双水相萃取.
双水相萃取解析
➢ 一般采用室温操作： 成相系统聚合物PEG对蛋白质有稳定作用，常温下蛋 白质不会发生变性； 常温下溶液粘度较低， 容易相分离； 常温操作节省冷却费用。
4.双水相萃取技术的发展
（1）历史：
➢ 早在1896年，Beijerinck发现，当明胶与琼脂或明胶与 可溶性淀粉溶液相混时，得到一个混浊不透明的溶液，随 之分为两相，上相富含明胶，下相富含琼脂（或淀粉）， 这种现象被称为聚合物的不相溶性（incompatibility）； ➢ 20世纪60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A及同事 最先提出了双水相萃取技术； ➢ 1979年，西德的Kula M R等人首次将ATPE应用于生物产 品分离；
➢大量研究表明：生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统 间的各种相互作用，主要有静电作用、疏水作用和亲和作用等， 其分配系数可为各种相互作用之和。
ln m ln me ln mh ln ml
①静电作用：两相系统中若有带电溶质存在，会ห้องสมุดไป่ตู้大分子在两 相间的分配系数产生影响。（图5-15） Donnan Potential:当大分子或粒子带有静电荷时，在带有电荷 分配不相等时，就会在两相间产生电位差，称为道南电位。 ②疏水作用：某些大分子物质表面具有疏水区，溶质的表面疏 水性会对其在两相间的分配系数产生影响。
3.影响双水相分配的主要因素
高聚物的相对分子质量 高聚物的浓度 盐的种类和浓度 PH值 温度
（1）高聚物的相对分子质量：
➢在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的相对分子质 量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如细 胞或细胞碎片和细胞器，将更多地分配于该相。
以PEG-Dextran体系为例，↓Dextran→K↓ ↓PEG→K↑（表5-4）
第五节_双水相萃取
二、双水相萃取的原理
• 双水相萃取的原理 • 是生物物质在双水相体系中的选择性分配，当物 质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用 和各种作用力（如憎水键、氢键和离子键等）的 存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不 同，即分配系数不同。
三、影响分配系数因素
１、聚合物：不同聚合物的水相系统显示出不同 的疏水性，同一聚合物的疏水性随分子量的增加 而增加。 ２、pH：主要针对蛋白质及酶的稳定性。 ３、无机盐：离子环境影响溶质（蛋白质）在两 相系统中的分配。 ４、温度：分配系数对温度的变化不敏感，所以 室温操作即可。
双水相的形成
将两种不同的水溶到一定值，体系会自然的分成互不相溶的两相，这
就是双水相体系。这种含有不同聚合物分子的溶液发生分 相的现象叫聚合物的不相容性。
形成原因：由于高聚物之间的不相溶性，即高聚物分子 的空间阻碍作用，相互无法渗透，不能形成均一相，从而 具有分离倾向，在一定条件下即可分为二相。
常用的双水相体系
高聚物/高聚物体系：聚乙二醇(简称PEG) / 葡聚糖(简 称Dextran) 高聚物/无机盐体系：硫酸盐体系。常见的高聚物/ 无机 盐体系为: PEG/ 硫酸盐或磷酸盐体系。
PEG = 聚已二醇(polyethylene glycol) Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖(dextran)
第五节 双水相萃取
(Aqueous two-phase extraction, ATPE)
定义：利用物质在互不相溶的两水相间分配系 数的差异来进行萃取的方法。
一、双水相的形成 二、双水相萃取的原理 三、影响分配系数因素 四、双水相萃取的优点 五、 双水相萃取的应用
一、双水相的形成
1896年Beijerinck发现， 当明胶与琼脂或明胶与可 溶性淀粉溶液相混时，得 到一个混浊不透明的溶液， 随之分为两相，上相富含 明胶，下相富含琼脂（或 淀粉）。
双水相萃取全解
聚乙二醇
非离子型聚合物/ 非离子型聚 合物
聚丙二醇
聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
高分子电解质/非离子型聚合物
羧甲基纤维素钠
聚乙二醇
高分子电解质/高分子电解质
聚合物/ 低分子量化合物
葡聚糖硫酸钠
葡聚糖
羧甲基纤维素钠
丙醇
磷酸钾
聚合物/ 无机盐 聚乙二醇 硫酸铵
双水相的形成
在聚合物∕盐或聚合物∕聚合物系统混合时， 会出现两个不相混溶的水相
②聚合物∕无机盐双水相
某些聚合物溶液和一些无机盐溶液 相混时，在一定浓度下，由于盐析作 用，也会形成两相，即聚合物/ 无机 盐双水相体系，常用的无机盐有磷酸 盐和硫酸盐。除高聚物、无机盐外， 能形成双水相体系的物质还有高分子 电解质、低分子量化合物。
各种类型的双水相体系
类 型 形成上相的聚合物 形成下相的聚合物 葡聚糖
影响双水相萃取平衡的主要因素有： 组成双水相体系的高聚物类型、高聚物 的平均分子量和分子量分布、高聚物的 浓度、成相盐和非成相盐的种类、盐的 离子浓度、pH值、温度等。
1）聚合物的类型
不同聚合物的水相系统显示出不同的疏水 性，聚合物的疏水性按下列次序递增：葡萄 糖硫酸盐糖＜葡萄糖＜羟丙基葡聚糖＜甲基 纤维素＜聚乙二醇＜聚丙三醇，这种疏水性 的差异对目的产物的作用是重要的。
缺点：
• 成相聚合物的成本较高， 且高聚物回收困难。 • 水溶性高聚物大多数粘度 较大，不易定量控制。 • 易乳化，相分离时间较长。 • 影响因素复杂。
3、双水相萃取原理
(1) 分配系数
双水相萃取与一般的水-有机物萃取的 原理相似, 都是依据物质在两相间的选择 性分配。当萃取体系的性质不同, 物质进 入双水相体系后, 由于分子间的范德华力、 疏水作用、分子间的氢键、分子与分子之 间电荷的作用, 目标物质在上、下相中的 浓度不同, 从而达到分离的目的。
第五章 双水相萃取
• 盐离子 • pH值 • 温度
五、双水相萃取工艺流程
六、双水相萃取应用
1）蛋白酶的提取、纯化 2）核酸的提取、纯化 3）细胞调节生长因子的提取：β—干扰素、EPO等 4）病毒的提取、纯化 5）生物活性物质的分析检测
七、双水相萃取的研究进展
1. 2. 廉价双水相体系的研究开发 双水相萃取与其它分离技术的结合
5.Βιβλιοθήκη 6.第五章 双水相萃取
（Aqueous Two-phase Extraction）
一、概述
1、定义——利用生物物质在
互不相溶的两水相间分配系数的 差异进行分离的过程
PEG——聚乙二醇 Dextran(DEX)——葡聚糖
图1 PEG/DEX形成的双水相的组成
2、双水相体系
1) 双水相体系的形成——高聚物分子间的作用力
思考题
1. 2. 3. 4. 何谓双水相萃取？ 双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两 种？ 为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分 离？ 影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，pH 是如何影响双水相萃取的？ 用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目 标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分 布在下相，为什么？ 何谓双水相亲和萃取？
• 作用力为斥力：形成双水相体系 • 作用力为引力：形成两相，其中一相为两高聚物相，一相 为水相 • 作用力没有强烈的引力或斥力：完全互溶，形成均一相
2)双水相体系的种类
–
–
两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）
其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）
–
–
两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）
双水相萃取
各种双水相系统
聚合物1 聚合物1 聚丙二醇 聚合物2 聚合物2或盐 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 甲基聚丙二醇，聚乙二醇，聚乙烯醇， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖， 聚乙烯吡咯烷酮，羟丙基葡聚糖，葡聚 糖 聚乙烯醇，葡聚糖，聚蔗糖 聚乙烯醇，葡聚糖， 羟甲基葡聚糖，葡聚糖 羟甲基葡聚糖， 葡聚糖 葡聚糖 葡聚糖 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠，酒 硫酸镁，硫酸铵，硫酸钠，甲酸钠， 石酸钾钠， 石酸钾钠，磷酸钾
4、电化学分配 、 i、盐的种类及浓度 、
pH 升高, H2PO4- HPO42- PO43在PEG / K2HPO4 系统使带负电蛋白 蛋白有较高的K。 蛋白
ii、 pH 值的影响 改变两相的电位差 如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大， 则蛋白质在两相中分配越不均匀。 pH 值的变化也会导致组成体系的物质电 性发生变化，也会使被分离物质的电荷发 生改变，从而影响分配的进行。
6、双水相萃取的工艺流程 、 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取; 工艺流程主要由三部分构成：目的产物的萃取 PEG的循 的循 无机盐的循环。 环; 无机盐的循环。
一、目的产物的萃取： 目的产物的萃取： 第一步，匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合，然后进 和无机盐在萃取器中混合， 第一步，匀浆液与 和无机盐在萃取器中混合 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（ 入分离器分相。一般使目标蛋白质分配到上相（PEG相）， 相 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（ 而细胞碎片、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相（富盐 相） 。 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系， 第二步，在上相中加盐，形成新的双水相体系，将目标蛋白 质转入富盐相，从而将蛋白质与PEG分离，以利于使用超 分离， 质转入富盐相，从而将蛋白质与 分离 滤或透析将PEG回收利用。 回收利用。 滤或透析将 回收利用 的回收循环： 二、PEG的回收循环： 的回收循环 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG; ①加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 相通过离子交换树脂， ②将PEG相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 相通过离子交换树脂 用洗脱剂先洗去PEG，再 ， 洗出蛋白质。 洗出蛋白质。 无机盐的循环： 三、无机盐的循环： 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 冷却，结晶，以离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、 膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。 相的盐。 膜分离法回收盐类或除去 相的盐
双水相萃取的名词解释
双水相萃取的名词解释双水相萃取是萃取的一种方法。
两种水溶性不同的聚合物，或一种聚合物和无机盐的混合溶液，在一定的浓度下，其体系会自然分成互不相溶的两相。
当被分离物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷间作用和各种作用力等的影响，被分离物质在两相间的分配系数不同，导致其在上下相的浓度不同，即可达到分离的目的。
早在1896年人们就已观察到，明胶与琼脂，或明胶与可溶性淀粉溶液混合时，会得到一种不透明的混合溶液。
静置后可分为两相，上相中含有大部分的明胶，下相中含有大部分琼脂（或淀粉），这种现象称为聚合物的不相容性，从而产生了双水相。
双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比。
各种物质的K值不同，例如各种类型的细胞粒子、噬菌体等分配系数都大于100或小于0.01，酶、蛋白质等生物大分子的分配系数在0.1~10之间，而小分子盐的分配系数在1.0左右。
因而，双水相体系对生物物质的分配具有很大的选择性。
双水相的优势ATPE作为一种新型的分离技术，对生物物质、天然产物、抗生素等的提取、纯化表现出以下优势：(1)含水量高(70％--90％)，在接近生理环境的体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)可以直接从含有菌体的发酵液和培养液中提取所需的蛋白质（或者酶），还能不经过破碎直接提取细胞内酶，省略了破碎或过滤等步骤；(3)分相时间短，自然分相时间一般为5min～15 min；(4)界面张力小(10-7～10-4mN／m)，有助于两相之间的质量传递，界面与试管壁形成的接触角几乎是直角；(5)不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发物质，对人体无害；(6)大量杂质可与固体物质一同除去；(7)易于工艺放大和连续操作，与后续提纯工序可直接相连接，无需进行特殊处理；(8)操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行；(9)亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的选择性。
双水相萃取
操作步骤
一、重点 双水相萃取放大容易：一般10ml离心管的实验结果可直接放大到工业规模。具体实验步骤： 1、配制一系列不同浓度、pH及离子强度的双水相，每个双水相改变一个参数。 2、加入料液，再加水使整个系统质量达到5~10g。离心管封口后充分混合。 3、1800－2000g下离心3－5min，使两相完全分离。 4、用吸管或移液管将上相和下相分别吸出，测定上、下相中目标产物的浓度或生物活性，计算分配系数。 5、上、下两相中目标产物的总量应与加入量对比，以检验是否存在沉淀或界面吸附现象，并可确认浓度或活 性测定中产生的系统误差。 6、分析目标产物的收率和纯化倍数，确定最佳双水相系统。 二、特点： 1、含水量高（70%～90%），适宜提取水溶性的蛋白质、酶等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活。 2、不存在有机溶剂残留问题。3、易于放大，各种参数可按比例放大而产物收率并不降低。
可形成双水相的双聚合物体系很多，如聚乙二醇（PEG）/葡聚糖（Dx）,聚丙二醇/聚乙二醇，甲基纤维素/ 葡聚糖。双水相萃取中采用的双聚合物系统是PEG/Dx，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dx。另外，聚合物与 无机盐的混合溶液也可以形成双水相，例如，PEG/磷酸钾（KPi）、PEG/磷酸铵、PEG/硫酸钠等常用于双水相萃 取。PEG/无机盐系统的上相富含PEG,下相富含无机盐。
原理
某些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成 双水相系统（aqueous two-phase system,ATPS）。利用亲水性高分子聚合物的水溶液可形成双水相的性质， Albertsson于20世纪50年代后期开发了双水相萃取法（aqueous two-phase extraction），又称双水相分配法。 20世纪70年代,科学家又发展了双水相萃取在生物分离过程中的应用，为蛋白质特别是胞内蛋白质的分离和纯化 开辟了新的途径。
双水相萃取技术
三、双水相萃取3.1 双水相萃取的原理及特点3.1.1 双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
3.1.2 双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点：(1)含水量高(70%~90%)，是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；(2)分相时间短，自然分相时间一般为5~15min；(3)界面张力小(10-7~10-4mN/m)，有助于强化相际间的质量传递；(4)不存在有机溶剂残留问题；(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；(6)易于工程放大和连续操作。
由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
3.2 双水相萃取在分离和提取各种蛋白质(酶)上的应用用聚乙二醇(PEG)/羟丙基淀粉酶(Reppal PEG)体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶(PGK)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。
在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。
在上清液中加入PEG4000(12%)-ReppalPES(40%)，PGK在上相、GAPGH在下相的收率均在80%以上。
萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。
用PEG/(NH4)2SO4双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取α-淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000(15%)-(NH4)2SO4(20%)，pH=8，α-淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。
双水相萃取技术
三、双水相萃取3.1双水相萃取的原理及特点3.1.1双水相萃取的原理双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。
当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力（如憎水键、氢键和离子键等）的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同。
分配系数K等于物质在两相的浓度比，由于各种物质的K值不同，可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
3.1.2双水相萃取的特点双水相体系萃取具有如下特点：（1）含水量高（70%〜90%），是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取，不会引起生物活性物质失活或变性；（2）分相时间短，自然分相时间一般为5~15min ；⑶界面张力小（10-7〜10-4mN/m），有助于强化相际间的质量传递；⑷不存在有机溶剂残留问题；（5）大量杂质能与所有固体物质一同除去，使分离过程更经济；（6）易于工程放大和连续操作。
由于双水相萃取具有上述优点，因此，被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。
3.2双水相萃取在分离和提取各种蛋白质（酶）上的应用用聚乙二醇（PEG）/羟丙基淀粉酶（Reppal PEG）体系经两步法可从黄豆中分离磷酸甘油酸激酶（PGK）和磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。
在黄豆匀浆中加入PEG4000，可絮凝细胞碎片及大部分杂蛋白。
在上清液中加入PEG4000（12%）-ReppalPES（40%），PGK在上相、GAPGH 在下相的收率均在80%以上。
萃取过程的放大采用离心倾析机连续处理匀浆液，用离心萃取器完成双水相体系的两相分离，整个工艺具有处理量大、接触时间短、酶收率高的特点。
用PEG/（NH4）2SO4 双水相体系，经一次萃取从A-淀粉酶发酵液中分离提取a淀粉酶和蛋白酶，萃取最适宜条件为PEG1000（15%）-（NH4）2S04（20%），pH=8，a淀粉酶收率为90%，分配系数为19.6，蛋白酶的分离系数高达15.1。
双水相萃取
芩苷进行分离纯化, 结果表明,双水相中PEG 的分
子量、PEG浓度、K2HPO 4 的浓度、 pH值及温度
等因素都对双水相体系的相比、分配系数及黄芩
苷的收率有一定影响,在最佳分离条件下, 黄芩苷
最大的分配系数可达 29, 最大收率9.6%，且其大
部分被分配在PEG相(上相)中。同时选择合适的相
体系和添加适量的无机盐, 可有效地增加黄岑甙
双水相萃取
——在天然产物分离中的应用
主要论述内容
一、双水相萃取概述 二、影响双水相萃取平衡的主要因素 三、双水相萃取法在天然产物纯化中的
应用 四、双水相萃取黄酮类化合物研究进展 五、双水相萃取的发展方向 六、双水相萃取存在的问题及展望
双水相萃取简介
双水相萃取 （aqueous two - phase extraction , ATPE） 技术始于 20 世纪 60 年代。1956 年瑞典伦德 大学的Albertsson 发现 双水相体系, 国内自20 世纪 80 年代起也开展 了双水相萃取技术研究。 该技术在我国虽然只有20 多年的历史,但由于其条 件温和 ,容易放大 ,可连 续操作 , 目前已成功用 于中药有效成分、抗生素 和蛋白质等生物产品的分 离和纯化。
影响双水相萃取平衡的主要因素
• 高聚物的平均分子量和分子量分布 • 高聚物的浓度 • 成相盐和非成相盐的种类 • 盐的离子浓度 • pH值 • 温度
分子量
• 同一聚合物的疏水性随分子量的增加而增 加，这是由于分子链的长度增加，其所包 含的羟基减少。两相亲水差距越大，其大 小的选择性依赖于萃取过程的目的和方向。 对于PEG 聚合物，若想在上相收率较高， 应降低平均分子量，若想在下相收率较高， 则增加平均分子量
双水相萃取法
lnm=-Mλ/RT
m-分配系数；M-溶质的相对分子质量；λ-与溶质表面性质和 成相系统有关的常数; R-气体常数，J/(mo1．K)；T-绝对温度， K。
因此，溶质的分配系数的对数与相对分子质量之 间呈线性关系，在同一个双水相系统中，若λ>0，不 同溶质的分配系数随相对分子质量的增大而减小。同 一溶质的分配系数随双水相系统的不同而改变，这是 因为式中的λ随双水相系统而异。
图a和b分别为PEG/Dx和PEG/KPi系统的典型相图 a
系线 两相区 双节线 双节线
b
两相区 系线
均相区
均相区
均相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而 体积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
上下相组成分别为T和B,
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长， 两相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中的 分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
在生物分子回收和纯化以后，怎样从含有目标产物残余物的 水溶液中回收聚合物或盐就成为一个重要的问题。例如从 1000kg面包酵母中萃取反丁烯二酸酶需要用680kgPEG-1550和 533kgK3PO4，若不回收利用，化学品的消耗会使生产成本大幅 度上升。如果产品是蛋白质，并且分配在盐相，则盐可以在 错流过程操作方法下，用超滤或渗析膜过滤回收。如果蛋白 质积聚在聚乙二酵中，可以通过加入盐来精制，加入的盐导 致蛋白质在盐相中重新分配。PEG的分离同样可以用膜分离来 实现，即用选择性孔径大小的半透膜来截留蛋白质，同时排 除PEG进行回收。 另一种力法是通过盐析或使用水-可混溶性 的溶剂来沉淀蛋白质，但是固体(产物)的去除被存在的PEG阻 碍。也可使用离子交换和吸附，它们是通过蛋白质与基质的 选择性相互作用进行的。然而，当黏性聚合物溶液通过柱被 处理的时候，会出现高的压力降。在上述的三种方法中，膜 分离是分离和浓缩被纯化的蛋白质并同步去除聚合物的最佳 方法。
双水相萃取
双水相萃取
双水相萃取技术是一种新型的有机合成技术，它可以将一种有机物质从另一种有机物质中分离出来，这可以大大地提高有机化学反应的效率。
双水相萃取是以水为介质的组合相萃取，其特点是有机溶剂和水在反应容器中共存，利用不同的pH值将两种有机物质分别提取到两个水相中去。
双水相萃取这种技术可以用于有机合成中，当反应容器中有多种不同有机物质时，利用双水相萃取可以将其中一种有机物质从另一种有机物质中提取出来，从而可以有效地减少对反应物的有害影响，提高反应的效率。
同时，双水相萃取还可以用于多相反应的分离，如有机-水-有机-水多相反应、有机-水-水有机反应等，这种技术可以将有机物和水的相，利用不同的pH值将其分离出来，提取各自的产物。
双水相萃取技术也可以用于重金属元素的提取和富集，将有机物中含有重金属元素的物质提取出来，提高重金属元素的度。
双水相萃取技术可以用来将有机物中含有大量盐和其他有机物的物质，利用pH值分别提取出来，从而大大改善污染现象。
双水相萃取技术还可以将有机物质中含有有害物质的有机物从另一种有机物中提取出来，减少有害物质对人体的危害。
双水相萃取技术的优点不仅体现在反应效率的提高，而且还体现在它的环境友好性。
因为双水相萃取技术整个反应过程中所使用的有机溶剂是水，那么在完成反应后，所产生的废物也是水，这就避免了对环境的污染，更有利于保护自然环境。
总之，双水相萃取技术可以有效地实现有机物质从另一种物质中的分离和提取，节省了大量的时间和费用，可以有效地提高反应的效率，也符合生态环境的发展趋势。
因此，双水相萃取技术在有机化学领域有着重要的应用价值，并将在未来发挥更大作用。
双水相萃取
（2）双水相体系形成的原因：
聚合物的不相溶性（空间位阻）
聚合物的不相溶性：各个聚合物分子，都倾向于在其
周围有形状、大小和极性相同的分子，同时，由于不同
类型分子间的斥力大于同它们的亲水性有关的相互吸引 力，因此聚合物发生分离，形成两个不同的相。
对于某些聚合物溶液与一些无机盐溶液相混时，只要
浓度达到一定范围时，体系形成双水相的机理尚不清楚。
这种影响与蛋白质相对分子质量也存在关系，相对分子质量越
大，影响也随之增大。
（2）高聚物的浓度：
成相物质的总浓度越高，蛋白质越容易分配于其中的某一相；
而对于细胞等颗粒来说，在临界点附近细胞大多分配于其中的
某一相。
（3）盐的种类和浓度：
盐的种类和浓度对分配系数的影响，主要反映在相间电位和
蛋白质的疏水性差异上，这是由于当双水相系统中存在这些
加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收 PEG；B)将 PEG
相通过离子交换树脂，用洗脱剂先洗去 PEG，再洗出蛋 白质。 无机盐的循环：将含无机盐相冷却，结晶，然后用离 心机分离收集。除此之外还可用电渗析法、膜分离法回
收盐类或除去 PEG相的盐。
（3）双水相萃取在药物分离中的应用
①细胞匀浆液中 蛋白质的纯化
液膜萃取
反胶团萃取
内容提纲：
1.双水相体系 2.双水相萃取的基本原理 3.影响双水相分配的主要因素
4.双水相萃取技术的发展
5.双水相萃取操作及应用
1.双水相体系
（1）双水相系统：一定浓度的两种水溶性高聚物或一
种高聚物与盐类在水中能形成两层互不相溶的匀相水溶液， 这样的水相系统称为双水相系统。
5%PEG6000 上层组成：2%Dextran500 93%水 3%PEG6000 下层组成：7%Dextran500 90%水
双水相萃取
成本较高。即使水溶性聚合物和盐可
以回收再用； 选择性较低，分离纯化倍数低，一般 只适用于粗分离；
业应用；
第 4 章
目前的一些应用
1. 提取酶和蛋白质； 2. 进行萃取性生物转化 ； 3. 食品工业中用来从酸水解产物中提取二肽、 氨基酸、核苷酸等物质 ； 4. 萃取细胞、细胞器、膜等粒子；
第 3 章
优点与缺点
双水相萃取法的特点：能够保留产物的活性；整个操作可以连续化；
在除去细胞或细胞碎片时，还可以纯化蛋白质2～5倍，与传统的过滤法和
离心法相比，收率更高；
优点
操作条件温和，在常温常压下进行；
缺点
含较高浓度的水溶性聚合物和盐，会
带到产物中，需要辅助处理方法；
两相的界面张力小，易分散两相的
盐的种类和浓度 2
各相要保持电中性，使得带电物质 在两相移动分配；盐的种类和添加 其他种类的盐有助于提高选择性；
3 体系pH值
pH会影响蛋白质中可以离解基团 的离解度，改变所带电荷和分配系 数；pH也影响磷酸盐的离解程度；
温度 4
温度影响物质的分配系数。但一般 来说，影响很小，1～2度的温度 变化不影响目标产物的萃取分离；
双水相萃取
(Aqueous Two Phase Extraction)
汇报人： 日 期： xxx 2016-4-20
目录
Contents
01 - 双水相萃取技术 02 - 分离原理 03 - 优点与缺点 04 - 目前应用
第 1 章
什么是双水相萃取技术？
双水相体系
两种水溶性聚合物的水溶液；
相图
杠杆规则：系线上各点均为组
第五章 双水相萃取
七、双水相萃取的研究进展
1. 2. 廉价双水相体系的研究开发 双水相萃取与其它分离技术的结合
思考题
1. 2. 3. 4. 何谓双水相萃取？ 双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两 种？ 为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分 离？ 影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，pH 是如何影响双水相萃取的？ 用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目 标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分 布在下相，为什么？ 何谓双水相亲和萃取？
第五章双水相萃取aqueoustwophaseextraction一概述1定义利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程pegdex形成的双水相的组成peg聚乙二醇dextrandex葡聚糖2双水相体系作用力没有强烈的引力或斥力
第五章 双水相萃取
（Aqueous Two-phase Extraction）
5.
6.
2)双水相体系的种类
–
–
两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）
其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）
–
–
两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）
其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）
二、双水相系统的相图
三、双水相萃取的分配平衡公式
c1 1 A Z（U 1 U 2） exp c2 KT
一、概述
1、定义——利用生物物质在
互EG——聚乙二醇 Dextran(DEX)——葡聚糖
图1 PEG/DEX形成的双水相的组成
生物分工程双水相萃取
回收率(Y)
相比
10g体系
6.97±0.20
89.23%±0.0028
1.18
200g体系
6.88±0.33
89.62%±0.0044
1.24
500g体系
6.82±0.23
90.33%±0.0036
1.36
1000g体系
6.81±0.35
89.96%±0.0024
1.32
表2.4 体系放大过程中相组成的变化
(3) 回收率高 提纯倍数可达2-20倍, 如体系选择适当,回 收率可达80%-90%以上,且分离速度快。
三、双水相体系的应用
✓ 应用：在生物化学、细胞生 物学、生物化工等有机物分 离提纯方面得到了较为广泛 的应用，如：分离提纯蛋白 质、生物酶、菌体、细胞、 氨基酸、抗生素以及亲水性 生物大分子等。
85.1
3 9.99 10.26 0.031 322.3 93.1
93.8
95.1
99.8
85.9
表4. 2 在3000 g体系中双水相直接萃取发酵液
No. K2,3-BD Kacetoin Kglucose
KS
Y2,3-BD(%) Yacetoin(%) Rglucose(%) Rcells(%) R protein(%)
双水相系统的类型
（1）高聚物-高聚物体系，以聚乙二醇PEG/ Dextran（葡聚糖）和PEG／Dextran硫酸 盐体系为常见；(分子间的斥力）
（2）高聚物-低分子物质体系，以高聚物/无机盐 体系为常见，如PEG/硫酸盐、PEG/磷酸盐 等（盐析作用）。
2 常见的各种双水相系统
聚合物1
聚乙二醇
磷酸钾
硫酸镁 硫酸铵 硫酸钠 甲酸钠 酒石酸钾钠
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
H2O加量 次数 （g）
(NH4)2SO4溶液 加量 ml g
纯 溶液累计 PEG 400 (NH4)2SO4 总量（g） （%） 累计量
(NH4)2SO 4（%）
1 2
0.5 0.5
3
4 5 6 7 8
0.5
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
根据聚合物的质量平衡 ： mO mB mT 式中mO , mT 和mB分别为聚合物的总质量 和在上相和下相中的质 量，它们分别为： mO （VB B VT T） cO mB VB B cB mT VT T cT 式中V , 和c分别为相体积、密度和 聚合物的浓度； 下标O、T则分别代表在有机混合 物（O）、下相（B）和上相（T）中。 V c c 可以得到：T T B O VB B cO cT cB cO MB 从相图可知： cO cT MT 综合方程式，得 VT MB B VB MT T
双水相萃取法是利用物质 在互不相溶的两水相间分配系 数的差异来进行萃取的方法。 双水相系统可将水溶性的酶、 蛋白质等生物活性物质从一个 水相转移到另一水相中。
2.2％的葡聚糖水溶 液与等体积的0.72％ 甲基纤维素钠的水溶 液相混合并静置后， 可得到两个粘稠的液 层，下层含有大部分 葡聚糖．上层含有大 部分甲基纤维素纳， 两相中 98％以上的 成分是水。
PEG和Dex团其无毒性和 良好的可调性广泛应用。
二、相平衡和混溶性
T′
相 图
M′
A
B
B′
相图的制作
精确配制 43.00% （ g/ml ）左右的 (NH4)2SO4 溶液，并测其 密度。
精确称取PEG 400溶液0.700g 于试管中，按表格中所列第 一号数据，用吸管加入 0.5 mlH2O（ H2O的密度以1g/ml计） 缓慢滴入已配制好的 (NH4)2SO4 溶液，并不断在混合器上 混合，观察溶液的澄清程度，直至试管内溶液开始出现混 浊为止。记录 (NH4)2SO4 的加量（ ml ），根据密度值求出 重量（g），然后，按下表所列的第2号数据加入H2O，使 其澄清（加H2O量根据数据点的密集程度控制），继续向 试管中滴加 (NH4)2SO4 溶液，使其再次达到混浊，如此反 复操作，计算每次达到混浊时， PEG 和 (NH4)2SO4 在系统 总量中的重量百分比（%），将PEG的百分浓度为纵坐标， (NH4)2SO4 的百分浓度为横坐标配平衡的参数
影响分配平衡的主要参数有成相聚合物的分子量和浓度、体 系的pH、体系中盐的种类和浓度、体系中菌体或细胞的种类 和浓度、体系温度等等。选择合适的条件，可以达到较高的 分配系数，较好地分离目的物。
(1)聚合物的影响
(2)体系中无机盐离子的影响 在PEG/DEX体系中，无机盐离子在两相中也有不同 的分配，因此在两相间形成电位差。由于各相要保持电中 性，这对带电生物大分子，如蛋白质和核酸等的分配，产 生很大的影响。
pH=6.9 溶菌酶带正电， 卵蛋白带负电。
KCl K Na
此性质常被用于提高 物质在双水相系统的 分配系数。
(3)体系pH的影响
pH会影响蛋白质中可离解基团的离 解度，因而改变蛋白质所带电荷和 分配系数；另外，pH还影响系统缓 冲物质磷酸盐的离解程度，影响相 间电位差，从而影响分配系数。
一、双水相的形成
高聚物水溶液的混合
互不溶性，形成两个水 相，两种聚合物分别富 集于上下两相； 复合凝聚，也形成两个 水相，但两种高聚物主 要集中于一相。另一项 几乎为水； 完全互溶形成均相的高 聚物水溶液。
一、双水相的形成
双水相形成机理
双水相系统的形成在于聚合物的不相溶性产生的空间障碍 作用。 两个亲水成分的非互溶性，通常来源于各自分子结构上的 不同所产生的相互排斥作用。相反两种高聚物如果产生引 力则会形成互溶或者复合凝聚。 双水相系统也可由聚合物和无机盐之间。只要浓度达到一 定值，也 会形成两相，即聚合物-盐双水相体系，成相机理 尚不清楚，一 种解释为“盐析”作用。
不相溶性是一普遍现象，其溶剂也不一定是水，也可 能是有机溶剂。 如果多种不相溶的聚合物混在一起，就可得到多相体 系，如硫酸葡聚糖、葡聚糖、羟丙基葡聚糖和聚乙二 醇相混时，可形成四相体系。
与溶剂萃取比较，双水相的两相性质差别小（密度和 折射率），有时难以看到界面。
生化工程中广泛应用的双 水相体系：聚乙二醇 (PEG)/葡聚糖(Dex)体系， PEG/盐等体系。 分离某一生物大分子，两 相系统的选择必须有利于 目的物的萃取和分离，同 时又要兼顾到聚合物的物 理性质。如甲基纤维素和 聚乙烯醇，因其粘度太高 而限制了它们的应用。
M′ T′
A
B B′
VT MB VB MT
CT
Co
CB
物质在两相中的分配
和溶剂萃取法一样，物质在两水相中的分配用分 配系数K 表示。
K ct cb
ct , cb分别为上相和下相中溶 质（分子或粒子）的浓 度。 当相系统固定时，分配 系数为常数。
K——与温度、压力以及溶质和溶剂的性质有关， 与溶质的浓度无关
双水相萃取技术
萃取是最常用的一种液液分离方法，在制药和化 工行业应用极为普遍。但是普通的有机溶剂萃取法由 于以下原因难于应用于蛋白质分离： (1)许多蛋白质都有极强的亲水性，不溶于有机溶 剂；
(2)蛋白质在有机溶剂相中易变性失活。
1896年Beijerinck观察到当把明胶与琼脂或把明胶和可 溶 性淀粉的水溶液混合时，先得到一混浊不透明的溶 液，随后分成两相，上相含有大部分明胶，下相含有 大部分琼脂(或可溶性淀粉)。 60年代，瑞典Lund大学的Albertsson P A等人首先将双 水相系统应用于萃取技术。 70年代，德国将此技术应用于从细胞液中提取酶和蛋 白质，大大改善了酶的提取效果。 目前，仍然停留于实验室阶段，没有一套完善的理论 来解释生物大分子在体系中分配机理。工业化的例子 不多，原因在于成本过高，使技术上的优势被削弱。