不可逆, 不少蛋白质的变性之所以不可逆,主要是所需 条件复杂. 条件复杂. 折叠所需的辅因子 解离与缔合条件的掌握 巯基的保护
(二)蛋白质变性和复性的动力学模型 二 蛋白质变性和复性的动力学模型
二态模型:天然态和变性态,之间有一个阀值, 二态模型:天然态和变性态,之间有一个阀值, 可逆体系, 可逆体系,存在平衡
（五）变性蛋白质经过的构象
1、经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 经过盐酸胍变性的蛋白质,肽链完全伸展; 2、经过酸、碱以及热变性的蛋白质，肽链不 经过酸、碱以及热变性的蛋白质， 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 完全伸展，还保留一部分紧密的构象； 3、由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 由高浓度有机熔剂（脂肪醇，氯乙醇等） 变性的蛋白质，螺旋增加， 变性的蛋白质，螺旋增加，不存在疏水键
（二）变性概念
涉及构象变化， 涉及构象变化，二硫键的断裂及侧链基团的化学修饰 吴宪： 吴宪： 天然蛋白质分子从紧密有序的结构 松散无序结构的过程。 松散无序结构的过程。 缺点： 缺点：没有与生物活性的变化联系
由于外界因素的作用， 由于外界因素的作用，使天然蛋白质分子 构象发生了异常变化，从而导致生物活性 的构象发生了异常变化，从而导致生物活性 的丧失以及物理、化学性质的异常变化 ， 的丧失以及物理、 以及物理 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation 。 这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。
蛋白质复性方法及其注意事项
蛋白质复性方法及其注意事项蛋白前期准备（1）查阅目标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。
（2）如果目标蛋白易降解，可在纯化时加1-2mMDTT，全程低温，及时处理。
（3）透析Buffer的选择可参考文献。
蛋白复性包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。
在E.coli中累积的重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包涵体蛋白是丧失生物活性的不可溶的错误折叠蛋白的聚集体。
包涵体的处理一般包括这么几步：包涵体的洗涤、溶解、纯化及复性。
如果过表达蛋白在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：（1）退一步，优化表达条件；（2）接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性。
这里主要考虑第二种方案。
包涵体的洗涤破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入蛋白酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。
洗涤Buffer：50mM Tris-HCl(pH8.0), 2mM EDTA, 2mM DTT，150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mg/ml Leupeptin, 1mg/ml Pepstatin,1mM TCEP。
超声时用40-60ml裂解液,因为我们的超声仪很适合用100ml小烧杯,装40-60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会洒出来.菌多就延长超声时间（全程冰浴）。
包涵体的溶解1、对于尿素和盐酸胍的选择：尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。
它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。
尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。
蛋白的变性和复性
蛋白的变性和复性变性：蛋白质的空间结构是体现生物功能的基础，蛋白质折叠则是形成空间结构的过程。
蛋白质一级结构决定其高级结构的著名学说, 认为蛋白质折叠是受热力学因素控制的. 天然蛋白质处于能量最低(即热力学最稳定)的状态. 一般来说, 天然蛋白质的结构是相对稳定的, 结构的稳定性也是其保持生物个体功能和物种的相对稳定所要求的.蛋白质担负着复杂的生化反应, 同时在生物合成以后, 蛋白质本身也经历着繁杂的生理过程. 蛋白质自翻译以后, 还需进行一系列的翻译后过程, 包括跨膜转运、修饰加工、折叠复性、生化反应、生物降解等. 这些过程似乎都伴随着蛋白质的结构转换, 不但受蛋白质肽链自身的热力学稳定性所控制, 而且还受动力学过程控制.变性原因：蛋白质因受某些物理或化学因素的影响，分子的空间构象被破坏，从而导致其理化性质发生改变并失去原有的生物学活性的现象称为蛋白质的变性作用（denaturation）。
变性作用并不引起蛋白质一级结构的破坏，而是二级结构以上的高级结构的破坏，变性后的蛋白质称为变性蛋白。
引起蛋白质变性的因素很多，物理因素有高温、紫外线、X-射线、超声波、高压、剧烈的搅拌、震荡等。
化学因素有强酸、强碱、尿素、胍盐、去污剂、重金属盐（如Hg2+、Ag+、Pb2+等）三氯乙酸，浓乙醇等。
不同蛋白质对各种因素的敏感程度不同。
蛋白质变性后许多性质都发生了改变，主要有以下几个方面：（一）生物活性丧失蛋白质的生物活性是指蛋白质所具有的酶、激素、毒素、抗原与抗体、血红蛋白的载氧能力等生物学功能。
生物活性丧失是蛋白质变性的主要特征。
有时蛋白质的空间结构只有轻微变化即可引起生物活性的丧失。
（二）某些理化性质的改变蛋白质变性后理化性质发生改变，如溶解度降低而产生沉淀，因为有些原来在分子内部的疏水基团由于结构松散而暴露出来,分子的不对称性增加，因此粘度增加，扩散系数降低。
（三）生物化学性质的改变蛋白质变性后，分子结构松散，不能形成结晶，易被蛋白酶水解。
蛋白质复性
重组包涵体蛋白质复性邹平基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。
重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。
但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。
随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。
一、包涵体蛋白1、包涵体的形成包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。
2、减少包涵体形成的策略降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。
低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。
在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。
添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。
在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。
利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。
筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。
3、包涵体破菌、分离、洗涤常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。
包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。
蛋白复原实验报告
本实验通过观察蛋白质变性及复性的现象，了解了蛋白质的性质。实验结果表明，蛋白质在一定条件下会发生变性，失去原有的生物活性，但在一定条件下可以复性，恢复原有的生物活性。蛋白质具有可溶性、变性和复性的特性，可用于生物制品的生产和应用。
五、实验结果与分析
1. 蛋白质变性实验
鸡蛋清蛋白溶液在加入硫酸铵后，出现白色沉淀，说明蛋白质变性。牛血清白蛋白溶液在加入氯化钠后，出现白色沉淀，说明蛋白质变性。
2. 蛋白质复性实验
鸡蛋清蛋白溶液在加入氢氧化钠后，白色沉淀逐渐消失，溶液变澄清，说明蛋白质复性。牛血清白蛋白溶液在加入蒸馏水后，白色沉淀逐渐消失，溶液变澄清，说明蛋白质复性。
3. 蛋白质鉴定实验
（1）取两支试管，分别加入等量的鸡蛋清蛋白溶液和牛血清白蛋白溶液。
（2）向第一支试管中加入碘液，观察颜色变化。
（3）向第二支试管中加入双缩脲试剂，观察颜色变化。
（4）取两支试管，分别加入等量的鸡蛋清蛋白溶液和牛血清白蛋白溶液。
（5）向第一支试管中加入酚酞指示剂，观察颜色变化。
（6）向第二支试管中加入酚酞指示剂，观察颜色变化。
三、实验材料
1. 蛋白质溶液：鸡蛋清蛋白溶液、牛血清白蛋白溶液。
2. 变性剂：硫酸铵、氯化钠。
3. 复性剂：蒸馏水、氢氧化钠。
4. 试剂：碘液、双缩脲试剂、酚酞指示剂。
5. 仪器：烧杯、试管、酒精灯、移液器、显微镜等。
四、实验步骤1. 蛋白质来自性实验（1）取两支试管，分别加入等量的鸡蛋清蛋白溶液和牛血清白蛋白溶液。
3. 蛋白质鉴定实验
鸡蛋清蛋白溶液加入碘液后，溶液变蓝，说明含有蛋白质。牛血清白蛋白溶液加入碘液后，溶液变蓝，说明含有蛋白质。鸡蛋清蛋白溶液加入双缩脲试剂后，溶液变紫，说明含有蛋白质。牛血清白蛋白溶液加入双缩脲试剂后，溶液变紫，说明含有蛋白质。鸡蛋清蛋白溶液加入酚酞指示剂后，溶液变红，说明含有蛋白质。牛血清白蛋白溶液加入酚酞指示剂后，溶液变红，说明含有蛋白质。
蛋白质复性的条件及影响因素
蛋白质复性的条件及影响因素王 雪 宋长征山东省医学科学院医药生物技术研究中心(济南,250062) 摘要 蛋白质复性是一个过程,存在中间阶段,此阶段的各种相互作用力决定了蛋白质能否复性。
蛋白质复性要求有一定的条件,如pH、温度、离子强度、蛋白质浓度等。
另外多种添加剂能促进蛋白质复性,其中包括表面活性剂、低浓度变性剂、分子伴侣蛋白和各种氧化还原对,但对于不同蛋白质,因其结构及理化特性不同,采取不同复性方法,可以使其达到最佳复性效果。
关键词 蛋白质; 结构与复性 蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分子物质,易受外界条件的影响发生变性。
随着基因工程技术的发展,许多实验通过将目的蛋白基因转入原核或真核表达体系进行表达的方法,得到需要的蛋白质,这大大丰富了蛋白质的来源。
但这些蛋白质,由于表达体系本身的原因,或实验过程的处理,多以无活性的形式存在,需要进行复性。
因此,对蛋白质复性的研究必然的成为从基础的实验室生物工程研究到最终临床应用过程中不可避免的一步。
本文将目前国内外对各种蛋白质复性方面的研究作一综述。
1 蛋白质的结构与复性蛋白质在一定的氨基酸顺序的基础上形成非常复杂的空间立体结构,其组成中的氨基酸本身的特性是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础,尤其是处于关键部位的氨基酸,对蛋白质的生物学功能有根本的影响,例如镰刀型红细胞贫血症中血红蛋白氨基酸的变化。
因此,能达到复性的蛋白质变性应是在保持氨基酸的基本种类和顺序不变的基础上,由于其他因素的影响而引起的分子高级结构的变化,如α2螺旋、β2折叠结构的增减,肽链的变性舒展,杂乱结构的增多,从而使蛋白质正常的生物学活性丧失。
蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有关系,例如含有巯基的氨基酸,最常见的是半胱氨酸,会降低蛋白质在高温条件下的稳定性,尤其在某些金属离子,Cu+、Zn2+等存在时,蛋白质对空气中的氧更为敏感,而易发生不可逆变性[1],在此基础上,有人通过用丝氨酸、丙氨酸替换活跃的半胱氨酸的方法来提高蛋白质的稳定性[2],这当然要在不影响蛋白质的生物学活性的基础上才有意义。
包涵体蛋白复性及其影响因素
第24卷第5期河北工业科技Vol.24,No.5 2007年9月Hebei Journal of Industrial Science and Technology Sept.2007 文章编号:100821534(2007)0520314203包涵体蛋白复性及其影响因素于文国,陶秀娥(河北化工医药职业技术学院制药工程系,河北石家庄 050026)摘 要:针对包涵体需经过细胞破碎、变性溶解、复性处理后才能形成具有一定空间构象的生物活性蛋白,且复性处理是一个非常复杂的生化反应过程,只有选择合理的方法,控制适宜的条件,才能提高蛋白的复性效率,综述了包涵体蛋白复性的方法,分析了影响复性的有关因素。
关键词:包涵体;溶解;复性;影响因素中图分类号:Q512 文献标识码:AWays and influence factors for renat uration of protein inclusion bodiesYU Wen2guo,TAO Xiu2e(Department of Pharmaceutical Engineering,Hebei Chemical and Pharmaceutical Vocational Technology College,Shijiazhuang Hebei050026,China)Abstract:To form active protein with an active conformation,processes such as crushing,dissolving and renaturalizing are needed.The renaturation is a very complicated biochemistry process.Only by selecting the proper way and controlling suitable conditions can we raise the efficiency of protein renaturation.This paper summarizes the strategies for renaturation of inclusion bodies,and analyses the factors that influnce renaturation of protein inclusion bodies.K ey w ords:inclusion body;dissolve;renaturation;influnce factors 包涵体是指大肠杆菌高效表达的重组蛋白在细胞内凝集,形成不溶的、无活性的固体颗粒。
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蛋白质的结构与复性
蛋白质在一定的氨基酸顺序的基础上形成非常
复杂的空间立体结构, 其组成中的氨基酸本身的特 性是蛋白质高级结构形成的决定因素和结构基础 , 尤其是处于关键部位的氨基酸 , 对蛋白质的生物学 功能有根本的影响 , 例如镰刀型红细胞贫血症中血 红蛋白氨基酸的变化。因此, 能达到复性的蛋白质 变性应是在保持氨基酸的基本种类和顺序不变的基 础上, 由于其他因素的影响而引起的分子高级结构 的变化 , 如 螺旋、 折叠结构的增减 , 肽链 的变性 舒展 , 杂乱结构的增多, 从而使蛋白质正常的生物学 活性丧失。蛋白质稳定性与组成中的氨基酸种类有 关系, 例如含有巯基的 氨基酸, 最常见的是半 胱氨 酸, 会降低蛋白质在高温条件下的稳定性, 尤其在某 些金属离子 , Cu + 、 Zn2+ 等存在时, 蛋白质对 空气中 的氧更为敏 感, 而易发生不可逆变 性 , 在 此基础 上, 有人通过用丝氨酸、 丙氨酸替换活跃的半胱氨酸 的方法来提高蛋白质的稳定性
参 考 文 献
1 Sandberg A et al . Biochem, 2002; 41: 1060 2 Kretschmar et al .Mol Biol, 1999; 291: 1147 3 Wallace LA et al . J Mol Biol, 2002; 315( 2) : 193 4 Capaldi AP et al . Nat Struct Biol, 2002; 9( 3) : 209 5 Zhu H et al . Chin Med J, 2001; 114( 2) : 186 6 7 9 方敏等 . 生物工程学报 , 2001; 17( 6) : 608 林来兴妹等 . 第一军医大学学报 , 2001; 4: 245 孙叶芳等 . 牙体牙髓牙周病学杂志 , 2001; 2: 73 516 11 Heven DL , Clark EDB. Bitechnol Bioeng, 1997; 54: 221 12 Menzella HG et al , Protein Expr Purif , 2002; 25( 2) : 248 13 Nam SH et al . Protein Expr Purif, 2002 ; 24( 2) : 282 14 Bhutani N et al . J Mol Biol, 2001; 314: 1167 15 Kuzewska J et al , J Mol Biol, 2001; 314: 901 16 Wang K, Abrahan Spector. Eur J Biochem, 2001; 268: 6335 17 Nath D et al . Protein Sci, 2002; 11( 11) : 2727 18 Dong X Y et al . Biotechnol Prog, 2002; 18( 3) : 663 19 Gray LR et al . Expr Purif, 2002; 26( 1) : 179 20 Cho TH et al . Bioseparation, 2001; 10( 4 5) : 189 ( 2003 02 17 收稿 )
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蛋白质复条件
蛋白质的复性对环境中的理化条件有很高的要
求 , 复性时必须对温度、 pH 、 离子强度等进行严格的 限制 , 同时蛋白质本身的性状也对复性效率产生影 响。朱慧等[ 5] 在研究重组人前尿激酶复性时 , 对不 同复性条件进行实验比较 , 发现强酸强碱均不利于 蛋白质复性, 偏碱 ( pH8. 6~ 8. 8) 、 低温 ( 4 ) 情况下
蛋白质是一种具有复杂的空间立体结构的大分 子物质 , 易受外界条件的影响发生变性。随着基因 工程技术的发展 , 许多实验通过将目的蛋白基因转 入原核或真核表达体系进行表达的方法, 得到需要 的蛋白质, 这大大丰富了蛋白质的来源。但这些蛋 白质, 由于表达体系本 身的原因 , 或实验过程 的处 理, 多以无活性的形式存在, 需要进行复性。因此 , 对蛋白质复性的研究必然的成为从基础的实验室生 物工程研究到最终临床应用过 程中不可避免 的一 步。本文将目前国内外对各种蛋白质复性方面的研 究作一综述。
国外医学分子生物学分册 2003 年第 25 卷第 6 期
等电点 , 因此 , 很难找到一种方法是适用于所有蛋白 质复性的。但蛋白质组成的基本成分是氨基酸, 空 间结构有一定的规律可寻 , 各种蛋白质对外界物理 或化学条件的反应, 蛋白质内部化学键的构键要求 又都有相似性 , 因此各种蛋白质的复性方法可以彼 此借鉴。但对于某一种特定蛋白质来说 , 其最佳复 性方法 , 需要在实验中进一步探索得到。
[ 2] [ 1]
, 蛋白质复性效率就取决于正
确折叠和变性聚集之间的竞争。疏水链暴露后, 肽 链上某些具有 光吸收作用的氨基酸也 暴露于溶液 中 , 会引起蛋白质紫外吸收值发生一定的变化, 根据 这一点, 可以对变复性过程中蛋白质的结构情况进 行观察。蛋白质的变性过程发生是比较迅速的, 只 要几分钟 , 但复性过程却相对较慢 , 需要几个小时, 因此, 复性时要给予足够的时间。
3
复性的辅助剂
变性后的蛋白质由于氨基酸的完整顺序没有变
化, 本身自然存在着向活性蛋白折叠的趋势, 有许多 蛋白质用透析等方法去掉变性环境后, 自身即可完 成复性过程, 最为典型的如核糖核酸酶 , 但对多数蛋 白质来说, 复性需要一些辅助剂的加入。这些添加 剂具有分子量小、 易于和蛋白质结合、 较稳定、 不易 聚集等优点。其作用机制不尽相同。 3 1 二硫键催化剂 各种氧化还原对可以使二硫键在正确位置上氧 化形成 , 象 cysteine/ cystine、 GSH/ GSSG。用此进行复 性时, 不同氧化还原物质之间的浓度比例是决定蛋 白质 复 性 的 重 要 因 素。 孙 叶 芳[ 9] 对 纯 化 出 的 rhBMP 2 单体按 不同实验条件分 8 组进行复性 , 发 现在 10 1 条件下的 GSH( 2 mmol/ L ) 和 GSSG( 0. 2 mmol/ L) 能 最大程 度的促 进 rhBMP 2 的活 性恢复。 在蛋白质 hainantoxin IV. [ 10] 的 复性中, 也验证了 这 一点 ( GSH: 5 mmol/ L, GSSG: 0. 5 mmol/ L ) 。 最近 ,
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国外医学分子生物学分册 2003 年第 25 卷第 6 期
蛋白质复性的条件及影响因素
王 雪 宋长征
山东 省医学科学院医药生物技术研究中心 ( 济南 , 250062) 摘要 蛋白质复性是一个过程 , 存在中间阶 段 , 此 阶段的 各种相互 作用力 决定了 蛋白质 能否复 性。蛋白质 复
性要求有一定的条 件 , 如 pH 、 温度、 离子强 度、 蛋 白质浓度 等。另外多种 添加剂能促 进蛋白质复 性 , 其 中包括表 面 活性剂、 低浓度变性剂、 分子伴侣蛋白和各种氧化还原对 , 但对于不同蛋白质 , 因其 结构及理化 特性不同 , 采取不 同 复性方法 , 可以使其达到最佳复性效果。 关键词 蛋白质 ; 结构与复性
360 剥离掉去垢剂, 蛋白质进行折叠。Dong [ 18] 研究了人 工分子伴侣对溶菌酶复性的影响 , 实验中蛋白质折 叠率随人工分子伴侣浓度上升而增高。 3 3 其他小分子添加剂的作用 有许多小分子添加剂对提高复性产量有帮助 , 它们分子量较小 , 易接近目的蛋白并与之结合 , 而且 具有不易聚集的性质 , 可以带动目 的蛋白的复性。 它们的分子内部大都含有 C= N 、 C= S 等类似共价 键结构 , 如盐酸胍和精氨酸 ( C= N) , 二甲基亚砜 ( S = O) , 乙酰化环糊精 ( C= O) 等, 这种结构可能与蛋 白质疏水基团的结合有关。在对蛋白质进行透析复 性的基础上, 可适当应用这些添加剂。
晶体蛋白
结构的变化 , 释放出目的蛋白, 以利于其他分子伴侣 发挥作用。Nathy 用 晶体蛋白对木聚糖合酶进 行复性 , 并检测复性过程中蛋白质结构的变化情况, 晶体蛋白先与木聚 糖合酶中间体结合形成一无 活性的 融球 状复合物 , 加入 ATP 后, 晶体蛋白 的结构发生变 化, 释放出目 的蛋白。他们 还发现, Ca2+ 可以提高酶活性的恢复 , 虽然体内木聚糖合酶 的复性并不需要 Ca2+ 参与。由此可见 , 蛋白质复性 中分子伴侣的结合遏制了蛋白质的聚集 , 而 ATP 的 加入可使分子伴侣将目的蛋白由结合态游离出来, 进行折叠, 而且, 多种分子伴侣对复性有协同作用。 在分子伴侣作用机制的基础上 , 有人用人工分 子伴侣系统对蛋白质进行复性。人工分子伴侣由去 垢剂和环糊精组成。去垢剂可以与蛋白质结合, 形 成复合体, 抑制蛋白质聚集 , 然后环糊精从复合体中
[ 17] [ 16]
蛋白质复性较好。蛋白质浓度对复性也有影响 , 浓 度越低, 聚集越不易发生[ 6] 。原因是由于蛋白质的 浓度上升时, 分子间相互碰撞的几率增加, 处于中间 状态的蛋白质对聚集又较敏感 , 使蛋白质趋于凝集 而不能正确折叠 , 已复性后的蛋白质分子则不易发 生聚集。但是, 实际的应用要求在高浓度下达到蛋 白质的复性 , 许多人尝试用改变实验步骤的方法来 克服这一问题。朱慧等将复性分步进行, 在一定的 时间间隔下分步加入蛋白质, 给蛋白质有效的时间 进行低浓度下的复性 , 结果提高了复性效率, 并比较 不同的时间间隔, 发现 60min 为最佳。周明乾等 [ 7] 在纯化白介素 2( IL 2) 和粒细胞 巨噬细胞集落刺激 因子( GM CSF) 融合蛋白时, 对溶解变性包涵体通过 一步稀释( 80 倍) 和分步稀释法分别进行复性, 前种 方法目的蛋白有析出 , 回收率低, 其原理也是通过避 免高浓度的蛋白质中间体同时存在于溶液中。蛋白 质分子正确折叠对溶液的离子强度也有要求, 适当 盐 浓度 有 利 于 蛋 白 质 内 部 各 种 化 学 键 的形 成。 Tayyab[ 8] 用 1. 0 mol/ L KCl 显著提高了在脲素中变性 的牛血清白蛋白的复性效率。国内孙叶芳[ 9] 对在大 肠杆菌中表达的重组人骨形态发生蛋白 ( rhBMP 2) 进行纯化及 复性时 , 结果显示高盐 不能使 rhBMP 2 获得 良好复性, 其他条件相同时 , 0. 75~ 1. 25 mol/ L 的 NaCl 最有利于蛋白二聚体的形成 , 活性最高 , 因 此, 溶液中的盐也是蛋白复性中应考虑的一项重要 因素。