胞内游离Ca的测定方法

Pluronic F-127 (F127)美国Molecular Probes Inc.产品。

Ultima型共聚焦激光扫描显微镜为美国MERIDIAN Instruments Inc 产品。

1. 光源：Ultima型50Mw UV,200Mw Visible

2. 激发波长：351-364nm，488nm，514nm

3. 扫描系统：Ultima为台阶扫描，精度0.1um

目的：监测细胞胞浆中游离钙的动态变化

原理：正常细胞内游离钙浓度[Ca2┼]i为0.1 umol/L,胞外钙离子浓度为1.2-1.3mmol/L,相差达10000倍。胞外钙内流和胞内钙库动员形成的钙震荡(钙峰或钙波)在各种生理过程中起重要作用；病理状态下细胞内钙超负荷将造成一系列代谢紊乱,直至细胞坏死或凋亡；钙离子通道阻断剂已广泛应用于临床。显而易见,测定[Ca2┼]i在生理学、病理学和药理学等研究工作中均具有重要意义。Fluo-3/AM等钙离子荧光染料以脂溶性的乙酰甲氧基酯（AM酯）的形式导入细胞，在胞内水解酶的的作用下水解成游离酸，与钙离子的结合物在激发光作用下能产生特异的荧光。荧光信号的强弱随钙离子浓度的变化而变化。

100ug Fluo-3/AM 溶于100ul DMSO中，就是1ug/ul,1mg/ml,1g/L

方法：1.预先用二甲基亚砜(DMSO)将Fluo-3/AM配制为1mmol/L(1g/L)原液,-20oC避光保存。F127用DMSO配制成20%溶液(W/V)。用无血清无酚红培养液将Fluo-3/AM稀释成终浓度为10umol/L，并加入0.1％的Pluronic F-127备用。2.移去培养皿中的原培养液，用PBS液冲洗心肌细胞2遍，加入10umol/L 染料液1ml，置于37oC的CO2孵箱里避光温育30min。

3.将染色后的心肌细胞用PBS液冲洗3遍，加入1mlDMEM液后置于20倍光学显微镜观察区域及层面，用LSCM观察Fluo-3染色的细胞的某一层面的荧光图像。

4.启动LSCM，选择488nm氩离子激光，启动计算机，运行lasersharp2000软件，选择time-course程序，设置扫描间隔时间（30sec）、扫描次数（300次），开始扫描。

5.将数据输入excel进行整理、统计、分析。

一、细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)的测定

按经典方法，以钙离子敏感的荧光探针Fura-2/AM或Fluo-3/AM来检测细胞内[Ca2+]i。Fura-2的结构类似于四羧酸的Ca2+螯合剂EGTA，能以1：1的比例特异性地与Ca2+结合，与EGTA不同的是Fura-2可发出荧光，并且结合Ca2+后荧光特性有改变，Fura-2及其与Ca2+结合后的复合物的最大激发波长分别为380 nm和340 nm，这种变化可指示Ca2+的存在及其浓度。Fura-2为一极性很大的酸性化合物，不能进入细胞内，但在其负性基团部位结合上乙酰氧甲酯基后则成为Fura-2/AM。后者脂溶性很强，又消除了负电荷，容易通过细胞膜，随后被细胞内的非特异性酯酶水解掉分子中的酯基后又变为Fura-2，与胞浆中的游离Ca2+结合后即可被特定波长的紫外光(340 nm)激发产生荧光。并且，Fura-2与Ca2+解离容易，随着游离Ca2+的增加或减少，其荧光强度便随之变化。因此，Fura-2的荧光强度与[Ca2+]i呈比例关系，据此可以测定[Ca2+]i及其变化(Malgaroli, A., et al., 1987)。

Fluo-3/AM是继Fura-2/AM等之后研制的新一代Ca2+ 荧光指示剂，与Fura-2/AM类似，Fluo-3/AM进入细胞后，酯基被水解掉，Fluo-3与细胞内游离Ca2+ 结合，因而其荧光强度可以反映细胞内游离Ca2+的浓度。但优于Fura-2/AM 的是，Fluo-3与Ca2+结合时的荧光强度较未结合Ca2+的游离形式高40 ~ 100倍，避免了自发荧光的干扰，因而直接在单波长激发光下检测其荧光强度即可反映[Ca2+]i的变化。此外，Fluo-3与Ca2+亲和力低，易解离，适合测定细胞内Ca2+的快速、微量变化。Fluo-3 在可见光光谱激发，激发波长为488 nm，可避免紫外光对细胞的损伤(Greimers, R., et al., 1996)。Ca2+荧光探针用于检测[Ca2+]i的基本原理如图7.1所示。

图Ca2+荧光探针检测[Ca2+]i的基本原理

a，代表一个细胞模型；b，Ca2+荧光探针的负载；

c，Ca2+荧光探针去酯化；d，去酯化的Ca2+荧光探针与细胞质内游离Ca2+结合。

Fig. The mechanism for [Ca2+]i detection by fluorescent Ca2+ probe.

[Ca2+]i的检测方法根据文献(Pan, Z., et al., 2000)，并作适当的改进。具体过程如下：

1 Ca2+荧光探针负载

1. 以无菌D'-Hanks液清洗各处理细胞三次，加入适量的Fura-2/AM或

Fluo-3/AM(终浓度为4 µM)和Pluronic-F127(终浓度为0.05%)，避光，37℃

恒温轻轻振荡，孵育45 min。

2. 负载后的细胞以含0.2%牛血清白蛋白的Hanks液清洗两次，Hanks液清

洗一次，以充分洗去细胞外未负载的残余荧光染料。

3. 按上所述，向各实验组细胞中加入相应的孵育缓冲液，室温放置20 min，

按实验设计作相应检测。

2 Ca2+荧光强度的测定

2.1 荧光双波长分光光度计测定[Ca2+]i

1.Fura-2的荧光强度测定用日立F-3000型荧光双波长分光光度计进行。测

定条件为：激发光光栅5 nm，发射光光栅10 nm，测定温度为(37±1)℃。