固定化酶与固定化细胞
固定化酶和固定化细胞
2022年高考生物总复习:固定化酶和固定化细胞
(1)固定化酶
①形成:将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上,使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。
②特性:与游离酶相比较,稳定性好,与底物和产物容易分离,易于控制,能反复多次使用;便于运输和贮存,有利于自动化生产。
(2)固定化细胞:是指固定在一定空间范围内的、能够进行生命活动并且可以反复使用的活细胞,又叫做固定化活细胞或固定化增殖细胞。
(3)固定技术
①概念:利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
②方法(连线)
提示A—b—ⅠB—a—ⅡC—c—Ⅲ
③适用对象
一般来讲,酶更适合采用化学结合法和物理吸附法固定化,而细胞多采用包埋法固定化,这是因为个大的细胞难以被吸附或结合,而个小的酶则易从包埋材料中漏出。
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酶与细胞的固定化
发酵液中含菌体少,有利于产品的分离纯化,提高产品质量等
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
• 缺点:酶与载体相互作用力弱,酶易脱落等 1)引入功能团和间隔臂;
第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
酶被物理吸附于不溶性载体的一种固定化方 固定化后酶的哪些主要性质发生了变化?变化的趋势及原因分析.
常见非共价法?常见共价法?
法。 少量的持续不断的配基的脱落;
交联法由于不需要活化基团,所以条件比较温和,酶活的回收率比较高? 活力回收:指固定化后固定化酶(或细胞)所显示的活力占被固定的等当量游离酶(细胞)总活力的百分比. 第五节 固定化酶和固定化细胞的表征
颗粒、线条、薄膜和酶管等形状。颗粒状占 绝大多数,它和线条主要用于工业发酵生产 ,薄膜主要用于酶电极。酶管机械强度较大 ,主要用于工业生产。
固定化酶的优势:
① 极易将固定化酶与底物、产物分开;产物溶 液中没有酶的残留,简化了提纯工艺;
② 可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱 连续反应
③ 酶反应过程能够加以严格控制; ④ 较游离酶更适合于多酶反应; ⑤ 在大多数情况下,能够提高酶的稳定性; ⑥ 可以增加产物的收率,提高产物的质量; ⑦ 酶的使用效率提高、成本降低。
在中性pH下优先与a-氨基反应,因此有一定的选择性 缺点:在包埋过程发生的化学反应同样会导致酶的失活。
• 优点:酶活性中心不易被破坏,酶高级结构 二、载体活化程度和固定化配基密度的测定
固定化过程中,酶分子空间构象会有所变化,甚至影响了活性中心的氨基酸;
用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。
固定化技术应用-酶和细胞的固定化
固定化技术应用-酶和细胞的固定化试题中出现固定酶能不能催化一系列反应,查找资料,没有权威资料认为已经存在催化系列反应的酶,应该是研究方向。
选修知识的考查已经出现应用方向,也拓展到了技术的前景。
也就是说,需要在教学中创设情境适当扩大知识面,结合试题进行教学会收到很好的效果,如固定化酶技术可以拓展到固定化细胞。
问题:固定化技术以及发展前景如何?什么是固定化酶?什么是固定化细胞?011.固定化酶技术固定化酶技术是用物理或化学手段。
将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用,并可回收长时间使用的一种技术。
酶的固定化技术已经成为酶应用领域中的一个主要研究方向。
经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点,在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。
2.固定化酶技术的发展以前,固定化酶技术是把从生物体内提取出来的酶,用人工方法固定在载体上。
1916年Nelson和GrImn最先发现了酶的固定化现象。
科学家们就开始了同定化酶的研究工作。
1969年日本一家制药公司第一次将固定化的酰化氨基酸水解酶用于从混合氨基酸中生产L-氮基酸,开辟了固定化酶在工业生产中的新纪元。
我国的固定化酶研究开始于1970年,首先是微生物所和上海生化所的工作者开始了固定化酶的研究。
当今,固定化酶技术发展方向是无载体的酶固定化技术。
邱广亮等用磁性聚乙二醇胶体粒子作载体,采用吸附-交联法,制备出具有磁响应性的固定化糖化酶,简称磁性酶(M I E)一方面由于载体具有两亲性,M I E可稳定的分散于水相或有机相中,充分的进行酶催化反应;另一方面,由于载体具有磁响应性,M I E又可借助外部磁场简单地回收,反复使用,大大提高酶的使用效率。
Puleo等将钛合金表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基,然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面,或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理,再用含碳硝化甘油接枝,进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定,实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。
高中生物酵母细胞的固定化 (3)
↓ 冲洗:将固定好的酵母细胞(凝胶珠)用蒸馏水冲洗 2~3 次
↓ 发酵:将 150 mL 质量分数为 10%的葡萄糖溶液转移至 200 mL 的锥形瓶中,加入固定好的酵母细胞,25 ℃下发酵 24 h
3.用包埋法固定化细胞是将微生物细胞均匀地包埋于 不溶于水的多孔性载体 中,常用的包埋载体有
明胶 、 琼脂糖 、 海藻酸钠 、 醋酸纤维素 和 聚丙烯酰胺 等。 4.固定化酶的应用实例——高果糖浆的生产 固定化酶技术已经应用于高果糖浆的生产中,生产 高果糖浆所需要的酶是 葡萄糖异构酶 ,所使用的反 应柱上的孔应满足 酶颗粒 不能通过筛板上的小孔, 而 反应溶液却可以自由出入。
(3)影响实验成败的关键步骤是________________。 (4)海藻酸钠溶化过程的注意事项是______________。 (5)如果海藻酸钠浓度过低,形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞 数目_____。如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形 ,说明 ______。 (6)该实验中CaCl2溶液的作用是__________。
解析 (1)酵母细胞在缺水的状态下休眠。活化是加入水使酵 母菌恢复到生活状态。酵母细胞活化后体积会增大。(2)固定 化酶常用化学结合法和物理吸附法固定化。(3)实验的关键是 配制海藻酸钠溶液,得到凝胶珠。(4)海藻酸钠溶化过程要小 火加热(小火间断加热)不断搅拌,使海藻酸钠完全溶化,又 不会焦糊。(5)海藻酸钠浓度过低,包埋的酵母菌就过少;海 藻酸钠浓度过高,不易与酵母菌混合均匀。(6)氯化钙能使海 藻酸钠形成聚沉。
反应物不易 与酶接近, 尤其是大分 子物质,反 应效率下降
固定化酶与固定化细胞
(2) 共价结合法
此法得到的固定化 酶结合牢固、稳定 性好、利于连续使 用,因此它是目前 应用最多的一类固 定化酶的方法。
借助共价键将酶的活性非 必须侧链基团或细胞表面 基团(如氨基、羧基、羟 基、巯基、咪唑基等)和 载体的功能基团进行偶联 以达到固定化目的方法。
共价偶联法的优点、缺点
共价偶联法的优点:得到的固定化酶结合牢固、稳定性 好、利于连续使用。 共价偶联法的缺点:载体活化的操作复杂,反应条件激 烈,需要严格控制条件才可以获得较高活力的固定化酶。 同时共价结合会影响到酶的空间构象,从而对酶的催化 活性产生影响。
ro
rb
NaCS
ri
NaCS
ra
固定化酶的制法及其特性比较
特性
共价键 结合法
制备方法
离子 结合法
交联法
物理 包埋法 吸附法
制法 酶活力 底物特异性
难 高 易变
结合能力 再生
强 不可
易 高 不变
难 中 易变
中 可能
强 不可
易 低 不变
弱 可能
难 高 不变
弱
不可
固定化酶的保存方法
一.真空冷冻干燥保存(长期保存) 二.低温保存 三.多孔玻璃的无机质载体比纤维素等的有机质载体
含羟基的载体可用三氯 三嗪等多卤代物进行活 化,形成含有卤素基团 的活化载体。
D.硅烷化法
多孔玻璃特点: 机械强度好,表面积大。 耐有机溶剂和微生物破坏。载体可以再生,寿
命长等。
D.硅烷化 法
一般常用的载体:多 孔玻璃,多孔陶瓷。
D
. 硅 烷 化 法
D
. 硅 烷 化 法
D.硅烷化 法
E .溴化氰法
大小 和总吸附面积的大小。
酵母细胞的固定化
酵母细胞的固定化一、固定化酶与固定化细胞及应用实例1、固定化酶(1)含义:将酶固定在不溶于水的载体上。
(2)实例:利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。
(3)优点:酶既能与反应物接触,又能与产物分离,同时,固定在载体上的酶还可以被反复利用。
(4)缺点:一种酶只能催化一种化学反应,而在实际生产中,很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。
(5)应用实例:生产高果糖浆①原料:葡萄糖②原理:葡萄糖果糖③生产过程及示意图:a.反应柱能连续使用半年,大大降低了生产成本。
b.提高了果糖的产量和品质。
2、固定化细胞(1)含义:将细胞固定在一定空间内的技术。
(2)优点:成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收(3)缺点:固定后的细胞与反应物不容易接近,可能导致反应效果下降,由于大分子物质难以自由通过细胞膜,因此固定化细胞的应用也受到限制。
二、固定化酶或固定化细胞技术的常用方法1、固定化酶或固定化细胞:指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。
2、方法:①物理吸附法 :将酶(或细胞)吸附在载体表面上②包埋法:将酶(或细胞)包埋在细微网格里③化学结合法:将酶(或细胞)相互结合,或将其结合到载体上。
葡萄糖异构酶三、固定化酵母细胞的制备与发酵(一)制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化:1g干酵母+10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h,使之活化。
〖思考〗活化是指什么?在缺水状态下,微生物处于休眠状态。
活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液:0.83gCaCl2+150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠+10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火(或间断)加热,并不断搅拌,使之溶化→蒸馏水定容到10mL。
注:加热时要用小火,或者间断加热,并搅拌,反复几次,直到海藻酸钠溶化为止4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温,加入以活化的酵母细胞,进行充分搅拌,再转移至注射器中注:1、海藻酸钠溶液必须冷却至室温,搅拌要彻底充分,使两者混合均匀,以免影响实验结果的观察。
固定化酶和固定化细胞技术
张 海 龙山东教育学院 生物系Shan Dong Institute of Education第九章 第九章 固固定化酶与固定化细胞技术第一节固定化酶•固定化酶:是指在在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以回收重复利用。
•酶的固定化是将酶与水溶性载体结合,制备固定化酶的过程。
固定化酶的特点(与游离酶相比)•(1)极易将固定化酶与底物、产物分开,产物溶液中没有酶的残留,提纯工艺简化;•(2)能够在较长时间 进行反应,便于实现连续化和自动化;•(3)大多数情况下,能够提高酶的稳定性;•(4)酶的反应过程能够严格控制;•(5)酶的利用率提高,生产成本降低;•(6)能够进行多酶反应;•(7)可以增加产物收率,提高产物的质量;•(8)增加了生产的成本;•(9)只能用于可溶性小分子底物,对大分子的底物适应性差,与完整的菌体细胞相比,不适宜于多酶反应,特别是需要辅助因子的反应。
一、固定化酶的制备方法•根据不同应用目的和不同应用环境选择不同的方法,遵循如下原则:–(1)必须维持酶的催化活性以及专一性;–(2)有利于实现连续化和自动化;–(3)固定化酶应有最小的空间位阻,尽可能不妨碍酶与底物的接近,以便提高产品的质量;–(4)酶与载体必须结合牢固,便于回收贮存,反复利用;–(5)固定化酶应有最大的稳定性,所选载体不应与产物或反应液发生化学反应;–(6)成本要低,以便于工业使用;实践中,可根据酶的性质,反应特征选择合适的方法。
•(一)包埋法:–1、网格型–2、微囊型:界面沉淀法、界面聚合、二级乳化法、脂质包埋法•(二)吸附法:–1、物理吸附法–2、离子吸附法•(三)、共价偶联法•(四)、交联法•(五)、共价结合法–1、结晶法–2、分散法酶固定化方法示意图二、固定化酶的性质1、稳定性2、最适温度最适pH pH3、最适4、底物特异性go稳定性比游离酶的好(1)对热的稳定性提高,可以耐受较高的温度2040608010030405060708090Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A BA 固定化酶B 游离酶稳定性(续)(2)保存稳定性好,保存时间延长(3)对蛋白酶的抵抗性增强,不易被蛋白(4)对变性剂)对变性剂((如尿素、有机溶剂、盐酸胍等如尿素、有机溶剂、盐酸胍等))的耐受性提高,保留较高酶活(5)对酶抑制剂、对不同)对酶抑制剂、对不同pH pH pH稳定性提高稳定性提高稳定性提高..(back back))最适温度与游离酶差不多050100150200250300350304050607080Temperature ( ºC )R e l a t i v e a c t i v i t y (%)A B最适温度(续)例外用重氮法制备的固定化胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,5-10℃;比游离酶高比游离酶高5-105-15 ℃以共价结合法固定的色氨酸酶,比游离酶高5-15 以共价结合法固定的色氨酸酶,比游离酶高汤亚杰以交联法用壳聚糖固定胰蛋白酶最适温度为30 ℃同一种酶;80 ℃,比固定化前提高了,比固定化前提高了30用不同的方法或载体进行固定化,其最适温度可能不同不同方法和载体固定化氨基酰化酶的最适温度 <60烷基化法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 67离子键结合法DEAE-DEAE-纤维素纤维素 72离子键结合法DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 60游离最适温度最适温度((℃ ) 方法载体载体最适pH 值酶固定化后,对底物作用的最适酶固定化后,对底物作用的最适pH pH pH和酶和酶—pH pH曲线常发生偏曲线常发生偏移(见图),原因是微环境表面电荷性质的影响带负电荷的载体,固定化酶最适pH 值比游离酶的高(1)载体的带电性质对最适pH 的影响原因:吸引作用带正电荷的载体,固定化酶最适pH 值比游离酶的低H +H +H +H +H +H +H +偏酸微环境OH -OH -OH -OH -OH -OH -H+H+大环境偏碱酶不带电荷的载体,固定化酶最适pH 值一般不变(2)产物酸碱性对最适pH 值的影响酸性酸性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的高值比游离酶的高碱性碱性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值比游离酶的低值比游离酶的低中性中性::固定化酶的最适固定化酶的最适pH pH pH值一般不变值一般不变原因原因::载体障碍产物的扩散底物的特异性与底物分子量的大小有关与底物分子量的大小有关;;作用于低分子量底物的酶,没有明显变化,如氨基酰化酶、葡聚糖氧化酶等酰化酶、葡聚糖氧化酶等;;既可作用于大分子底物,又可作用于小分子底物的酶,往往会发生变化。
第二章 4 固定化酶与固定化细胞
一. 影响固定化酶性质的因素
1. 酶本身的变化,主要是由于活性中 心的氨基酸残基、高级结构和电荷状 态等发生了变化。
一. 影响固定化酶性质的因素
2. 载体的影响
(1) 分配效应 (2) 空间障碍效应 (3) 扩散限制效应
3.
固定化方法的影响
二.固定化后酶性质的变化
1. 固定化对酶活性的影响:酶活性下降, 反应速度下降,专一性 原因:酶结构的变化
1973年,出现固定化菌体,日本首次在工 业上应用固定化大肠杆菌菌体。 70年代出现了固定化细胞技术。1976年, 法国首次用固定化酵母细胞生产啤酒和酒 精,1978年,日本用固定化枯草杆菌生产 淀粉酶。 1982年,日本首次研究用固定化原生质体 生产谷氨酸。
第二节 固定化酶的制备
一.选择方法依据:
第四节 固定化原生质体和辅酶
一 原生质体的制备 二原生质体的固定化 三 辅酶固定化
二 原生质体固定化的方法
将原生质替制备好后,把离心收集到的原生
质体重新悬浮在含有渗透压稳定剂的缓冲液 中,配成一定浓度的原生质体悬浮液,然后 采用包埋法制成固定化原生质体。
三. 辅酶固定化
1 原因 有机辅因子中具有某些特殊的化学基团, 参与酶的催化反应
4. 新能源开发中的应用
H2是重要的能源物质,虽然有许多微生物可以产生 H2,但产氢系统不稳定。有人利用固定化丁酸梭菌 连续产氢,稳定性比天然细胞好。
将植物的叶绿体中的铁氧还原蛋白氧化酶系统用胶
原膜包被,可用于水的光介产生氢气和氧气
5. 固定化酶在基础理论研究中应用
研究蛋白质-核酸分子结构
第五章-固定化酶
2.离子结合法 酶通过离子键结合于具有离子交换剂的水不溶 性载体的固定化方法。 • 常用载体:各种阴、阳离子交换剂。 如CM-纤
维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等
• 优点:操作简单,酶活性中心不易被破坏和酶
高级结构变化少,酶活力损失很少。
• 缺点:载体和酶的结合力 比较弱,酶易脱落。
3.共价结合法
• 相对活力:固定化酶活力与同量蛋白量
的溶液酶活力的比值
固定化酶活力 相对活力 100% 溶液酶总活力 残留酶活力
四、固定化酶(细胞)的半衰期
• t1/2 :固定化酶(细胞)的活力下降为最 初活力1/2所经历的连续工作时间;衡量 操作稳定性的指标。
Fig. 2. Kinetic of ROL adsorption on the silica aerogels. The activity was measured using olive oil emulsion as substrate at pH 8.5 and 37 °C.
第五章 固定化酶与固定化细胞
第一节 酶的固定化
一、固定化酶(immobilized enzyme):是 指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能 连续进行反应,反应后的酶可以回收重复 使用。
优点:
①极易将固定化酶与底物、产物分开,简 化了提纯工艺,提高酶的使用效率; ②在大多数情况下,能够提高酶的稳定;
(五)固定化酶的米氏常数(Km)变化 • 中性载体:固定化酶的表观Km值上升。
• 载体与底物电荷相同:表观Km值显著 上升; • 载体与底物电荷相反:Km
?
四、影响固定化酶性能的因素
1.构象改变、立体屏蔽
• 构象改变:指固定化过程及酶和载体的 相互作用,引起了酶的活性中心构象发 生改变,从而导致酶活性改变的—种效 应。
吸附法思考!直接使用酶固定化酶与固定化细胞各有什么优缺点
练习:
1、制备固定化酵母细胞的过程中错误的是(
)
A、取干酵母,加入蒸馏水,使其活化
B、配制海藻酸钠时,加热用大火,直到海藻酸钠溶化为止
C、将溶化好的Βιβλιοθήκη 藻酸钠溶液冷却至室温,加入已活化的酵
母细胞
D、将凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30 min左右
2、下列叙述不正确的是(
)
A、从操作角度来考虑,固定化细胞比固定化酶容易
B、固定化细胞比固定化酶对酶的活性影响更小
C、固定化细胞固定的是一种酶
D、将微生物的发酵过程变成连续的酶反应应选择固定化细
胞技术
一种酶只能催化一种 化学反应,而在生产 实践中,很多产物的 形成都通过一系列的 酶促反应才能得到的。
固定后的酶或细胞与
成本低,操作更容易。
反应物不容易接近, 可能导致反应效果下
降等。
三、实验操作
(一)制备固定化酵母细胞
1、酵母细胞的活化
思考: 关于酵母菌你知道哪些知识? 什么是活化? 怎样活化? 应注意什么?
固定化细胞固定的是一系列酶 4.如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应,应 该选择哪种方法? 固定化细胞技术
5.如果反应底物是大分子物质,又应该采用哪种方法? 固定化酶技术
1、 对固定酶的作用影响较小的固定方法 是什么?
吸附法。
2、 将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵 过程变为连续的酶反应,应当固定(酶、 细胞);若将蛋白质变成氨基酸,应当固 定(酶、细胞)。
2、配制物质的量浓度为0.05mol/L 的CaCl2溶液
3、配制海藻酸钠溶液
应当注意什么问题? 1、加热时要用小火,或者间断加热 2、海藻酸钠的浓度 浓度过高——将很难形成凝胶珠; 浓度过低——形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少,
固定化酶与固定化细胞
生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 生化代谢产物,需由多种酶经多步酶促反应才能合成. 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的, 多酶反应器,为制造那些在有机合成上很棘手的,结构 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径. 复杂的生化代谢物开辟了一条新的途径.
固定化细胞
直接把微生物细胞固定化
包埋法是制备固定化细胞最常用的方法. 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法.将 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶, 产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶,琼脂糖 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶, 凝胶,琼脂,海藻酸,卡拉胶,二和三醋酸纤 胶原,明胶和戊二醛等包埋起来, 维,胶原,明胶和戊二醛等包埋起来,发挥酶 或酶系的作用. 或酶系的作用. 例如: 3m1细胞悬浮液加人到 例如:海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到 2% 溶液中,置冰箱10h 10h, 20ml 2%CaCl2溶液中,置冰箱10h,用 100ml生理盐水洗二次 生理盐水洗二次. 100ml生理盐水洗二次. 注意:如果反复使用固定化细胞,需要避免 注意:如果反复使用固定化细胞, 其他微生物的污染, 其他微生物的污染,在工业生产中细胞的固 定化是在严格无菌条件下进行. 定化是在严格无菌条件下进行.
酶分子被结合到水不溶性 载体上共价结合形成水不 溶性的固定化酶
交联法
使用双功能或多功能试剂使酶分子之间相互 交联呈网状结构的固定化方法. 交联呈网状结构的固定化方法. 最常用的双功能试剂有戊二醛, 最常用的双功能试剂有戊二醛,顺丁稀二酸 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基, 酐和乙烯共聚物等.酶蛋白中的游离氨基,酚 咪唑基及巯基均可参与交联反应. 基,咪唑基及巯基均可参与交联反应. 双功能试剂: 双功能试剂: 常用的是戊二醛 常用的是戊二醛 O O
固定化酶和固定化细胞的制作方法
固定化酶的制作方法固定化酶的方法主要有吸附法、包埋法、共价结合法、共价交联法、结晶法(一)、吸附法吸附法是通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法。
只需将酶液与具有活泼表面的吸附剂接触,再经洗涤除去未吸附的酶便能制得固定化酶。
是最简单的固定化技术,在经济上也最具有吸引力.物理吸附法(physical adsorption)是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。
常用的载体有:高岭土、皂土、硅胶、氧化铝、磷酸钙胶、微空玻璃等无机吸附剂,纤维素、胶原以及火棉胶等有机吸附剂。
离子结合法(ion binding)是指在适宜的pH和离子强度条件下,利用酶的侧链解离基团和离子交换基间的相互作用而达到酶固定化的方法(离子键)。
最常用的交换剂有CM-纤维素、DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶等;其他离子交换剂还有各种合成的树脂如Amberlite XE-97、Dowe X-50等。
离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。
影响酶蛋白在载体上吸附程度的因素:1. pH:影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附。
2. 离子强度:多方面的影响,一般认为盐阻止吸附。
3. 蛋白质浓度:若吸附剂的量固定,随蛋白质浓度增加,吸附量也增加,直至饱和。
4. 温度:蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。
5. 吸附速度:蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。
6. 载体:对于非多孔性载体,则颗粒越小吸附力越强。
多孔性载体,要考虑吸附对象的大小和总吸附面积的大小。
吸附法的优点:操作简单,可供选择的载体类型多,吸附过程可同时达到纯化和固定化的目的,所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。
吸附法的缺点:酶和载体的结合力不强,会导致催化活力的丧失和沾污反应产物;经验性强。
(二)、包埋法包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。
(如将聚合物的单体和酶溶液混合后,再借助聚合促进剂的作用进行聚合,将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的)。
固定化酶与固定化细胞技术
固定化酶与固定化细胞技术酶是具有生物催化功能的生物大分子(蛋白质或RNA),但通常指的是由氨基酸组成的酶,本章也仅探讨此类酶。
作为一种生物催化剂,参与生物体内各种代谢反应,而且反应后其数量和性质不发生变化。
由于酶的高级结构对环境十分敏感,各种因素(包括物理因素、化学因素和生物因素)均有可能使酶丧失活力。
但在常温常压条件下能高效地进行反应,且具有很高的专一性,副反应少,许多难以进行的有机化学反应在酶的作用下都能顺利进行。
由于酶的这些特点,大大促进了酶的应用和酶技术的研究。
酶被人们广泛应用于酿造、食品、医药等领域,特别是近几年来,随着分子生物学的发展,酶的应用更加活跃。
由于酶反应随着时间的延长,反应速度会逐渐降低,反应后酶不能回收,这就限制了酶的应用范围。
如果能将酶固定在惰性支持物上制成固定化酶,仍具有催化作用,还能回收反复使用,并且生产可以连续化、自动化。
从20世纪60年代固定化酶技术发展以来,不仅在酶学理论研究中发挥独特作用,在实际应用中也显示出强大的威力。
随着技术的不断发展,广义的固定化酶发展到固定化辅酶、固定化细胞及固定化细胞器等,固定化酶在食品、医药、化工和生物传感器制造上都有成功的应用实例。
对一个特定的目的和过程来说,是采用细胞,还是采用分离后的酶作催化剂,要根据过程本身来决定。
一般来说,对于一步或两步的转化过程用固定化酶较合适;对多步转换,采用固定化细胞显然有利。
第一节固定化酶固定化酶(immobilized enzyme)是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后的酶可以回收重复使用。
酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合,制备固定化酶的过程。
固定化酶的形状依不同用途有颗粒、线条、薄膜和酶管等,颗粒状占绝大多数;颗粒和线条主要用于工业发酵生产;薄膜主要用于酶电极;酶管机械强度较大,主要用于化学工业生产。
目前,由于固定化酶的性质比游离酶及其相关技术优越,人们对其极感兴趣,因此固定化酶的应用也与日俱增。
固定化酶与固定化细胞(第六章)
固定化催化剂的特殊应用( 固定化催化剂的特殊应用(三) 特殊应用 药物控释载体9
药物释放要求: 定点(靶向性); 定量(太高太低均有害); 避免被(胃酸、蛋白酶)破坏; 避免引起免疫反应。 措施:聚合物修饰;凝胶包埋;制成微球 制剂或脂质体、具有导向性的药物等。
固定化催化剂的特殊应用( 固定化催化剂的特殊应用(四) 特殊应用 --生物传感器
第六章 固定化酶与固定化细胞
固定化酶定义的形成以及扩展
固定化酶是20世纪50年代发展起来的一项新技术, 最初称“ 水不溶性酶 ”(water insoluble enzyme) 和 “ 固相酶 ” (solid phase enzyme),是将水溶性的酶 与不溶性的载体结合起来。 后来,人们发现可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装 置中,高分子底物与酶在超滤膜的一边,反应产物可以 透过膜逸出。这种情况下,酶本身仍处于溶解状态,只 不过是被固定在一个有效的空间内。再用上面的名字已 不合适。 1971年第一次国际酶工程会议上统一称为“ 固定化 酶”。(immobilized enzyme )是指在一定空间内成闭索 状态存在的酶,能连续地进行反应,反应后酶可以回收 利用。 “ 固定化的生物催化剂” 包含酶、含酶细胞及微生物 的固定化。1
固定化酶半衰期(T 固定化酶半衰期(T1/2)的测定
测定半衰期的意义:评价固定化方法;生 产上决定更换酶的时机。 定义:从开始到活力只剩一半时所经历的 时间。有使用半衰期,贮藏半衰期等。 方法:直接法测既费时、费力,有时还不 可行(如半衰期很长)。 参考测定放射性元素半衰期的做法,间接 测定。
间接法测定固定化酶半衰期T 间接法测定固定化酶半衰期T1/2
生物催化剂固定化的优点
o 某些酶回到了它在体内的原始状态。 o 可以重复使用,节约了成本。 o 使用时方便得多,对产物抑制型反应既有 利又方便。 o 催化剂易和产物分离,有利于提高产品质 量(如生产针剂药品,最后不能含蛋白 质)。 o 大多数情况下催化剂固定化后稳定性提高。 o 酶反应过程可以控制。 o 较游离酶更适合于多酶体系反应。
最新:第4章 固定化酶和固定化细胞-文档资料
有些情形下,由于产物分子在靠近膜面的位置逐渐积 聚而形成凝胶层,造成酶膜反应器中严重的产物抑制 降低了生产效率。 浓差极化和膜污染使酶膜反应器的传质速率和生产能 力急剧下降,膜孔堵塞、膜厚增加使膜的结构形态发 生不利变化,膜需要频繁地清洗或更换。
4.5.3.3 膜式反应器的应用
酶膜反应器把酶促反应与膜的选择性物质传递 有效地结合在一起,从而创造出有利的过程热 力学和动力学,在生物、医药、化工、环境等 领域得到了越来越广泛的应用。目前膜反应器 的应用主要有:辅酶或辅助因子的再生、有机 相酶催化、手性拆分与手性合成、反胶团中的 酶催化、生物大分子的水解等。
与酶的固定化相比,固定化细胞保持了胞内酶系 的原始状态与天然环境,有效地利用游离细胞完 整的酶系统和细胞膜的选择通透性,既具有固定 化酶的优点,又具有其自身的优越性:
固定化细胞的优越性
①无需进行酶的分离和纯化,减少酶的活力损 失,同时大大降低了成本; ②可进行多酶反应,且不需添加辅助因子,固 定化细胞不仅可以作为单一的酶发挥作用,而 且可以利用菌体中所含的复合酶系完成一系列 的催化反应,对于这种多酶系统,辅助因子再 生容易;
固定化细胞的优越性
③对于活细胞来说,保持了酶的原始状态,酶 的稳定性更高,对污染的抵抗力更强; ④细胞生长停滞时间短,细胞多,反应快等等。 正是由于固定化细胞的这些无可比拟的优势, 尽管其出现远远晚于固定化酶,但其应用范围 比固定化酶更为广泛。
当然,固定化细胞也有其自身的缺点,如:必须 保持菌体的完整,需防止菌体的自溶,否则影响 产物的纯度;必须抑制细胞内蛋白酶对目的酶的 分解;胞内多酶的存在,会形成副产物;载体、 细胞膜或细胞壁会造成底物渗透与扩散的障碍等。
(2)酶膜反应器可将目的产物分离出去,而 酶可以重复利用,可实现连续操作,并有可 能提高复杂反应的选择性。 (3)膜作为酶的固定化载体可以使酶在类似 生物膜的环境中高效发挥作用。
酶工程第六章 固定化酶
酶的固定化方法主要可分为四类:吸附法、包埋法、共价键结合 法和交联法等。吸附法和共价键结合法又可统称为载体结合法。
6.3.1吸附法
吸附法(adsorption)是通过载体表面和酶 分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的 方法,是固定化中最简单的方法。 酶与载体之间的亲和力是范德华力、疏水相 互作用、离子键和氢键等。 吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。
(1)重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体的重氮基
团通过共价键相连接而固定化的方法,是共价键法中使用
最多的一种。
常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸的共
聚体和聚丙烯化生成叠氮化合物,再与酶分子上
的相应基团偶联成固定化酶。含有羟基、羧基、羧甲基等
其新的功能和新的应用正在迅速不断地扩展,是一项
研究领域宽广、应用前景极为引人瞩目的新研究领域和新 技术。
6.1 固定化酶的定义与优点
所谓固定化酶(immobilized enzyme), 是指在一定的空间范围内起催化作用,并 能反复和连续使用的酶。
固定化酶的优点:
(1)同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用; (2)固定化后,和反应物分开,有利于控制生产过程,同 时也省去了热处理使酶失活的步骤; (3)稳定性显著提高; (4)可长期使用,并可预测衰变的速度; (5)提供了研究酶动力学的良好模型。
(1)物理吸附法
物理吸附法(physical adsorption)是通过物理方法将酶
直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。
是制备固定化酶最早采用的方法。
如α-淀粉酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶等都曾采用过此
法进行固定化。物理吸附法常用的有机载体如纤维素、胶 原、淀粉及面筋等;无机载体如活性炭、氧化铝、皂土、 多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。
固定化酶和固定化细胞
❖ (1)必须注意维持酶的构象,特别是活性中心的构象。 ❖ (2)酶与载体必须有一定的结合程度。酶的固定化既不影
响酶的原有构象,又能使固定化酶能有效回收贮藏,利于反 复使用。 ❖ (3)固定化应有利于自动化、机械化操作。这要求用于固 定化的载体必须有一定的机械强度,才能使之在制备过程中 不易破坏或受损。
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❖(1)重氮法 重氮法是将酶蛋白与水不溶性载体 的重氮基团通过共价键相连接而固定化的方法, 是共价键法中使用最多的一种。
❖ 常用的载体有多糖类的芳族氨基衍生物、氨基酸 的共聚体和聚丙烯酰胺衍生物等。
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❖(2)叠氮法 即载体活化生成叠氮化合物,再与 酶分子上的相应基团偶联成固定化酶。
▪ 凝胶包埋法常用的载体有海藻酸钠凝胶、角叉 菜胶、明胶、琼脂凝胶、卡拉胶等天然凝胶以 及聚丙烯酰胺、聚乙烯醇和光交联树脂等合成 凝胶或树脂。
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❖ (2)微胶囊包埋法 ▪ 微胶囊包埋即将酶包埋在各种高聚物制成的半 透膜微胶囊内的方法。它使酶存在于类似细胞 内的环境中,可以防止酶的脱落,防止微囊外 的环境直接接触,从而增加了酶的稳定性。常 用于制造微胶囊的材料有聚酰胺、火棉胶、醋 酸纤维素等。
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固定化酶和固定化细胞
固定化酶的定义
❖所谓固定化酶(immobilized enzyme),是指在一定的 空间范围内起催化作用,并能反复和连续使用的 酶。
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酶固定化技术发展史
❖ 1916年,Nelson和Griffin发现酶的固定化现象;
❖ 1969年,千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于 生产L-氨基酸,开创了固定化酶应用于工业生产 的先例;
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交联反应既能发生在分子间,也可 发生在分子内。
• 酶浓度低时,交联发生在分子内,酶 仍保持溶解状态。 • 酶浓度高时,交联发生在分子间,酶 变为不溶态。
缺点:
(1)反应条件激烈,酶分子的多个基团 被交联,酶活力损失大。 (2)制备的固定化酶颗粒较小,给使用 带来不便。
4. 包埋法(entrapment)
将酶用物理的方法 包埋在各种载体(高聚 物)内。分为:
网格型:将酶包埋在高 分子凝胶细微网格中。 微囊型:将酶包埋在高 分子半透膜中。
1)网格型包埋法 (gel (lattic) entrapment)
又称凝胶包埋法
使用的多孔载体及其特点
凝胶
包埋条件 酶活性 强度
天然凝胶 琼脂、海藻酸钙 、角叉菜胶、明 胶
网格型 微囊型
1.吸附法(adsorption)
依据带电的酶或细胞和载体之间的静电作用 ,使酶吸附于惰性固体的表面或离子交换 剂上。
根据吸附剂的特点分:
1)物理吸附法(physical adsortion) 作用力:氢键、疏水键 常用载体:氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、
硅胶、羟基磷灰石、纤维素等。 2)离子结合法(ion binding) 作用力:离子键 常用载体:DEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、 CM-
固定化载体与底物电荷相反,固定化酶的表 观Km值降低。
固定化载体与底物电荷相同,固定化酶的表 观Km值显著增加。
(六)酶的作用专一性
与自然酶基本相同。但大分子底物 难于接近酶分子,导致酶的专一性发生 改变。
二、固定化细胞的性质
与固定化酶相比,固定化细胞的情况 比较复杂。 (1)有活性升高的现象。 (2)稳定性的增加 。 (3)最适温度和最适pH常保持不变。
• 固定化酶(定义):用物理或化学手段定位在限定 的空间区域,并使其保持催化活性,可重复利用的 酶。(1971年在美国召开的第一届国际酶工程会议)
• 固定化细胞(定义):将具有一定生理功能的生物 细胞(如微生物细胞、植物细胞或动物细胞等),用一定的方 法将其固定,作为固体生物催化剂而加以利用的一 门技术。
1)固定化酶颗粒小,有利于底物和产物扩散。 2)半透膜能阻止蛋白质分子渗漏和进入,注入 体内既可避免引起免疫过敏反应,也可使酶免 遭蛋白水解酶的降解,具有较大的医学价值。
缺点:反应条件要求高,制备成本也较高。
包埋法是目前应用最多的一种较理想的方 法,与其它固定化方法相比:
•优点:不与酶蛋白氨基酸残基反应,很少改 变酶的高级结构,酶活回收率高。 •缺点:只适合作用于小分子底物和产物的酶 。
乙酰 -DL — Ala
L — Ala +乙酸 乙酰 -D — Ala
A-L-Ala A-D-Ala
储 罐
固定化 酶柱子
消
泵
离心机
旋
反
应
器
反应产物
L-Ala A-D-Ala
晶体 L-Ala
2.葡萄糖异构酶
世界上生产规模 最大,应用最为成功 的一种固定化酶。
二、固定化酶在医学上的应用
1. 消血栓:
吸附法 共价偶联法
交联法
包埋法
酶的四种固定化方法
各种固定化方法的优缺点比较
固定化方法
吸附法
包埋法 共价结 交联法
物理吸附法 离子吸附法
合法
制备难易 易
易
较难 难
较难
结合程度 活力回收
弱
中等
高,酶易流失 高
强
强
强
高
低
中等
再生
可能
可能
不能 不能 不能
费用
低
低
低
高
中等
底物专一性 不变
不变
不变 可变 可变
1.酶传感器
固定化酶和电化学传感器的结合。 优点: ①既有不溶性酶体系的优点,又具有电化学
2)偶联方法:
偶联成功与否取决于:
•载体:功能基团:芳香氨基,羧基, 羧甲基等。
•酶分子:侧链非必需基团:羧基,巯 基,羟基,酚基,咪唑基。
常用的偶联反应有:重氮化法、叠 氮法、溴化氰法、烷基化法等。
优点:酶与载体结合牢固,不会轻易 脱落,可连续使用。
•缺点:反应条件较激烈,易影响酶的 空间构象而影响酶的催化活性。
相对活力=固定化酶总活力/ (加入酶的总活 力-上清液中未偶联酶活力)×100%
(四)半衰期
在连续测定条件下,固定化酶(细胞)的活 力下降为最初活力一半所经历的连续工作时 间,以t1/2表示。
是衡量稳定性的一项重要指标。
不同固定化方法的比较
carriers
Agar po1yacrvlamlde Gelatin carragheenan Glutaraldehyde
纤溶酶是异源蛋白质,在人体内引起免疫 反应,无法长期使用。
酶的不稳定性使其在较短的时间内失活。
用包埋法制备的酶固定化技术可克服
上述弊端,酶在囊中不能漏出,小分子物
质能自由进出。
2. 人工肾:
原理:将病人血液中的尿素经脲酶水解成 氨,再用活性炭吸附。即:用固定化脲酶 和微胶囊活性炭组成人工肾。
三、在分析检测中的应用
②载体要求: a.固定化的载体应与酶结合较为牢固。 B.载体不能与底物、产物等发生化学反应。 C.载体必须有一定的机械强度,防止因机械搅拌而破
碎。 ③位阻应该较小:尽可能不妨碍酶与底物的接近。 ④成本低:酶固定化的成本要尽可能的低。
优点:
(1)可提高稳定性。
(2)能回收,易与产物分离,可反复使用 。
一般只用于单酶或少数几种酶催化的反应。
2)吸附法 3)包埋法
例如:葡萄糖异构酶(白色链霉菌),是一 种胞内酶。在50--80℃加热10分钟,使菌 体自溶作用的酶失活,而葡萄糖异构酶仍然 保持活性,长期使用酶活力不减少。
吸附法 包埋法
微生物细胞 植物细胞 动物细胞
吸附力较弱 ,细胞易脱 落
实验: 2.4%左右的卡拉胶 ,70 ℃溶解, 再冷却到
3.固定化原生质体
意义: (1)固定化原生质体去除了细胞壁的扩散障 碍,有利于氧的传递,营养成分的吸收和 胞内产物的分泌。 (2)原生质体不稳定,容易破裂,固定化后 ,由于载体的保护作用,稳定性提高。
二、固定化方法
(一)酶的固定化方法 固定化方法
吸附法 共价偶联法 交联法 包埋法
物理
离子交
吸附法 换吸附
而固定化后, 70℃,15分钟,有>80%活 性。
(三)酶的最适பைடு நூலகம்度
最适温度与酶稳定性有关。 多数酶固定化后热稳定性上升,最适温度 也上升(有例外)。
(四)酶的最适pH
带负电荷载体 :最适pH 向碱性偏移。 带正电荷载体 :最适pH 向酸性偏移。
(五)酶的动力学特征
固定化酶的表观米氏常数Km随载体的带电 性能变化。
42℃, +10%左右的细菌菌体(预热到42℃)
迅速混合均匀
4 ℃冰箱放置大约30min
取出后切成3×3mm的小颗粒
四 原生质体的固定化方法
一般采用网格包埋法(即凝胶包埋法) 。常用凝胶:琼脂凝胶,海藻酸钙凝胶,角 叉菜胶和光交联树脂。 注意:一般要加渗透压稳定剂,以防止原生 质体破裂。
第二节 固定化酶和固定化细胞 的性质与表征
合成凝胶 聚丙烯酰胺、光 交联树脂
温和 聚合反应
不变
差
部分失活 高
海藻酸钙凝胶包埋法: 滴至
海藻酸钠溶液+E (or cell) CaCl2 溶液中
角叉菜胶包埋法: 滴至
角叉菜胶+E (or cell)
KCl 溶液中
IE(or IC) IE (or IC)
聚丙烯酰胺凝胶包埋法: AP
Acr+ Bis+E (or cell) TEMED
IE (or IC)
2)微囊型包埋法 (microencapsulation) 又称半透膜包埋法
将一定量酶液包在半透性的高分子微孔 膜内 。
半透膜:直径几十微米到几百微米,厚 约25nm。
半透膜孔径<酶分子孔径,小于半透膜 孔径的小分子底物和产物可以自由进出 ,被称为“人工细胞”。
与网格型包埋法相比,微囊型包埋法的优点:
• 固定化细胞意义:用完整的细胞作为生物催化剂, 以充分有效地利用生物细胞内的特定酶或多酶系统 。
优点
①省去对酶的提取过程,使酶的损失和生产 成本降到最低程度;
②可以利用细胞的多酶系统直接生产有价值 的产物。
第一节 酶和细胞的固定化
一、固定化酶和细胞的定义及特点 二、固定化方法 三 细胞的固定化方法
固定化酶与固定化细胞
2020年4月24日星期五
本章讲授
①固定化生物催化剂的概念以及吸附法、包 埋法、共价结合法、无载体固定化酶的基 本技术和原理;
②细胞固定化的基本技术和原理; ③简要介绍固定化酶基本性质的影响及辅因
子的固定化方法和辅酶的再生体系。
游离酶的缺点:
1.酶是蛋白质,稳定性差(热、酸碱、有 机溶剂对其有影响)。 2.不能回收,使用成本高。 3.酶在游离体系中更容易自水解 4.分离纯化困难,也使产物中混杂酶蛋白
(一)酶的活性 :
通常低于天然酶(有例外)。
(二)酶的稳定性
酶的耐热性、对变性剂、抑制剂、蛋 白酶的抵抗力增加。
可能的原因:
①固定化增加了酶活性构象的牢固程度, 可防止酶分子伸展变形;
②抑制酶的自身降解。 ③固定化部分阻挡了外界不利因素对酶
的侵袭。
如:氨基酰化酶,
70℃,15分钟,酶失去活性。
三 细胞的固定化方法
• 1.固定化细胞的分类 • 2. 固定化方法
1.固定化细胞的分类
分类方式 固定化细胞 分类方式