CA-MA基因的克隆及其突变体的构建

CA-MA基因的克隆及其突变体的构建1

冯惟萍，韩跃武

兰州大学基础医学院生物化学与分子生物学研究所，兰州（730000）

E-mail: fengwp05@

摘要：目的 构建 CA-MA 杂合肽基因的克隆载体，用反向 PCR 定点突变法构建其突变体。方法 构建 CA-MA 杂合肽重组克隆载体，采用 PCR 体外定点突变技术,设计一对方向相反的引物,其中一个引物引入突变点，应用高保真的 Polybest DNA 多聚酶进行重组克隆质粒 pUC-18–CA-MA 的 PCR 扩增,使 CA-MA 杂合肽第 16 位密码子由 AGT 变为 TGG ,将扩增片段自身连接，构建 CA-MA 杂合肽突变重组克隆质粒。结果 DNA 测序结果表明在预期位点发生突变。结论 CA-MA 杂合肽基因的克隆载体及其突变体成功构建。

关键词：CA-MA；杂合肽；聚合酶链反应；定点突变

中图分类号：Q786

0. 引言

天蚕素 A (1～8) - 蛙皮素(1～12) 杂合基因抗菌肽为天然抗菌肽 Cecropin A 第1～8 位氨基酸与蛙皮素第1～12 位氨基酸融合的抗菌肽片段,它既保持了天蚕素 A 的广谱抗菌活性，而且获得了蛙皮素的抗微生物活性[1]。CA-MA 杂合肽与其亲代肽比较,抗微生物活性明显提高，而其毒性显著降低[1]。国外有学者以 CA-MA 杂合肽作为模版肽设计了几种类似物，发现在抗菌、抗病毒方面，其类似物的活性均明显高于 CA-MA 杂合肽[2]。目前的研究均是用人工合成肽的方法来改造抗菌肽的结构以达到增强抗微生物的作用,但人工合成的方法成本过高。本文通过 PCR 体外定点突变技术，寻找合适的突变位点，成功构建突变体。

1. 材料与方法

1.1 材料

1. 1. 1 目的基因、质粒与菌株

CA-MA杂合肽基因片段由上海生物工程公司合成。克隆载体pUC-18、工程菌 E.coli DH5α均由本室保存。

1. 1. 2 主要生化试剂

限制性内切酶及其配套缓冲液、TaKaRa MutantBEST Kit 、质粒抽提试剂盒以及胶回收试剂盒均购自大连 TaKaRa 公司。DNA Marker 购自上海生工生物工程公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因片段的复性、酶切及回收纯化：参照文献[3] 进行。

1.2.2. 克隆载体pUC-18双酶切、去磷酸化及琼脂糖凝胶电泳胶回收：参照文献[3] 进行。

1.2.3克隆重组体的构建：

（1）、 CA-MA杂合肽基因与克隆载体pUC-18的连接：参照文献[4] 进行。

1本课题得到国家“863”计划项目(2006AA10A208-1-4 ) 资助。

（2）、感受态大肠杆菌DH5α细胞的制备、连接产物的转化及Amp和α互补筛选：参照文献[3]进行。

1.2.4 克隆重组体的鉴定：阳性重组体送上海生工测序鉴定。

1.2.5 定点突变

（1）、PCR 引物设计 按照突变引物设计原理,根据 CA-MA 杂合肽基因序列设计一对方向相反的引物 Primer 1 和Primer 2 , ,并利用 Primer Premier 5 引物设计软件对引物进行分析,确保引物内无发夹结构,引物间无二聚体形成,引物与模板其它部位无特异性结合。然后送交上海生工生物工程公司合成。 Primer 1 引入突变位点,即 CA-MA 第 16 位氨基酸密码由AGT 突变为 TGG 。

（2）、PCR 扩增 按照 PCR 体外定点突变法[5,6],用携带突变碱基的引物 Primer 1 和Primer 2 以 CA-MA 杂合肽重组克隆载体为模板进行扩增,反应成分为: Polybest DNA polymerase (5U/µL)，0.25 µL；10×Polybest buffer Ⅱ ,5 µL ；dNTP Mixture(各2.5mM) , 4 µL ; Primer 1 (20µM) 和Primer 2 (20µM) 各 1 µL ；pUC-18-CA-MA（1ng/µL）, 1µL; 加 ddH2O 至 50µL 。扩增条件为: 94 ℃ 30 sec, 55 ℃ 30 sec ，72 ℃ 5 min ，共进行 30 次循环,末次循环后置 72 ℃延伸 10 min。取 PCR 产物 100 µL ,做 1 % 琼脂糖凝胶电泳后,切取 3 kb 左右片段进行胶回收。

（3）、Blunting Kination 反应 DNA 片段 5 µL , 10× Blunting Kination buffer 2µL, Blunting Kination Enzyme Mix 1µL , 加 ddH2O 至 20µL ,37 ℃ 10min。将反应液用酚-氯仿抽提后乙醇沉淀。再用高效连接试剂Ligation Solution I 进行自身连接(环化反应)。

1.2.6 突变重组体的构建及鉴定

将自身连接后的突变重组质粒 pUC-18- W16-CA-MA 转化入E.coli DH5α感受态细胞中（方法同前）。阳性重组体送上海生工测序鉴定。

2. 结果

2.1 连接反应物的转化结果

蓝色菌落为不含重组质粒的阴性菌落，白色菌落为含重组质粒的阳性菌落。

图 1 pUC-18-CA-MA 重组体转化 E.coli DH5α

2. 2 PCR 扩增、质粒克隆

2. 2. 1 pUC-18-CA-MA 突变 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳

将 1.2.5 中 PCR 扩增产物行 1% 琼脂糖凝胶电泳, 扩增产物在 3000 bp 附近出现单一条带, 符合预期目的基因片段大小(图 2)。

图 2 突变 PCR 产物电泳

M: 15 000 bp DNA Marker

1～2：pUC-18- W16-CA-MA PCR

2. 2. 2 突变质粒克隆

自身连接转化后的质粒经抗氨苄青霉素筛选，获得阳性菌落，抽提突变质粒,做质粒酶切及 PCR 鉴定。将 1.2.6 中抽提的突变体质粒及双酶切后的突变体质粒行 1% 琼脂糖凝胶电泳。突变体质粒出现三条带，为超螺旋、线状、以及半开环三种不同状态，双酶切后的突变体质粒在 3000 bp 附近出现单一条带, 二者均符合预期目的基因片段大小（图3）。

图 3 突变质粒抽提及酶切电泳

M: 15 000 bp DNA Marker

1～2：pUC-18- W16-CA-MA

3：pUC-18- W16-CA-MA / EcoR Ⅰ＋ Sal Ⅰ

2. 2. 3 突变重组质粒的测序鉴定

测序结果证实, 重组质粒 pUC- W16-CA-MA 第 16 位氨基酸的碱基序列为 TGG ,其余碱基序列全部一致, 在预定点发生突变，达到预期构建目的（图4）