“PapSEEK”一种子宫内膜癌和卵巢癌早筛新方法

Evaluation of liquid from the Papanicolaou test and other liquid biopsies for the detection of endometrial and ovarian

cancers

SCIENCE TRANSLATIONAL MEDICINE

妇科癌症筛查研究背景

●妇科三大癌症：子宫颈癌，子宫内膜癌，卵巢癌

●巴氏涂片（Pap test）可用于早期子宫颈癌筛查，显著降低致死率；但是子宫内膜癌和卵巢癌目前缺乏可靠的早期筛查方法

●目前子宫内膜癌的主要检测方法：阴道超声无法分清良性恶性；假阳性率高，50个检出阳性中只有一个是真阳性

●目前卵巢癌主要检测方法：蛋白标志物CA-125和阴道超声占卵巢癌90%的高级别恶性肿瘤很多由输卵管癌转移而来，不易发现；发现即为晚期，5年生存率低于30%

●迫切需要建立可靠的子宫内膜癌和卵巢癌早期筛查方法

本文提出：“PapSEEK”---妇科癌症早筛新方法

两种brush取样方法+外周血+两个参数分析

PapSEEK 方法流程

样本情况

体细胞突变检出方法

●3轮PCR、139对引物，扩增片段110-142 bp

●覆盖18个基因：AKT1, APC, BRAF, CDKN2A, CTNNB1, EGFR, FBXW7,

FGFR2, KRAS, MAPK1, NRAS, PIK3CA, PIK3R1, POLE, PPP2R1A, PTEN, RNF43, and TP53.

●覆盖9392个位点

●UID设计：14个随机排列的碱基

●某个突变有包含同一个UID的大于90%的reads支持即为真

●过滤标准：

一. 突变需满足以下两条标准之一：

1.在COSMIC中有记录

2.预测为抑癌基因的失活突变（无义突变，读码框外的插入或缺失突变，经典的剪切位点突变）

二. 排除掉同义突变（终止子突变除外）和内含子突变（剪切位点突变除外）。

三. 若检出的突变不能与hg39有唯一比对（read能比对上多个位置）则排除。方法参考文献：I. Kinde, J. Wu, N. Papadopoulos, K. W. Kinzler, B. Vogelstein, Detection and quantification of rare mutations with massively parallel sequencing. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 9530–9535 (2011).

非整倍体变异的检出方法

●对每个样本用一对引物，扩增基因组上~38.000 loci of LINES。其中一个引物上包含UID序列。

●用Within-Sample AneupLoidy DetectiOn (WALDO)软件分析单个染色体臂增加或缺失，以及39个染色体臂上的等位基因不平衡特征。

●WALDO整合了一个支持向量机（SVM）来区分非整倍体和整倍体的样本。

●SVM是由3150个合成的低肿瘤含量的非整倍体样本和677个整倍体外周血白细胞样本训练而来。

●若SVM区分的分数超过给定值或检出7号和8号染色体臂的增加，则此样本定义为检出阳性。因为7号和8号染色体的臂增加是子宫内膜癌和卵巢癌的常见分子指征。

方法参考文献：I. Kinde, N. Papadopoulos, K. W. Kinzler, B. V ogelstein, F AST-SeqS: A simple and efficient method for the detection of aneuploidy by massively parallel sequencing. PLOS ONE 7,

e41162 (2012).

实验结果

1. Pap brush 样本的体细胞突变和非整倍体检出情况

PapSEEK法（Combined assay）：

●提高子宫内膜癌检出率至81%（78%早期& 92%晚期）

●常见突变基因：PTEN (64%), TP53 (41%), PIK3CA (31%), PIK3R1 (29%), CTNNB1 (21%), KRAS (18%), FGFR2(11%), POLE (9%), APC (9%), FBXW7 (8%), RNF43 (7%), and PPP2R1A.

●提高卵巢癌检出率至33%（34%早期& 33%晚期）

●常见突变基因：TP53 (74%)

2. Tao brush 样本的体细胞突变和非整倍体检出情况

PapSEEK法（Combined assay）：

检出常见基因突变：PTEN (63%), TP53 (42%), PIK3CA (36%), PIK3R1 (20%), KRAS (17%), CTNNB1 (15%), FGFR2 (15%), RNF43 (11%), PPP2R1A (7%), POLE (7%), and FBXW7 (6%)

PapSEEK 法：体细胞突变和非整倍体两指标相结合可以提高阳性检出率!

3. 两种取样方法在两种癌症中得到的检出率比较

●Tao brush样本阳性检出率均高于Pap brush样本，更优越！

●子宫内膜癌早期检出率低于晚期，卵巢癌早期晚期检出率相当

可能的原因：

有些卵巢癌发生于输卵管，输卵管的癌细胞可进入宫腔被PapSEEK检测到；卵巢癌晚期，输卵管通常已被破坏，病灶的癌细胞不易进入宫腔。针对这种情况，测血浆DNA会更有益。

●采自同一病人的Pap brush样本&Tao brush样本PapSEEK阳性检出率比较：

103例子宫内膜癌：82% & 91%，42例卵巢癌：17% & 45%，说明Tao brush取样法更好！

4. 由于卵巢癌brush样本检出结果不理想，检测血浆cfDNA验证

①83例有Pap brush样本的患者取外周血

②引物覆盖16个靶基因的1933个不同区域