Trizol法提取RNA实验步骤与原理(新手详细注释版)
Trizol法提取RNA实验步骤及原理
Trizol法使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 Eppendorf管（RNase-free）、 Tips （RNase-free）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品
2021年Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
无水
乙
(RNa se-fre
e)、
(RNase-free) RNase 酶非常稳定, 是导
致的条件可但限制因
Trizol 法使用步骤
欧阳光明(2021.03.07)
一・分离纯化的基本原理
硏究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化 RNA O RNA 质量的高低常常影响cDNA 库，RT-PCR 和Northern Blot 等 分子生物学实验的成贩。Trizol 是一种新型总RNA 抽提试剂，内含异 硫氟酸肌等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二.用户需自备的试剂和材料
Glycogen (可能需要)、1.5ml Eppendorf 管
三.准备工作
高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RN“se 完全失活。它广泛存 在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必 须戴手套。
RNase 的又一污染源杲取液器，根据取液器制造商的要求对取液器逬 行处理。一般情况下采用用DEPC (焦炭酸二磷脂，一种RNase 抑制剂) 配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase- free 的物品时必须戴手套。
X 料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料
制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制水欧阳光明*创编
水欧阳光明*创编2021.03.07
品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1 %o 注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizoｌ法使用步骤
一、分离纯化得基本原理
研究基因得表达与调控时常常要从组织与细胞中分离与纯化ＲＮA。ＲNA质量得高低常常影响cＤNA库,ＲT-PCＲ与Ｎorthern Ｂloｔ等分子生物学实验得成败。Ｔrizol就是一种新型总ＲNＡ抽提试剂,内含异硫氰酸胍等物质,能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出得核酸酶。
二、用户需自备得试剂与材料
无水乙醇、氯仿、Ｇlycｏgen(可能需要)、 1、５ｍｌ Eppeｎｄｏrf管(ＲNase-frｅe)、 Tips(ＲNase－free)
三、准备工作
RNａse酶非常稳定,就是导致ＲNＡ降解最主要得物质。它在一些极端得条件可以暂时失活,但限制因素去除后有迅速复性。用常规得高温高压蒸气灭菌方法与蛋白抑制剂都不能就是ＲＮase完全失活。它广泛存在于人得皮肤上,因此,在与RＮA制备有关得分子生物学实验时,必须戴手套。
RNase得又一污染源就是取液器,根据取液器制造商得要求对取液器进行处理。一般情况下采用用ＤEPC（焦炭酸二磷脂,一种ＲＮａse抑制剂)配制得7０％乙醇擦洗取液器得内部与外部,基本达到要求。取ＲＮａｓｅ－free得物品时必须戴手套。
1、料制品得处理
尽可能使用无菌,一次性塑料制品，已标明RNasｅ-Fｒee 得塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下:
1)在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEＰＣ使DEＰC得终浓度为０、1%。注意:DEP Ｃ为剧毒物,活性很强，小心在通风柜中使用。
2)处理得塑料制品放入一个可以高温灭菌得容器中,注入ＤEPC水溶液,使塑料制品得所有部分都浸泡到溶液中。
trizol组织提取rna步骤
trizol组织提取rna步骤
Trizol组织提取RNA步骤
引言：
RNA是一种重要的生物大分子，它在生物体内起着基因表达和调控的重要作用。为了研究RNA的结构和功能，科学家们经过不断的探索和研究，发展出了一系列有效的RNA提取方法。其中，Trizol 组织提取RNA方法是目前应用较广泛的一种方法，本文将详细介绍Trizol组织提取RNA的步骤。
步骤一：样品准备
需要准备好待提取RNA的组织样品。样品可以是动植物组织，也可以是细胞。样品应该新鲜、完整，并且需要在提取RNA前保存在液氮中，以保持RNA的完整性。
步骤二：组织破碎
将样品从液氮中取出，放入细胞破碎液中。细胞破碎液可以是Trizol试剂，也可以是其他适用的细胞破碎液。然后，使用离心机将样品离心，以破碎组织细胞，并释放RNA。
步骤三：加入氯仿
将破碎的组织样品转移到离心管中，加入适量的氯仿。氯仿可以与Trizol试剂中的异丙醇和酚形成两相体系，用于分离RNA。
步骤四：离心分离
将离心管盖紧，并放入离心机中进行高速离心。离心的目的是将样品中的RNA分离到上清液中，底物中会残留DNA和蛋白质。
步骤五：收集上清液
将离心管从离心机中取出，小心地将上清液转移到一个新的离心管中。上清液中含有RNA，可以继续进行后续的提取。
步骤六：沉淀RNA
向上清液中加入等体积的异丙醇，使其浓度达到70%。然后，轻轻地摇晃离心管，使RNA与异丙醇充分混合。接下来，将混合液放置在-20°C的冰箱中，使RNA沉淀。
步骤七：离心沉淀
将离心管放入高速离心机中，进行高速离心。离心的目的是使RNA 沉淀到离心管底部。
trizol提取rna的原理
trizol提取rna的原理
Trizol提取RNA的原理
RNA是生物体内的重要分子之一，可以传递遗传信息、参与蛋白质合成等生命活动。因此，RNA的提取对于生物学研究具有重要意义。Trizol是一种常用的RNA提取试剂，本文将介绍Trizol提取RNA 的原理。
Trizol是由酚和胍组成的一种试剂，能够同时提取RNA、DNA和蛋白质。其基本原理是利用酚的特殊溶解性质，使RNA在酚相中分离出来。具体步骤如下：
1. 细胞破碎
需要将待提取RNA的样品（如细胞、组织等）用Trizol等试剂破碎。这一步的目的是打破细胞壁和细胞膜，使RNA暴露在外。Trizol中的胍可以去除RNA分子上的蛋白质质量，避免RNA被蛋白质干扰。
2. 分离RNA
将样品中的RNA与Trizol中的酚混合，使RNA分子在酚相中溶解。酚可将RNA分子周围的水分子脱水，从而使RNA分子聚集在一起。此时，RNA分子会与DNA和蛋白质分子分别在不同的液相中。
3. 沉淀RNA
为了分离RNA纯化，需要将RNA从酚相中沉淀出来。这一步需要加入异丙醇，异丙醇能够将RNA分子从酚相中析出。异丙醇浓度越高，RNA得到沉淀的几率越大。
4. 洗涤RNA
将RNA沉淀后，需要用75%的酒精洗涤，去除异丙醇等离子体残留。此外，需要加入DEPC处理的水来去除RNase（核酸酶）等污染物，保证RNA的完整性和纯度。
5. 溶解RNA
将RNA沉淀物用TE缓冲液等稳定性较好的溶液进行溶解，即可得到高质量的RNA样品，用于后续实验。
总的来说，Trizol提取RNA的原理是通过酚和胍的组合，将RNA 分子从其他分子中分离出来。该方法具有操作简单、高提取率、可同时提取DNA和蛋白质等优点。但也存在一些局限性，如RNA完整性不能完全保证、RNA含量较低时易出现污染等。因此，在具体实验中需要结合实际情况选择合适的RNA提取方法。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizol法使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizolxx使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCF和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、氯仿、Glycogen （可能需要）、 1.5ml Eppendof管（RNase- free ）、Tips（RNase-free）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的咼温咼压蒸气火菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA 制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂）配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
Trizol法提取RNA步骤
1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。
2、按200ul氯仿ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后冰上放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
3、4℃16,000g离心15min。
4、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下
层酚相。
5、按0.5ml异丙醇ml Trizol 加入异丙醇混匀，冰上放置5-10min。
6、4℃12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
7、按1ml 75%乙醇ml Trizol加入75%乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀。
8、4℃75000g离心5min，尽量弃上清。重复洗一次。
9、室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
10、可用30ul H2O，TE buffer溶解RNA样品。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详
细注释版)
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
一、实验步骤
1. 涂布区域准备
- 确保实验室台面干净整洁，并消毒工作区域。
- 准备所需的试剂和材料，包括Trizol试剂、异丙醇、70%乙醇、无菌乙酸纯水等。
2. 细胞样本处理
- 从培养皿中收集所需的细胞样本，注意避免污染。
- 使用无菌PBS缓冲液洗涤细胞，以去除培养基和细胞碎片。
- 加入适量的Trizol试剂至细胞样本中，充分悬浮细胞。
- 注意：为了保护RNA的完整性，在细胞样本处理过程中尽量迅速
操作，避免长时间接触Trizol试剂。
3. 提取RNA
- 将含有细胞样本和Trizol试剂的混合物转移到无菌离心管中。
- 加入适量的氯仿，摇匀混合，并静置15分钟，使混合物体相分离。
- 低速离心10分钟，将上层的无色透明液体转移到新的无菌离心管中。
4. 分离RNA
- 加入等体积的异丙醇，轻轻倾斜离心管，使RNA沉淀形成。
- 低速离心10分钟以沉淀RNA，上清液中通常含有DNA。
- 倒掉上清液，并加入70%乙醇洗涤RNA沉淀，轻轻颠倒离心管以洗涤RNA。
- 低速离心5分钟，倒掉乙醇。
5. 干燥RNA
- 用洗涤过的无菌乙酸纯水溶解RNA沉淀，轻轻颠倒离心管以溶解RNA。
- 将溶解的RNA转移至无菌离心管中。
- 在室温或37摄氏度下迅速干燥RNA，避免长时间曝露。
6. 储存RNA
- 使用RNase-free水溶解RNA沉淀，测定RNA的浓度和纯度。
- 分配等量的RNA至多个RNase-free离心管中，储存在-80摄氏度的冰箱中。
Trizol法提取RNA实验步骤讲解学习
Tr i zol法提取RNA
实验步骤
Trizol法使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA
RN颇量的高低常常影响cDN癖，RT-PCR日Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RN袖提试剂，内含异硫氧酸服等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需白备的试剂和材料
无水乙醇、氯仿、Glycogen （可能需要）、1.5ml Eppendorf管
（RNase-free ）、Tips （RNase-free ）
三、准备工作
RNas购非常稳定，是导致RN廨解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的周温局压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNases全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RN制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase勺又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。
一般情况下采用用DEP配制的70气醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC!DEP曲终浓度为0.1%。注
意：DEPd剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPCC溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理
Trizol法使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 Eppendorf管（RNase-free）、 Tips （RNase-free）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品
Trizol法提取RNA实验步骤及原理(新手详细注释版)
Trizol法使用步调之袁州冬雪创作
一、分离纯化的基来历根基理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA.RNA质量的高低常常影响cDNA库，RTPCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败.Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶.
二、用户需自备的试剂和资料
无水乙醇、氯仿、Glycogen（能够需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNasefree）、 Tips（RNasefree）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质.它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性.用惯例的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不克不及是RNase完全失活.它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套.
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器停止处理.一般情况下采取用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的外部和外部，基本达到要求.取RNasefree的物品时必须戴手套.
1、料制品的处理
尽能够使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNaseFree 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有需要再次处理.对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可以使用.处理步调如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%.注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用. 2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中.
Trizol法提取RNA实验步骤
Trizol法提取RNA实验步骤
（1）每50-100mg组织标本中加入1ml的Trizol，超声波细胞粉碎机匀浆。（2）加入0.2ml的氯仿（1/5Trizol体积），加盖好后用手剧烈摇晃15s，置室温5min。
（3）4℃，12000g离心15min，可见分层。
（4）小心收集上层水相（400-500ul）置于另一1.5ml无酶EP管中（确保不要吸中间层DNA和下层蛋白质）。
（5）加入等体积异丙醇室温静置15min，或混匀后-20℃中1小时。
（6）4℃，12000g离心10min，可见RNA沉淀。
（7）弃上清，加入预冷的用DEPC水配置的75%乙醇500ul，用指轻弹管壁使RNA沉淀飘起，洗涤。
（8）4℃，12000g离心5min。
（9）用枪吸取上清，空气中干燥3-7min，看到沉淀边缘变透明即可。（10）加入20ul（30ul)DEPC水，56℃水浴小于10min助溶，取少量测OD 值，其余-80℃保存备用。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理
Trizol法提取RNA实验步骤及原理
实验原理：
Trizol法是一种常用的RNA提取方法，其原理是利用三种有机物（TRIzol、氯仿和异丙醇）的混合物，使细胞或组织中的RNA在低温下与TRIzol发生相互作用，形成RNA-TRIzol复合物。加入氯仿后，RNA-TRIzol复合物会转移到有机相中，而DNA和蛋白质则留在水相中。通过离心分离有机相和水相，可将RNA从有机相中分离出来。最后，加入丙醇沉淀RNA，即可得到纯度较高的RNA。
实验步骤：
1. 细胞或组织样品的收集：将细胞或组织样品收集到离心管中。
2. 加入Trizol试剂：向离心管中加入适量的Trizol试剂，按比例加入的量为1mL Trizol/100mg组织或1×10^7个细胞。
3. 细胞或组织样品的破碎：使用超声波或均质器等方法将细胞或组织样品破碎。
4. 加入氯仿：向离心管中加入适量的氯仿，按比例加入的量为0.2mL
氯仿/1mL Trizol。
5. 混合离心：将离心管中的混合物混合均匀后，离心分离有机相和水相。
6. 收集RNA：将有机相转移到新的离心管中，加入适量的异丙醇，沉淀RNA。
7. 洗涤RNA：用75%乙酸酒精洗涤RNA。
8. 溶解RNA：用RNase-free水或DEPC水溶解RNA。
9. 检测RNA：使用比色法或琼脂糖凝胶电泳等方法检测RNA的纯度和浓度。
注意事项：
1. Trizol试剂应保存在4℃下，避免阳光直射和冰冻。
2. 操作过程中要注意RNA的保护，避免RNA的降解。
3. 操作过程中要使用无菌技术，避免污染。
Trizol法提取RNA实验步骤及原理
Trizol法使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 Eppendorf管（RNase-free）、 Tips （RNase-free）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为%。注意：DEPC为剧毒
物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中。
详解Trizol提取RNA原理、步骤和注意事项
详解Trizol提取RNA原理、步骤和注意事项
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍酚和β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇主要破坏RNase蛋白质中的二硫键。
（一）试剂准备
1．Trizol试剂。
2．氯仿
3．异丙醇
4．75%乙醇（DEPC水配制）
5．DEPC水
细胞裂解后，细胞释放出蛋白质、DNA、RNA等物质，再根据它们在不同的PH值和不同极性溶剂的溶解度不同而使得分开。
（二）操作步骤
1．样品处理：
（1）细胞：
1）悬浮细胞：移入1.5ml离心管中，1200转，离心5min，弃上清，PBS洗，重复两次，最后弃ＰＢＳ，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
２）贴壁细胞：PBS洗两次，最后弃ＰＢＳ，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。
（2）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml 离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。
2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置15min。
3．4℃离心，12000g×15min，取上清。
4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。
5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。
6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，8000g×5min，弃上清。
7. 晾干，加入适量的DEP水溶解（65℃促溶10-15min）。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
Trizol法使用步骤
一、分离纯化的基本原理
研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化RNA。RNA质量的高低常常影响cDNA库，RT-PCR和Northern Blot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。
二、用户需自备的试剂和材料
无水乙醇、氯仿、Glycogen（可能需要）、 1.5ml Eppendorf管（RNase-free）、Tips（RNase-free）
三、准备工作
RNase酶非常稳定，是导致RNA降解最主要的物质。它在一些极端的条件可以暂时失活，但限制因素去除后有迅速复性。用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是RNase完全失活。它广泛存在于人的皮肤上，因此，在与RNA制备有关的分子生物学实验时，必须戴手套。
RNase的又一污染源是取液器，根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用用DEPC(焦炭酸二磷脂，一种RNase抑制剂)配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，基本达到要求。取RNase-free的物品时必须戴手套。
1、料制品的处理
尽可能使用无菌，一次性塑料制品，已标明RNase-Free 的塑料制品，如没有开封使用过通常没有必要再次处理。对于国产塑料制品，原则上都必须处理方可使用。处理步骤如下：
1）在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使DEPC的终浓度为0.1%。注意：DEPC为剧毒物，活性很强，小心在通风柜中使用。
2）处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC水溶液，使塑料制品
的所有部分都浸泡到溶液中。
3）在通风柜中室温处理过夜。
4）将DEPC水溶液小心倒到废液瓶中，用铝箔封住含已DEPC水处理过的塑料制品的烧杯，高温高压蒸气灭菌至少30分钟。
5）烘箱用合适的温度烘拷至干燥。置于干净处备用。
2、璃玻和金属物品
250°C烘烤3小时以上。
四、从组织中提取总RNA
1)液氮研磨：组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，如此三次，按50-100mg组织/ml Trizol加入Trizol，转入离心管进行第2步操作。
（液氮既能使各种组织成分不易被破坏或降解,又能使组织变硬,脆性增加易于磨碎。终止细胞内外一切生物反应，防止RNA酶的降解反应）
2) 匀浆：组织样品按50-100mg/mlTrizol 加入Trizol。另外，组织体积不能超过Trizol体积的10%，否则匀浆效果会不好，用电动匀浆器充分匀浆约需1-2分钟。
五、从细胞中提取总RNA
1) 培养贴壁细胞：不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。
2) 悬浮细胞可直接收集、裂解，每1ml Trizol可裂解5×106动物、植物或酵母细胞，或107细菌细胞。
六、操作步骤
1、细胞或组织加Trizol后，室温放置5min，使其充分裂解。注：此时可放入-70℃长期保持。
2、12,000rpm 离心5min，弃沉淀。
3、按200ul氯仿/ml Trizol加入氯仿，振荡混匀后室温放置15min。注：禁用漩涡振荡器，以免基因组DNA断裂。
（氯仿为有机溶剂，有效的使有机相和无机相迅速分离。有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和RNA脱离，RNA进入水相）
4、4℃ 12,000g离心15min。
5、吸取上层水相，至另一离心管中。注：千万不要吸取中间界面；若同时提取DNA 和蛋白质，则保留下层酚相存于4℃冰箱,若只提RNA，则弃下层酚相。
6、按0.5ml异丙醇/ml Trizol 加入异丙醇（沉淀RNA）混匀，室温放置5-10min。
7、4℃ 12,000g离心10min，弃上清，RNA沉于管底。
8、按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇（沉淀RNA），温和振荡离心管，悬浮沉淀。
9、 4℃ 8,000g离心5min，尽量弃上清。
10、室温晾干或真空干燥5-10min。注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。
11、可用50ul H
2O，TE buffer或0.5%SDS溶解RNA样品，55-60℃,5-10min。注：H
2
O、
TE或0.5%SDS均须用DEPC处理并高压。
（TE缓冲液由Tris和EDTA配制而成，主要用于溶解核酸，能稳定储存DNA和RNA。用于酶切反应不能使用SDS）
12、测O.D值定量RNA浓度。注：此方法提取RNA A
260/A
280
值在1.6-1.8之间；产率
估计：组织标本：（ug RNA/mg组织）1-10ug，培养细胞（ug RNA/106 Cell）：5-15ug。注：组织或细胞量过少，可酌情减少Trizol用量；组织或细胞用量过多，会引起DNA对RNA的污染；
高蛋白、脂肪或多糖类组织，肌肉组织或块状植物组织等，组织匀浆或液氮研磨后须4℃ 12,000g离心10min去掉不溶物，再进行下面操作，若顶层有脂肪物，则也须去掉；
热天提RNA，带手套是必须的，手是RNase的主要来源；
组织块用液氮研磨，效果最好，若没有液氮或电动匀浆器，可用手动匀浆器代替，此时组织块不宜过大，且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎，然后再充分研磨。
6.1.2.1 肝脏、肠道、肌肉总RNA提取方法
①使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镊子从鱼的腹部解剖开，从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织，置于离心管后立即放入液氮中；
②组织在液氮下研磨成粉，取少量至加有1mLTrizol的1.5ml离心管中，充分混合后于4℃，12,000rpm离心15min；
③取上清移至新1.5ml离心管中，加入200ul氯仿，剧烈震荡直至呈乳白色，于4℃，12,000rpm离心15min；
④取上清移至新1.5ml离心管中，加入500ul异丙醇，轻轻颠倒10次，冰上放置20mins，于4℃，12,000rpm离心15min；
⑤弃上清，加入1ml75%乙醇（用DEPC水现配现用），于4℃，12000rpm离心5min，重复此步骤一次；
⑥弃上清后，室温干燥5-7mins；
⑦加入适量（20-30ul）的DEPC水溶解沉淀65℃溶解，-20℃（最好-80℃）保存，检测RNA浓度，并电泳检测。
6.1.2.2 RNA浓度测定和电泳检测
取2ul提取好的RNA溶液，于Nanodrop 2000 Spectrophptpmeter测定RNA浓度及A260/A280的相对吸光度，纯净RNA的A260/A280应在1.8-2.2之间。
电泳检测：1%琼脂糖，1×ATE缓冲液，90V电泳30min，凝胶成像系统观察，分析结果。
6.1.2.3 肝脏、肌肉、肠道样品cDNA的合成
反应按照TaKaRa公司的PrimeScript® RT reagent Kit With gDNA Eraser （Perfect Real Time) 反转录试剂盒说明书进行，合成cDNA模板。
①（残存的）基因组DNA的除去反应，在PCR管中配置如下缓冲液。