实验一 高效液相色谱柱效能的评价
评价色谱柱效和分离效果的指标
评价色谱柱效和分离效果的指标色谱柱是色谱技术中最基本也是最重要的部分，它的质量直接影响着实验室中每一项物质分析的效果。
因此，确定色谱柱的性能指标并对其进行评价，对于实现检测精确、准确的色谱分析，具有重要的意义。
色谱柱的评价指标主要有四方面：精度、峰面积、保持时间和再生能力。
（一）精度精度是反映色谱柱试剂质量与稳定性、固定化效果和气体容量的综合指标，也可以作为定义样品静态和活性表征的有效参数。
可以从两个方面对柱的精度进行评价：一是重现率，二是有效容积。
重现率是色谱柱检测多次测量同样样品的峰面积和容量之间的差异，是表征柱精度的重要参数，通常它越大，表示柱的精度越高；而有效容积是指柱中所含有的分子大小的空间总容积，它是直接影响样品吸附能力和选择性的重要参数。
（二）峰面积峰面积是衡量色谱柱分离效果的重要参数，它可以反映柱体基体的层状结构，以及柱中吸附体的数量等，反映了柱中有效物质的容积与吸附性能。
峰面积越大，说明分离效果越好，可以获得更详细的信息；峰形越清晰，则说明色谱柱的分离能力越强。
（三）保持时间保持时间是指色谱柱的分离效果在用后保持不变的时间长度。
一般来说，柱的保持时间越长，其分离效果越好，说明其耐用性越强。
（四）再生能力再生能力是指色谱柱的回收率，它反映了柱在检测过程中色谱物质的经济性和有效性。
评价柱的再生能力需要进行多次测定，以确定柱体在检测过程中重复利用时，其各项指标的变化情况，。
一般来说，柱的再生率越高，其分离效果越好。
以上就是色谱柱的主要性能评价指标，其中精度、峰面积、保持时间和再生能力等四项指标是色谱柱性能评价的基础，是色谱柱性能检测中重要的参数。
正确评价色谱柱的这些指标，可以更好地提高色谱技术的实验精度及精确性，并最终获得更可靠、准确的检测结果。
高效液相色谱标准
高效液相色谱标准高效液相色谱标准的发展及其在分析化学中的重要性随着科技的不断进步，高效液相色谱法（HPLC）已经成为了现代分析化学中不可或缺的一部分。
这种方法以其极高的分离效能和灵敏度，广泛应用于各个领域，包括医药、环保、化工等。
然而，为了确保实验结果的准确性和可靠性，制定高效液相色谱标准显得尤为重要。
本文将深入探讨高效液相色谱法的原理、实验条件、标准制定原则与流程，以及其在实际应用中的案例分析，评估其优缺点并预测未来发展趋势。
一、高效液相色谱法的基本原理与概念高效液相色谱法是一种基于色谱分离技术的分析方法。
其基本原理是利用不同的物质在固定相和流动相之间的分配系数差异，实现对不同物质的分离。
这种方法的分离效能高，分析速度快，且具有较高的灵敏度和较低的检测限。
柱效能和检测限是高效液相色谱法中的关键概念。
柱效能反映了色谱柱的分离效果，而检测限则代表了方法的灵敏度。
二、实验条件与方法在进行高效液相色谱实验时，选择合适的固定相、流动相以及实验条件是至关重要的。
固定相是色谱分离的基础，不同的固定相对于不同物质的吸附能力不同。
流动相则决定了物质在色谱柱中的移动速度，从而影响分离效果。
实验条件包括温度、压力、流速等，这些因素都会对实验结果产生影响。
三、标准制定原则与流程制定高效液相色谱标准需要遵循一定的原则和流程。
首先，标准制定应基于广泛认可的方法和规范，确保实验过程的科学性和合理性。
其次，标准制定应注重可重复性和可操作性。
这意味着标准的制定应考虑到不同实验室之间的差异，确保实验结果具有可比性。
此外，标准制定还应关注样品处理、色谱柱条件优化、重复试验等环节，以确保实验结果的准确性和可靠性。
四、实际应用案例分析在实际应用中，高效液相色谱法已经在多个领域取得了显著成果。
例如，在医药领域，高效液相色谱法被用于药物的分离和纯化，以确保药品的质量和安全性。
在环保领域，高效液相色谱法被用于对环境样品中的有害物质进行检测和分析。
高效液相色谱实验报告
高效液相色谱实验报告高效液相色谱法，基本原理为影响柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。
分为液固吸附色谱法，流动相为液体，固定相是固体吸附剂；液分配色谱法，固定相几乎全是化学键合硅胶，又称化学键合相色谱法等。
（二）塔板理论：塔板理论方程式（高斯方程式）：理论塔板式数：理论塔板高度：（三）速率理论： h=a+b/u+cu影响塔板高度的因素：1、涡流扩散 2、纵向扩散 3、传质阻抗二、气相色谱仪：（1）色谱柱：固定相与柱管组成。
填充柱、毛细管柱；分配柱、吸附柱（2）紧固液：低沸点的液体，操作方式下为液态。
甲基硅油、聚乙二醇等选择原则：按相似性、按主要差别、按麦氏差别选择。
（3）载体：化学惰性的多孔性微粒（4）毛细管色谱柱：开管型、填充型（5）检测器：1、浓度型检测器：热导检测器和电子捕捉检测器2、质量型检测器：氢焰离子化检测器中国药典对气相色谱规定：除检测器种类、紧固液品种及特定选定的色谱柱材料严禁任一修改外，其他均可适度发生改变，色谱图于30min内记录完。
第四节高效液相色谱法1、基本原理：影响柱效的主要因素就是涡流蔓延和传质电阻。
分类：1、液固吸附色谱法：流动相为液体，固定相是固体吸附剂。
2、液——液分配色谱法：紧固二者几乎全系列就是化学键再分硅胶，又称化学键再分相色谱法。
按固定相和流动相的极性2又分：正相色谱法和反相色谱法正相色谱法：流动二者极性大于紧固二者极性的色谱法。
用作拆分溶有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质，用作所含相同官能团物质的拆分。
极性强组分先流入反相色谱法：……………大于……………………… 用于分离非极性至中等极性的分子型化合物2、高效率液相色谱仪：1、高压输液泵2、色谱柱3、进样阀4、检测器：紫外稀释检测器、荧光检测器、热法折光检测器、电化学检测中国药典对高效液相色谱法规定：除固定相种类、流动相组分、检测器类型不得任意更改外，其余均可适当改变，色谱图于20min内记录完毕。
第五节色谱系统适用性试验和定量分析方法一、系统适用性试验1、色谱柱的理论板数：2、分离度：应大于1.53、重复性3、拖尾声因子：0.95-1.05之间二、定量测定法：1、内标法加较正因子测定供试品中某个杂质或主成分含量2、外标法测量供试品中某个杂质或主成分含量3、加较正因子的主成分自身对照法不加较正因子的主成分自身对照法。
高效液相色谱实验
高效液相色谱实验I. 色谱柱的评价请在实验前预习《基础分析化学实验（第二版）》137－140页。
【目的】(1) 了解高效液相色谱仪的工作原理；(2) 学习评价液相色谱反相柱的方法。
【原理】高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。
它采用高压输液泵和小颗粒的填料，与经典的液相色谱相比，具有很高的柱效和分离能力。
色谱柱是色谱仪的心脏，也是需要经常更换和选用的部件，因此，评价色谱柱是十分重要的。
而且对色谱柱的评价也可以检查整个色谱仪的工作状况是否正常。
评价色谱柱的性能参数主要有：（1）柱效（理论塔板数）n式中t r 为测试物的保留时间，W 1/2为色谱峰的半峰宽。
（2）容量因子k’式中t 0为死时间，通常用已知在色谱柱上不保留的物质的出峰时间作死时间。
(3) 相对保留值（选择因子）α式中k 1’和k 2’分别为相邻两峰的容量因子，而且规定峰1的保留时间小于峰2的。
(4) 分离度R s式中t r1、t r2分别为相邻两峰的保留时间，W b1、W b2分别为两峰的底宽。
对于高斯峰来讲，W b =1.70W 1/2。
为达到好的分离，我们希望n 、α和R s 值尽可能大。
一般的分离（如α=1.2，R s =1.5），需n 达到2000。
柱压一般为104 kPa 或更小一些。
本实验采用多核芳烃作测试物，尿嘧啶为死时间标记物，评价反相色谱柱。
【仪器和试剂】Waters 510高效液相色谱仪（由Waters 510高压输液泵，Rheodyne 7725i 进样器，440检测器和记录仪组成）色谱柱：5 cm ×4.6 mm I.D., YWG-C 18H 37 (ODS)，10 μm流动相：甲醇－水(80+20)样品I ： 含尿嘧啶 (0.010 mg ·mL －1)、萘 (0.010 mg ·mL －1)、联苯 (0.010 mg ·mL －1)、菲（0.006 mg ·mL －1）的甲醇混合溶液；样品I I ：尿嘧啶的甲醇溶液；萘的甲醇溶液；联苯的甲醇溶液；菲的甲醇溶液。
中药色谱分析试验讲义试验一高效液相色谱操作及其参数的测定一
《中药色谱分析》实验讲义实验一高效液相色谱操作及其参数的测定一、目的要求：1．熟悉高效液相色谱仪的原理和基本方法2．熟悉使用高效液相色谱仪基本操作方法二、实验提要：以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
其基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、积分仪或数据处理系统记录色信号或进行数据处理而得到分析结果。
由于高效液相色谱法具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）、色谱柱可反复使用的特点，在《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用该法，已成为中药制剂含量测定最常用的分析方法。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，不易流失是其特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）为最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
三、实验内容1.高效液相色谱系统组成：（一）高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。
1.贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。
贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。
2.流动相流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。
【仪器】高效液相色谱法实验结果分析
【仪器】高效液相色谱法实验结果分析现代色谱分析法是有效而快速的分离、分析手段，既可用于定性分析，又可用于定量分析。
高效液相色谱法与气相色谱法的定性分析和定量分析方法（包括测定方式和计算方法）相同。
在定性分析中，有用纯物质对照的色谱鉴定法，还有收集馏分与化学方法或其他仪器分析方法联用的非色谱鉴定法；在定量分析中，可以用峰高或峰面积以内标法、外标法或归一化法定量，并与微机联用作为现代化的分析工具。
定性分析色谱分析法定性分析的目的就是确定每个色谱峰代表什么组分，从而确定由这些组分所构成的混合物试样的组成。
常用的主要定性方法有色谱鉴定法和非色谱鉴定法两种。
1．色谱鉴定法定性色谱鉴定法就是用纯物质对照定性，这是气相和高效液相色谱法中最常用的最方便的一种定性方法，可以和定量测定操作同时进行。
(1)利用保留值定性在色谱条件一定的情况下（包括柱长、柱内径、固定相、柱温、流动相及流速等），每一种物质都有其一定的保留值（包括保留时间、保留体积、调整保留时间、调整保留体积等），一般不受其他组分的影响，可以作为定性的根据。
此法又称为纯物质对照定性。
在相同的色谱条件下，先测定未知物中每个色谱峰的保留时间或保留距离，再将要测的某纯物质注入色谱仪，对照比较两者的保留值，如果两者的保留值相同，就可判定该未知物与已知纯物质是同一种物质。
(2)利用加入纯物质增加峰高法定性在稳定的色谱条件下，为了区分两个保留值（保留时间或保留距离）非常接近的组分，可以将某纯物质直接加入到试样中，再注入色谱仪，如果某组分峰的峰高增加了，表明这个色谱峰就是加入的纯物质。
此法又称为纯物质追加法定性。
色谱鉴定法定性需要有纯物质对照，在没有纯物质时，可以用非色谱鉴定法定性。
2．非色谱鉴定法定性(1)利用文献或相关工具书查相对保留值定性任何一个实验室都不可能配备所有物质的纯品，没有纯物质将无法定性，所以可以利用国内外其他实验室的色谱工作者在《分析化学》或《色谱分析》刊物上发表的具有相对保留值和保留指数（Ix）数据的论文（文献）。
高效液相色谱柱效能的测定
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
敏度10-11g。
二、 高效液相色谱法主要类型及分离原理
根据分离原理，高效液相色谱法分为： 液-液色谱及化学键合相法 液-固色谱法 离子对色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法
反相键合相色谱法
固定相：极性较小的键合固定相，如硅胶一C18H37、 硅胶一苯基等；
流动相：极性较强的溶剂，如甲醇、乙睛、水和无机 盐的缓冲溶液等。
高效液相色谱图：
数据处理：
甲苯
萘
tR /min
Y1/2 /min
n/
块·m-1
R
n 5.54( tR )2
Y1/ 2
R
tR2 tR1
2 2.35
(Y1/ 2(1)
Y1/
2(2)
)
联苯
天美LC2130 HPLC操作规程
一、开机准备 1.实验室温度应保持在25～30℃之间，湿度小于65%。 2. 根据实验要求，选择合适的色谱柱并安装，准备相
标，混合物能否在色谱柱中得到分离，除取决于选择 合适的固定相外，还与色谱操作条件及色谱柱的装填 状况等因素有关。
高效液相色谱柱
高效液相色谱柱高效液相色谱柱是一种在分析化学领域中广泛使用的技术。
它的原理是通过溶液在色谱柱中的流动过程中，对溶质进行分离和纯化。
高效液相色谱柱的优点是分析速度快、分离效果好、操作简便等。
本文将介绍高效液相色谱柱的原理、种类、应用以及未来的发展趋势等内容。
高效液相色谱柱的原理主要包括固定相和移动相两个基本要素。
固定相负责分离溶质，常用的固定相有疏水相、离子相、亲合相等。
移动相则是将溶质带动在柱子中流动的溶剂，通常是有机溶剂和水的混合物。
这样，在溶液在色谱柱中流动过程中，不同溶质会在固定相的作用下发生分离，从而实现对混合物的分析和纯化。
高效液相色谱柱根据固定相的不同可以分为几种不同的类型。
例如，疏水相色谱柱广泛应用于有机物的分离和分析，它的固定相表面通常具有疏水性，可以对有机物进行选择性的吸附和分离。
离子相色谱柱则适用于进行离子化合物的分离和分析，例如酸和碱等。
亲合相色谱柱主要是基于生物大分子与其他化合物之间的生物亲和性进行分析。
高效液相色谱柱在实际应用中有着广泛的用途。
在生命科学研究领域，高效液相色谱柱可以用于对蛋白质、核酸等生物大分子的分离和纯化。
在药物分析领域，高效液相色谱柱经常被用于药物的纯化和质量控制。
在环境监测方面，高效液相色谱柱可以用于对环境污染物的检测和分析。
此外，高效液相色谱柱还被广泛应用于食品安全、农药残留检测、天然产物分析等领域。
随着科学技术的不断进步，高效液相色谱柱也在不断发展和完善。
目前，研究人员正在努力提高高效液相色谱柱的分离效率和分离速度，使其更加适用于复杂物质的分离和分析。
同时，也在研发新的固定相和移动相，以满足不同类型化合物的分析需求。
此外，一些新的检测技术和装置也被引入到高效液相色谱柱中，提高对溶质的灵敏度和准确性。
总之，高效液相色谱柱是一种重要的分析技术，具有广泛的应用前景和发展空间。
它在生命科学、药物分析、环境监测等领域都有着重要的作用。
随着科学技术的不断进步，相信高效液相色谱柱在未来会发展出更多的新技术和新应用，为我们的科研和生产提供更多的支持和帮助。
电化学实验
苯、萘、联苯的高效液相色谱分析及柱效能的测定一、目的要求1．学习高效液相色谱保留值定性、外标法定量分析方法。
2．了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，以及初步掌握其操作技能3．学习柱效能的测定方法二、实验原理高效液相色谱的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中，采用保留值定性，或与其它定性能力强的仪器分析法（如质谱法、红外吸收光谱法等）联用。
在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式，同样适用于高效液相色谱：速率理论及范弟姆特方程式对于研究影响高效液相色谱柱效的各种因素，同样具有指导意义：由于组分在液体中的扩散系数很小，纵向扩散项（B/u）对色谱扩展的影响可以忽略不计，而传质阻力项（Cu）则成为影响柱效的主要因素，提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度，以加快传质速率，可提高液相色谱的柱效能。
目前常使用的固定相直径为5~10mμ。
液相色谱除了上述影响柱效的一些因素外，还应考虑到一些柱外展宽的因素。
三、实验用品1．仪器高效液相色谱（任一型号）紫外光度检测器恒流泵或恒压泵溶剂过滤系统高压六通进样阀微量进样器（100μL）超声波发生器2．药品苯、萘、联苯、甲醇（均为A.R）纯水（去离子水，再经一次蒸馏）标准贮备液分别配制浓度为1000μg · mL－1的苯、萘、联苯的甲醇溶液。
标准工作液将上述标准贮备液用甲醇稀释10倍，配成苯、萘、联苯的浓度分别为100μg · mL－1的甲醇溶液。
混合样品苯、萘、联苯四、操作步骤1．测定条件的选择（1）色谱柱长250 mm，内径 4.6 mm，装填C-18 烷基键合相，颗粒度10μm的固定相（2）流动相甲醇:水（83:17），流量1.0 mL· min－1（3）紫外光度检测器测定波长254 nm（4）进样量20μL2．仪器操作（1）将配置好的流动相于超声波发生器上，脱气15 min。
高效液相实验报告
篇一：高效液相色谱实验报告高效液相色谱实验报告一、实验目的1了解液相色谱的发展历史及最新进展 2 学习液相色谱的基本构造及原理3 掌握液相色谱的操作方法和分析方法，能够通过hplc分离测定来对目标化合物的分析鉴定。
二、实验原理液相色谱法采用液体作为流动相，利用物质在两相中的吸附或分配系数的微小差异达到分离的目的。
当两相做相对移动时，被测物质在两相之间进行反复多次的质量交换，使溶质间微小的性质差异产生放大的效果，达到分离分析和测定的目的。
液相色谱与气相色谱相比，最大的优点是可以分离不可挥发而具有一定溶解性的物质或受热后不稳定的物质，这类物质在已知化合物中占有相当大的比例，这也确定了液相色谱在应用领域中的地位。
高效液相色谱可分析低分子量、低沸点的有机化合物，更多适用于分析中、高分子量、高沸点及热稳定性差的有机化合物。
80%的有机化合物都可以用高效液相色谱分析，目前以已经广泛应用于生物工程、制药工程、食品工业、环境检测、石油化工等行业。
三、高效液相色谱的分类吸附色谱法、分配色谱法、空间排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、化学键合相色谱法四、高效液相色谱仪的基本构造高效液相色谱至少包括输液系统、进样器、分离柱、检测器和数据处理系统等几部分。
1 输液系统：包括贮液及脱气装置、高压输液泵和梯度洗脱装置。
贮液装置用于存贮足够量、符合hplc要求的流动相。
高效液相色谱柱填料颗粒比较小，通过柱子的流动相受到的流动阻力很大，因此需要高压泵输送流动相。
2 进样系统：将待测的样品引入到色谱柱的装置。
液相色谱进样装置需要满足重复性好、死体积小、保证柱中心进样、进样时引起的流量波动小、便于实现自动化等多项要求。
进样系统包括取样、进样两项功能。
3 分离柱：色谱柱是色谱仪的心脏、柱效高、选择性好、分析速度快是对色谱柱的一般要求。
商品化的hplc微粒填料，如硅胶和以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）等的粒度通常在3μm、5μm、7μm、以及10μm。
高效液相色谱柱效能的测定
应用最广，对大部分有机化合物有响应。
特点： 灵敏度高； 10-9g·mL-1 线性范围宽； 对流动相的流速和温度 变化不敏感； 波长可选，易于操作； 可用于梯度洗脱。
高效液相色谱柱效能的测定
一、实验目的： 1.学习高效液相色谱柱效能的测定方法。 2.了解高效液相色谱仪的基本结构及工作原理。 3.初步掌握高效液相色谱仪的操作及使用。
应的流动相并过滤脱气。 二、开 机 1.依次打开2130高压泵、检测器和计算机电源开关，
设定合适的检测波长。 2.双击桌面上的T2000P色谱工作站图标，进入工作站
系统。
三、编辑HPLC分析方法 1.双击“方法”图标，编辑HPLC分析方法。 2. 保存所编辑的HPLC分析方法。 四、样品分析与采集数据 1.在文件栏中选择分析方法文件。 2.手动进样: 在方法栏中依提示输入文件名称、样品
己烷（分析纯）、甲醇（色谱纯）、水为二次蒸馏 水
四、实验条件：
1.检测器：紫外光度检测器，测试波长254nm 2.流动相：甲醇：水(83：17)，流量0.8 ml/min 3.色谱柱：长250mm，内径4.6mm，装填C-18烷基键合
相(粒度5μm) 4.进样量：20 μL
五、实验步骤：
1. 根据实验条件，将仪器调至可进样状态，待基线平 稳后，即可进样。 2. 吸取标准使用液（含甲苯、萘、联苯各10ug/ml的 正己烷溶液）20μL，注入高效液相色谱仪。 3. 记录下色谱图。 4. 从色谱图中测得甲苯、萘、联苯的保留时间tR，半 峰宽Y1/2，计算对应的理论塔板数n及分离度R。
2、主要部件
（1）、进样装置
使用高压定量进样阀(六通阀)进样装进样体积 由定量管控制，进样准确，重现性好，适于定量 分析。
高效液相色谱(HPLC)柱效测定
实验六高效液相色谱(HPLC)柱效测定093858 张亚辉一. 实验目的1、学习高效液相色谱仪的基本操作方法。
2、了解高效液相色谱仪原理和条件设定方法。
3、了解高效液相色谱法在日常分析中的应用。
二. 实验原理高效液相色谱法是以液体作为流动相，借助于高压输液泵获得相对较高流速的液流以提高分离速度、并采用颗粒极细的高效固定相制成的色谱柱进行分离和分析的一种色谱方法。
在高效液相色谱中，若采用非极性固定相，如十八烷基键合相，极性流动相，即构成反相色谱分离系统。
反之，则称为正相色谱分离系统。
反相色谱系统所使用的流动相成本较低，应用也更为广泛。
定量分析时，为便于准确测量，要求定量峰与其他峰或内标峰之间有较好的分离度。
分离度（R）的计算公式为：R＝ 2[t(R2)-t(R1)] /1.7*(W1＋W2)式中 t(R2)为相邻两峰中后一峰的保留时间； t(R1)为相邻两峰中前一峰的保留时间； W1及W2为此相邻两峰的半峰宽。
除另外有规定外，分离度应大于1.5。
本实验对象为邻苯二甲酸酯，又称酞酸酯，缩写PAE，常被用作塑料增塑剂。
它被普遍应用于玩具、食品包装材料、医用血袋和胶管、乙烯地板和壁纸、清洁剂、润滑油、个人护理用品，如指甲油、头发喷雾剂、香皂和洗发液等数百种产品中。
但研究表明，邻苯二甲酸酯在人体和动物体内发挥着类似雌性激素的作用，是一类内分泌干扰物。
待测物性质见表1。
表1色谱柱测试条件如果要检测不同条件对谱图分离的影响，可按表1配制几种物质的混合溶液，在不同条件下进行HPLC分离检测。
三.仪器与试剂1、仪器Agilent 1100高效液相色谱仪，50ul微量注射器。
2、试剂甲醇（色谱专用），高纯水四. 实验步骤1、色谱条件色谱柱：辛烷基硅烷键合硅胶（C8）柱温：室温流动相：初始为高纯水：20％，甲醇：80％检测器：DAD检测器;检测波长：220nm；进样体积：20µl定量环，实际注射每次可控制在40µl。
实验-高效液相色谱柱效能的测定
实验:高效液相色谱柱效能的测定一、实验目的1.了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理2.学习高效液相色谱柱效能的测定方法二、实验原理高效液相色谱是色谱法的一个重要分支。
与气相色谱相比较，高效液相色谱同样具有高灵敏、高效能和高速度的特点，但它的应用范围更广泛。
据估计在自然界数百万有机化合物中，仅有20%可以不经过化学预处理，直接采用气相色谱分析，而对于总数的75-80%，则可采用高效液相色谱进行分离分析。
特别是许多高沸点、难挥发、热稳定性差的物质，如生物化学制剂、金属有机配合物等物质的分离分析，需要借助于高效液相色谱方法。
液相色谱柱是整个高效液相色谱分离系统的核心。
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式，同样适用于高效液相色谱：n = 5.54 (t R/Y1/2)2R s=2(t R2-t R1)/(Y1+Y2)式中：n—理论塔板数，t R—保留时间Y1/2—半峰宽三、仪器和试剂Agilent-1100高效液相色谱仪（由高压输液泵，高压六通进样阀和UV-Vis检测器组成，）超声波发生器色谱柱：15cm⨯4.6mm I.D.，ODS，5μm流动相：甲醇-水（3+1）样品1：内标标准样。
由下列三种溶液等体积混合：尿嘧啶的甲醇溶液（0.12mg•mL-1），苯的甲醇溶液（0.7mg•mL-1），萘、联苯、菲的甲醇溶液（0.1mg•mL-1、0.1mg•mL-1和0.06mg•mL-1）。
样品2：混合试样：一定量的尿嘧啶、苯、萘、菲溶于甲醇，其中加入内标物联苯（浓度为0.1mg•mL-1）。
、四、实验内容1.准备流动相。
用液相色谱级无水甲醇和二次去离子重蒸水配制流动相1000mL，混合均匀后经0.45μm膜过滤，再用超声波脱气10min。
2.检查色谱各部件的连接是否正确，液路有无泄露。
如一切正常，则可将准备好的流动相加到仪器储液瓶中，并将检测器后面的液路出口置于废液瓶中。
3.接通高压泵和检测器的电源，排除掉液路中的所有气泡。
高效液相色谱柱效的测定
实验一 高效液相色谱柱效的测定目的要求：（1） 学习高效也向色谱柱效的测定方法（2） 了解高效液相色谱仪器基本结构和工作原理，初步掌握其操作技能基本原理：n=5.54(R 12t Y )2=16(R t Y )2 一、仪器1、 ThermoFinnigan 高效液相色谱仪，配有P2000二元泵、SCM1000真空脱气机、UV6000紫外检测器2、 高压六通进样阀3、 微量进样器 25μL4、 超声波清洗器二、试剂1、 苯、萘、甲醇和正乙烷等均为分析纯2、 由Millipore 超纯水发生器制得18.2m Ω 超纯水3、 标准溶液配制（1） 标准储备液：配制含苯、萘各1000μg/mL 的正乙烷溶液，混匀备用。
（2） 标准使用液：用上述储备液配制含苯、萘各10μg/mL 正乙烷溶液，混匀备用三、实验条件1、 色谱柱：4.6⨯250 mm C 18 柱，键合相粒度为5 μm2、 流动相：甲醇：水＝4:1；流速：0.5 mL/min 、1mL/min3、 柱温：室温4、 紫外检测器：检测波长254 nm5、 进样量： 5μL四、实验步骤1、 添加流动相2、 根据实验条件，按照仪器的操作步骤调节至进样状态（流速0.5 mL/min ），待仪器液路和电路系统达到平衡，基线平直时即可进样。
3、 吸取5μL 标准使用液进样记录色谱图，重复进样2次4、 将流动相流速改为1mL/min ，稳定后吸取5μL 标准使用液进样记录色谱图，重复进样2次五、数据及处理1、记录实验条件（1） 色谱柱与固定相（2） 流动相及其流量（3） 柱温（4） 进样量2、测量各色谱图中苯、萘的保留时间t R 及相应色谱峰的半峰宽Y 1/2，计算各理论塔板数n思考题1、由本实验计算得到的各组分理论塔板数说明什么？2、高效液相色谱采用5~10 m粒度的固定相有什么优缺点，同时它又给实验带来什么问题，如何克服？3、紫外检测器是否适用于所有的有机化合物，为什么？若实验获得的色谱峰太小，你应该如何改善实验条件？。
高效液相色谱仪的性能检查
高效液相色谱仪的性能检查一、实训目标 1．了解HPLC仪器的基本构造和工作原理，把握高效液相色谱仪的基本操作； 2．认识高效液相色谱仪仪器性能检查的项目和办法； 3．把握液相色谱柱性能指标（如理论塔板数、峰不对称因子、柱的反压等）的测定办法，学会判别其性能优劣。
二、实训原理 1．高效液相色谱仪的性能指标 (1)流量精度仪器流量的精确性，以测量流量与指示流量的相对偏差表示。
(2)检测限本试验用法紫外检测器，其检测限为某组分产生的信号大小等于2倍噪声时，每毫升流淌相所含该组分的量。
(3)定性重复性在同一试验条件下，组分保留时光的重复性，通常以被分别组分的保留时光之差的相对标准偏差来表示（RSD≤1％认为合格）。
(4）定量重复性在同一试验条件下，组分色谱峰峰面积（或峰高）的重复性，通常以被分别组分的峰面积的相对标准偏差来表示（RSD≤2％认为合格）。
2．液相色谱柱的性能指标一支色谱柱的好坏要用一定的指标来举行评价。
通常评价色谱柱的主要指标包括：理论塔板数N；峰不对称因子；两种不同溶质的挑选性（(a)；色谱柱的反压；键合固定相的浓度；色谱柱的稳定性等。
一个合格的色谱柱评价报告起码应给精彩谱柱的基本性能参数，如柱效能（即理论塔板数N)、容量因子k、分别度R、柱压降等。
评价液相色谱柱的仪器系统应满足相当高的要求：一是液相色谱仪器系统的死体积应尽可能小；二是采纳的样品及操作条件应该合理，在此合理的条件下，评价色谱柱的样品可以彻低分别并有适当的保留时光。
不同类型色谱柱性能评价所需的样品与所采纳的操作条件是不同的，可查阅相关参考资料。
三、实训仪器与试剂 1．仪器 PE200型高效液相色谱仪或其他型号液相色谱仪（一般配置，带紫外检测器）；TC4色谱工作站或其他色谱工作站；色谱柱［PEBrownleeC18反相键合相色谱柱（5μm,4.6mmi.d.×150mm)];100μL平头微量注射器；超声波清洗器；流淌相过滤器；无油真空泵；容量瓶等玻璃仪器。
实验一 高效液相色谱柱效能的评价
高效液相色谱柱效能的评定1. 实验目的和要求1.1了解高效液相色谱仪的基本结构。
1.2初步掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。
1.3学习高效液相色谱柱效能的评定及分离度的测定方法。
2. 实验原理苯、萘、联苯分子非极性部分的总表面积不同，缔合能力不同，其保留时间也不同。
通过计算色谱峰的理论塔板数以及各个化学物质间的分离度评价色谱柱的效能。
3. 实验仪器与试剂3.1 仪器高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器）分析天平3.2 试剂苯、萘、联苯（均为分析纯）甲醇（色谱纯）纯净水4. 实验步骤4.1 色谱条件色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm流动相：甲醇-水（80：20，v/v）流速：1mL·min-1检测波长：254nm柱温：30℃进样量：10μL4.2 操作步骤分别精密配制含苯、萘、联苯浓度均为约1mg·mL-1的3份对照品溶液各10mL。
● 分别精密吸取上述对照品溶液各2mL 置于10mL 容量瓶中，加流动相稀释，并定容至刻度，摇匀，得到含苯、萘、联苯的混合对照品溶液。
● 按照上述色谱条件操作，进样，记录色谱图。
● 计算各色谱峰的理论塔板数及各峰间分离度。
4.3 实验数据处理● 记录实验条件，测试各试样后记录苯、萘、联苯的保留时间、峰宽、半峰宽，计算出各物质对应的理论塔板数。
根据保留时间与峰宽信息，计算相邻物质对间的分离度。
● 柱效计算式中：t R 为峰值保留时间（min ），W 1/2为半峰宽（min ），W 为峰宽（min ）●式中：t R1和t R2分别为相邻两组分的峰值保留时间（min ）W 1和W 2分别为相邻两组分色谱峰的峰宽（min ）5. 问题与讨论2212)(54.5)(16W t W t n R R ==5.1 如何用实验方法判别色谱图上苯、萘、联苯的色谱峰归属？5.2 如何改变色谱条件，可以减小苯、萘、联苯的保留时间？5.3若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改变实验条件以获得改善？。
实验八 高效液相色谱柱效能的测定
实验八 高效液相色谱柱效能的测定一、目的要求（1）学习高效液相色谱柱效能的的测定方法；（2）了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，初步学习操作方法。
二、实验原理对色谱体系，色谱柱的柱效能，可以定量地用理论塔板数N 来表示：222/1)(16)(54.5Yt Y t N R R == 速率理论及范弟姆特方程式对于研究影响HPLC 柱效的各种因素，同样具有指导意义：Cu uBA H ++= 由于组分在液体中的扩散系数很小，纵向扩散项（uB）对色谱峰扩展的影响可以忽略，而传质阻力项Cu 则成为影响柱效的主要因素。
因此，提高柱内填料装的均匀性和减小粒度，以加快传质速率，可以提高柱效能。
除上述因素以外，还应考虑一些柱外展宽的因素，其中包括进样器的死体积和进样技术等所引起的柱前展宽，以及由柱后联结管、检测器流通池体积所引起的柱后展宽。
三、仪器与试剂1.仪器 岛津LC-10A ( Shimadzu, Japan)高效液相色谱仪，SPD-10A 紫外可见波长检测器和SCL-10ASP 色谱数据处理器(日本岛津公司)。
超声波清洗器2.试剂 甲苯、萘、联苯、甲醇（色谱醇）、正已烷 （A.R ）. 标准溶液配制（1）甲苯标准储备液(1.0000 g ⋅L -1) 准确称取0.0100ｇ甲苯,在10mL 容量瓶中用正己烷定容。
（2）萘标准储备液(1.0000 g ⋅L -1) 准确称取0.0100ｇ萘，溶于正己烷中，在10mL 容量瓶中用正己烷定容。
（3）联苯标准储备液(1.0000 g ⋅L -1) 准确称取0.0100ｇ联苯，溶于正己烷中，在10mL 容量瓶中用正己烷定容。
（4）甲苯标准使用液，吸取上述甲苯标准储备液0.3 mL 、0.6 mL 、0.9 mL 、1.2 mL 、1.5 mL ，于10mL 容量瓶中用正己烷定容。
（5）萘标准使用液，吸取上述萘标准储备液0.3 mL 、0.6 mL 、0.9 mL 、1.2 mL 、1.5 mL ，于10mL 容量瓶中用正己烷定容。
分析实验报告 高效液相色谱
华南师范大学实验报告学生姓名：杨秀琼学号：20082401129专业：化学年级班级：08化二课程名称：仪器分析实验实验项目：液相色谱分析混合样品中的苯和甲苯实验类型：综合实验时间：2010/416一、[实验目的:]1、掌握高效液相色谱定性和定量分析的原理及方法2、了解高效液相色谱的构造、原理及操作技术二、[实验原理:]高效液相色谱法：以液体作为流动相的色谱法。
它是在经典液相色谱实验基础上，引入气相色谱的理论，在技术上采用高压输液泵，高效固定相和高灵敏的检测器，而发展起来的快速分离分析技术。
具有分离效能高，检出限低，操作自动化和应用范围广的特点。
其基本原理：利用欲分配的诸组分在固定相和流动相间的分配有差异（即由不同的分配系数），当两相做相对运动时，这些组分在此两相中分配反复进行，从几千次到百万次，即使组分的分配系数只有微小差异，随着液体流动相却可以有明显的差异，最后使这些组分都得到分离，通过检测器时，样品浓度被转换成电信号传送到记录仪。
三、[仪器和试剂:]1.主要仪器：岛津液相色谱仪(LC-10AT)[配有紫外检测PhenomenexO柱]；10μL微量注射器2、试剂：甲醇、水苯和甲苯混合待测溶液苯标准溶液：2.0μL/mL甲苯标准溶液：2.0μL/mL苯、甲苯混合标准溶液：1.0μL/mL、2.0μL/mL、5.0μL/mL、10.0μL/mL 四、[实验步骤]1、按操作规程开机。
2、.选择合适的流动相配比，优化色谱条件通过调节溶剂甲醇和水的混合比例，从而来优化色谱调剂。
调好最佳色谱条件，控制流速为1ml/min 。
柱温30℃，检测波长354nm 3、苯、甲苯定性分析在最佳条件下，待基线走稳后，用10μL 微量注射器分别进样10μL 苯和 甲 苯混合待测溶液，10μL 苯标准溶液（2.0μL/mL）和10μL 甲苯标准溶液（2.0μL/mL）(微量注射器用甲醇润洗3～5遍)，观察并记录色谱图上显示的保留时间，确定苯和甲苯的峰。
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高效液相色谱柱效能的评定
1. 实验目的和要求
1.1了解高效液相色谱仪的基本结构。
1.2初步掌握高效液相色谱仪的基本操作方法。
1.3学习高效液相色谱柱效能的评定及分离度的测定方法。
2. 实验原理
苯、萘、联苯分子非极性部分的总表面积不同，缔合能力不同，其保留时间也不同。
通过计算色谱峰的理论塔板数以及各个化学物质间的分离度评价色谱柱的效能。
3. 实验仪器与试剂
3.1 仪器
高效液相色谱仪（带自动进样器，或配置微量进样器）
分析天平
3.2 试剂
苯、萘、联苯（均为分析纯）
甲醇（色谱纯）
纯净水
4. 实验步骤
4.1 色谱条件
色谱柱：C18，4.6×150mm，5μm
流动相：甲醇-水（80：20，v/v）
流速：1mL·min-1
检测波长：254nm
柱温：30℃
进样量：10μL
4.2 操作步骤
分别精密配制含苯、萘、联苯浓度均为约1mg·mL-1的3份对照品溶液各10mL。
● 分别精密吸取上述对照品溶液各2mL 置于10mL 容量瓶中，加流动相稀
释，并定容至刻度，摇匀，得到含苯、萘、联苯的混合对照品溶液。
● 按照上述色谱条件操作，进样，记录色谱图。
● 计算各色谱峰的理论塔板数及各峰间分离度。
4.3 实验数据处理
● 记录实验条件，测试各试样后记录苯、萘、联苯的保留时间、峰宽、半
峰宽，计算出各物质对应的理论塔板数。
根据保留时间与峰宽信息，计算相邻物质对间的分离度。
● 柱效计算
式中：t R 为峰值保留时间（min ），W 1/2为半峰宽（min ），W 为峰宽（min ）
●
式中：t R1和t R2分别为相邻两组分的峰值保留时间（min ）
W 1和W 2分别为相邻两组分色谱峰的峰宽（min ）
5. 问题与讨论
2
2
1
2)
(54.5)(16W t W t n R R ==
5.1 如何用实验方法判别色谱图上苯、萘、联苯的色谱峰归属？
5.2 如何改变色谱条件，可以减小苯、萘、联苯的保留时间？
5.3若实验中的色谱峰无法完全分离，应如何改变实验条件以获得改善？。