葡聚糖凝胶层析实验报告
凝胶层析分离血红蛋白与鱼精蛋白
析、离子交换层析、亲和层析、高效液相
色谱等都通常采用柱层析形式。 薄层层析主要适用于小分子物质的快速检 测分析和少量分离制备，通常为一次性使 用。
吸附层析
原理：任何两个相都可以形成表面，其中一个相的物质或溶解在其中的溶质在
此表面密集现象称为吸附，利用吸附剂对不同物质具有不同吸附力使混合物得 到分的现象就叫吸附层析。 凡能将其他物质聚集到自己表面的物质称吸附剂，包括硅皮、氧化铝、活性炭、 淀粉、纤维素及陶土，而聚集于聚集于吸附剂表面的物质称被吸附剂。 吸附剂与被吸附剂之间的作用除了物理作用外，还有化学作用，如 DNS-氨基酸 双向聚酰胺薄膜层析时中被分离的物质之所以能吸附在聚酰胺薄膜上就是由于 二者之间形成氢键。
凝胶层析的基本概念
外水体积是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，也就是凝胶颗粒间液体流动相的体
积。
内水体积是指凝胶颗粒中孔穴的体积，凝胶层析中固定相体积就是指内水体积。
基质体积是指凝胶颗粒实际骨架体积。
柱床体积就是指凝胶柱所能容纳的总体积。 洗脱体积是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。我们设柱床体积为 Vt，
录红色流出一半时的毫升数（血红蛋白的Ve，也即Vo），继续收集，记录黄色流
出一半时体积（鱼精蛋白Ve）；
① 被分离物质本身的性质；
② 固定相和流动相的性质； ③ 层析柱的温度。
葡聚糖凝胶Sephadex G–25柱层析法脱盐分离蛋白质实验技术总结
完全排阻
完全渗入
居中流出
交联葡聚糖凝胶（商品名为 Sephadex)
这是由葡萄糖的多聚物与1–氯– 2、 3–环氧丙烷交连而成。环氧丙烷引入丙三 醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来， 凝胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环 氧丙烷的比例（交联度）来控制。
常以G–10至G–200号码标记
G： 反应凝胶的交联程度、膨胀程度等 G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶） 乘以10所得的值。 如G–25即表示吸水量为2.5ml/1g干胶。
6. 检测
在收集的同时，用 20%磺酰水扬酸检 测；加入奈氏试剂检测蛋白质中的硫酸铵， 蛋白管中不出现棕色。 合并纯化后的蛋白质管以待用。以光密 度值为纵坐标（紫外检测，因时间长） ，以 收集管的顺序号为横坐标，在坐标纸上绘图。 可获具有一条洗脱峰的曲线，称为洗脱曲线， 用以表示被分离物质流出的状态。
可见，不同类型的各种凝胶溶涨所需 的最少时间是不相同的，请参考有关的技 术数据。 在凝胶溶涨的处理过程中，不能进行 剧烈搅拌，禁止使用电磁搅拌器，以为这 样会使凝胶颗粒破裂而产生碎片。
2. 装柱
将层析剂装入柱中进行层析的方法称 柱层析法。 作层析用的柱子称层析柱。 柱子的一 端为进口，另一端为出口，出口端底部有 烧结玻璃砂板 ，能阻止层析剂流出，溶剂 则可流过。 层析柱的长短粗细根据实验的 目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长， 分离效果越好。但柱过长，层析时间长， 样品易稀释造成扩散。
5 葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
葡聚糖凝胶柱层析 分离纯化蛋白质
教学目标
了解：层析技术的基本原理;
有效分配系数Kav的计算。
理解：葡聚糖凝胶的选择和准备。 掌握：凝胶层析的原理和操作方法;
注意事项
① 装柱时需保持柱体垂直于水平面，在平衡完毕前 不可随意晃动层析柱，以保持凝胶柱表面平整。
② 实验过程中需密切注意保持层析柱中的凝胶始终 处于蒸馏水中，防止蒸馏水排空。
③ 移液器使用： 选择适当量程 正确安装枪头
吸液第一档，放液第二档 垂直吸液，慢吸慢放 吸液后不可将枪平放
使用完后调至最大量程
小结
1. 凝胶层析的原理：混合物随流动相经过装有凝胶作为固定 相的层析柱时，各组分因分子大小不同而被分离。
2. 凝胶层析分配系数：被分离的化合物被凝胶排阻的程度。 Kav = （Ve — Vo）/（Vt — Vo）
3. 葡聚糖凝胶柱层析：葡聚糖凝胶为多孔网状高分子化合物 及交联度G的意义。
4. 掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作。 5. 实验结果
积Ve有关：
Kav = （Ve — Vo）/（Vt — Vo）
Vt和Vo恒定，Ve随分离物分子量的变化而变化
凝胶层析法测定蛋白质分子量
凝胶层析法测定蛋白质的分子质量
【实验原理】
凝胶层析法（即凝胶过滤法，gel filtration）是利用凝胶的分子筛作用把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析法（molecular sieve chromatography），排阻层析法（exclusion chromatography）。凝胶本身是一种分子筛，可以把分子按不同大小进行分离，好象过筛可以把大颗粒与小颗粒分开一样。但这种“过筛”与普通的过筛不一样。将凝胶颗粒在适宜的溶剂中浸泡，使充分吸液膨胀，然后装入层析柱中，加入欲分离的混合物，再以同一溶剂洗脱。在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进入凝胶内部，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。
凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质，不论是天然凝胶还是人工合成凝胶，它们的内部都具有很微细的多孔网状结构。凝胶层析法常用的天然凝胶是琼脂糖凝胶（agarose gel，商品名Sepharose）；人工合成的凝胶是聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio-gel-P）和葡聚糖（dextran）凝胶（商品名称为Sephadex）的各种交联凝胶，它们是具有不同孔隙度的立体网状结构的凝胶，不溶于水。
这种聚合物的立体网状结构，其孔隙大小与分离物质分子的大小有相应的数量级。在凝胶充分溶胀后，交联度高的，孔隙小，只有相应的小分子可以通过，适于分离小分子物质。相反，交联度低的孔隙大，适于分离大分子物质。利用这种性质可分离不同M r的物质。
凝胶层析分离丙种球蛋白与核黄素
Sephadex G 葡聚糖凝胶特点：1、经典的葡聚糖和环氧丙烷偶联介质，拥有极高的流速2、多种不同的分离范围，提供了广泛的选择性。葡聚糖凝胶是一种珠状的凝胶，含有大量的羟基，很容易在水中和电解质溶液中溶胀。G型的葡聚糖凝胶有各种不同的交联度，因此它们的溶胀度和分级分离范围也有所不同。葡聚糖凝胶的溶胀度基本上不因盐和洗涤剂的存在而受影响。
四、凝胶层析分离丙种球蛋白与核黄素
1．原理凝胶过滤是广泛应用于蛋白质、酶、核酸等生物高分子分离分析的有效方法之一，它是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析方法。此类层析的固相载体是具有分子筛性质的凝胶，目前使用较多的是具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶(商品名为Sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(商品名为Biogel)以及琼脂糖凝胶(商品名为Sepharose)，此外还有这些凝胶的各类衍生物。本实验以葡聚糖凝胶为例，学习凝胶过滤的一般原理及方法。葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖苷)和甘油基以醚桥(一p～CH2CH—CH2一p一)loH形式相互交联形成三维网状结构的一种水不溶性物质。通过控制交联剂环氧氯丙烷和葡聚糖的配比以及交联时的反应条件可控制交联度而获得具有不同“网眼”的凝胶。“网眼”的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围，可分离的分子量从几百到数十万不等。由于凝胶骨架中的多糖链含有大量OH基，因此凝胶具有极强的亲水性，能在水和电解质溶液中膨胀，凝胶的交联度越大，孔径和吸水量越小，因而膨胀度也愈小。不同型号的交联葡聚糖用G表示(如G一25，G一100等)，G后面的数字为凝胶的吸水量(mL水／g于胶)乘以10得到的数，如G一25即表示此型号凝胶吸水量是2．5mL／g干胶。根据交联度的高低，Sephadex分为G10—200，号越高，凝胶孔径越大。其物理特性如下表：
05 实验五 葡聚糖凝胶层析
实验五. 葡聚糖凝胶层析
【实验目的】
1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。
2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。
【实验原理】
凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。
葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。可分离的分子量范围从几百到几十万不等。
葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。
本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。
分子医学技能：实验六 凝胶过滤层析法分离生物大分子
Baidu Nhomakorabea验试剂:
✓ 玻璃层析柱 125cm ✓ 交联葡聚糖 G-50 (Sephadex G-50) ✓ 洗脱液
实验操作
1）预装层析柱(示教,注意：不要干柱)
2）柱的平衡
洗脱缓冲液持续低速过柱，直至凝胶均匀压缩，约 20cm高（不要干柱）。
260nm处的光吸收值也不尽相同，不同蛋白质中的酪氨酸 和色氨酸含量有差异，故计算结果有一定误差。如果设定 标准管，则应与测定管的蛋白质氨基酸组成应相似，以减 小误差。
▪ [器材] UV-722型紫外分光光度计
▪ [试剂] (一) 蒸馏水 (二) 清蛋白(人或牛)纯晶 (三) 待测样本蛋白质
操作步骤
组分的理化性质（吸附力、分配系数、 电荷、分子量、亲和力等）的差异， 使其在流动相的作用下通过固定相时 的移动速度不同，从而达到相互分离 的目的。
固定相：固定不移动的一相，一般是指支持物中所
含的水分。阻止所分离的样品向前移动 （阻力）
流动相： 洗脱时所用的溶剂，也叫洗脱液。不断地
前移，并带动所分离的样品向前移动（动 力）
3）上样
控制液面，使其恰好平床表面，关闭出口，用吸管 小心把样品沿管壁加入，打开出口，让样品液面降 低至床表面（不要干柱） 。
4）洗脱与收集
葡聚糖凝胶层析实验报告
葡聚糖凝胶层析实验报告
一、实验目的
1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；
2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排
阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水
体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的
筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出
柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小
分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这
些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶
层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂
1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤
1、装柱
将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让
柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样
装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集
打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
葡聚糖凝胶柱层析
4. 上样
5. 洗脱与收集
将待分离样品溶解在少量洗脱液中，沿柱 内壁缓慢加入，避免冲击凝胶表面。
开启恒流泵，以恒定流速进行洗脱，同时 用收集器按一定时间或体积收集流出液。
6. 检测与记录
7. 结果分析
对收集到的流出液进行适当稀释后，利用 紫外可见分光光度计或酶标仪等检测目标 物质的含量，并记录数据。
葡聚糖凝胶柱层析
目录
• 葡聚糖凝胶柱层析基本原理 • 实验材料与方法 • 葡聚糖凝胶柱层析在生物大分子分离中应
用 • 葡聚糖凝胶柱层析在药物分析中应用 • 葡聚糖凝胶柱层析在环境科学中应用 • 实验结果分析与讨论
01 葡聚糖凝胶柱层析基本原 理
葡聚糖凝胶结构与性质
三维网状结构
葡聚糖凝胶具有三维的交联网状 结构，这种结构允许小分子进入 凝胶内部，而大分子则被排除在
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实验误差来源及改进措施
误差来源分析
分析实验过程中可能出现的误差来源，如样 品处理不当、操作不规范、仪器故障等。
改进措施提出
针对误差来源，提出相应的改进措施，如优化样品 处理方法、规范实验操作、定期维护和校准仪器等 。
实验方案优化
根据实验结果和误差分析，对实验方案进行 优化和改进，提高实验的准确性和可重复性 。
环境样品分析
葡聚糖凝胶柱层析技术可用于环境样品中复杂组分的分析， 如土壤、水样、大气颗粒物等，为环境科学研究提供丰富 的数据支持。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质ppt课件
气-固层析 气相层析
层析
液相层析
气-液层析 液-固层析
液-液层析
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
层析的分类
二、按操作方式分类
1 柱层析
1
22 纸层析
3 薄层层析
4
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
教学重点：
凝胶层析的原理和实验步骤。
教学难点：
掌握装柱、加样、洗脱、收集样品的操作步骤。
教学对象：
临床医学五年制本科
经营者提供商品或者服务有欺诈行为 的，应 当按照 消费者 的要求 增加赔 偿其受 到的损 失，增 加赔偿 的金额 为消费 者购买 商品的 价款或 接受服 务的费 用
使用教材：
《生物化学与分子生物学实验技术》，杨安钢主 编，高等教育出版社，2008年第1版
参考资料：
《生物化学》，贾弘褆主编，人卫出版社，2005 年第1版
葡聚糖凝胶柱的使用方法
葡聚糖凝胶柱的使用方法：
1 预处理
称取Sephadex G-2550－100目约5g,加入蒸馏水100ml,置室温下3h进行溶胀;
2 装柱
凝胶层析柱的直径与柱长之比一般为1:15;柱的底部用装有细玻璃管的橡皮塞塞紧,用洗净的玻璃丝约200目尼龙布垫底或购买类似规格的商品柱;然后将柱垂直安装好,先加入1/3柱体积蒸馏水,接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入,使它们在柱内自然沉降;同时大开下口慢速流出蒸馏水;装柱后的凝胶必须均匀,不能有气泡或明显条纹;否则,必须到出重装,装好后,用蒸馏水平衡2－3h即可加样品分离;
3 加样
加样前,首先把柱内凝胶上面多余的蒸馏水放出,直到柱内液面与凝胶表面相齐或留一极薄液层为止;然后,由柱的上端加水解液2ml,注意不要让溶液把凝胶冲松浮起,加完样品后,打开下口缓慢放出液体至液面与凝胶面相齐,再用少量蒸馏水冲洗原来盛样品的容器2－3次,待全部进入层析柱后,即可进行洗脱;
4 洗脱与收集
洗脱时,用蒸馏水作洗脱剂,并且要连续不断地进行,使凝胶柱上端保持一定的液层,防止凝胶柱表面的液体流干;本实验洗脱液流出的速度应控制在－min;洗脱液的收集采用分管连续顺序收集,每管收集3ml,共收集10管;据经验,4或5号管核苷酸浓度最大,可作为层析鉴定的样品液;但因层析柱长度的差异,管号会有变化,必要时可用紫外检测A260nm,找出浓度最大的管号;
5 凝胶的再生和回收
凝胶柱使用一次后,必须反冲疏松一次,平衡后再使用;若使用数次,就需要再生处理;用L L NaCl 溶液浸泡,然后用蒸馏水洗至中性备用;若实验完毕,将再生后的凝胶在布氏漏斗上用蒸馏水洗涤抽干,再用95%乙醇洗两次,在60℃烘箱中烘干,回收保存;
凝胶层析技术——葡萄糖凝胶的使用
凝胶层析技术——葡聚糖凝胶的使用
摘要：本文综述了凝胶层析技术中所使用的葡聚糖凝胶的使用方法，及注意事项。关键词：凝胶层析，葡聚糖凝胶，使用，注意事项
引言：凝胶层析又称为凝胶排阻层析、分子筛层析、凝胶过滤、凝胶渗透层析等。1959年，Porath和Flodin 首次用一种多孔聚合物——交联葡聚糖凝胶作为柱填料，分离水溶液中不同分子量的样品，成为凝胶过滤。1964年，Moore制备了具有不同孔径的交联聚乙苯烯凝胶，能够进行有机溶剂中的分离，成为凝胶渗透层析（流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析）。随后这一技术得到不断的完善和发展，目前广泛应用于生物化学、高分子化学等很多领域。此项技术中，凝胶的选择尤为重要，因此凝胶的使用及使用时的注意事项尤为重要。
1、凝胶层析原理
凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，他们经历的流程短，流动速度快，所以先流出；而较小的分子则可以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢，所以最后流出；而分子大小介于两者之间的分子在流动中部分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于两者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。
实验六凝胶过滤层析
一 实验原理
所以随着溶质分子尺寸的减小，其占有 孔隙体积迅速增加。当具有一定分子量 分布的高聚物溶液从柱中通过时，由于 溶质分子在孔隙中溶剂与颗粒溶剂之间 进展扩散分配的差异造成较小的分子在 柱中停留的时间比大分子停留的时间要 长，所以整个样品按分子大小顺序而分 开，最先洗脱出来是最大的分子。
一 实验原理
实验 六 凝胶过滤层析
一 实验原理
凝胶层析是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相， 由于在层析过程中样品不同的蛋白质具有不同的洗脱， 使不同的分子量的组分得以别离的层析方法。凝胶层 析的别离过程是在装有多孔物质如交联聚苯乙烯、多 孔玻璃、多孔硅胶、交联葡聚糖等填料的柱中进展的。
凝胶层析实验步骤及细节
温州大学第四届生物学科实验技能大赛
血清凝胶层析
实验成绩：实验过程＋实验结果＋实验报告
实验时间：5月6日（周日）8:50到10B正门集合，上午9:00至12:00左右分离器使用指导及凝胶装柱。下午1:30开始血清离心操作及层析操作。
实验前：身穿实验服，用蒸馏水清洗实验器具
实验后：清理实验器具
凝胶层析的实验步骤
实验试剂和用品
1. 试剂
Sephandex 4B 凝胶（凝胶颗粒）、5%重铬酸钾、5%蓝葡聚糖、生理盐水
2. 主要实验用具
铁架台（滴定台架）、凝胶柱（层析柱）（10×1.0cm）、螺丝夹、移液管、烧杯、胶头滴管、试管（20个）、试管架、玻璃棒
凝胶层析定义
凝胶层析又称凝胶过滤，分子筛层析或排阻层析。它的突出优点是凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂。凝胶层析是按照蛋白质分子量大小进行分离的技术。
凝胶是一种具有多孔、网状结构的分子筛。利用这种凝胶分子筛对大小、形状不同的分子进行层析分离，称凝胶层析。
分子大小彼此相差25%的样品，只要通过单一凝胶床就可以完全将它们分开。
实验原理
不同类型凝胶的筛孔的大小不同。如果将这样的凝胶装入一个足够长的柱子中，作成一个凝胶柱。当含有大小不同的蛋白质样品加到凝胶柱上时，比凝胶珠平均孔径小的蛋白质就要连续不断地穿入珠子的内部，这样的小分子不但其运动路程长，而且受到来自凝胶珠内部的阻力也很大，所以越小的蛋白质，把它们从柱子上洗脱下来所花费的时间越长。凝胶中只有很少的孔径可接受大的蛋白。因此，大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来。凝胶过滤所用的凝胶孔径大小的选择主要取决于要纯化的蛋白质分子量。
实验五葡聚糖凝胶柱层析分离纯化蛋白质
二、装柱
1. 取层析柱，将层析柱固定在 支架上，调整层析柱与水平 面垂直。 2. 烧结板下端的死区用蒸馏水 充满（注意：不得留有气泡， 可多加约1cm高水层，使柱 1cm 内凝胶通过沉积作用更加均 砂芯 匀），然后关闭层析柱的出 口。
3. 将凝胶悬液沿玻璃棒小心地徐徐灌 入柱中，待底部凝胶沉积1-2cm时， 再打开出口，继续加入凝胶悬液至 凝胶沉积约15cm高度即可（注意： 凝胶悬液尽量一次加完，以免出现 分层的凝胶带）。 4. 新柱装好后，加3-5倍体积蒸馏水流 过柱床，然后平衡10min。（注意： 始终层析柱与水平面垂直）
三、加样与洗脱
1. 加样时先将柱的出口打开，让蒸馏水逐渐流出， 待凝胶床面只留下极薄的一层蒸馏水时，关闭出 口（注意：不可使凝胶柱表面干涸）。 2. 用移液器将200µ l样品小心加到凝胶床表面（注意： 加样时滴管垂直伸入柱内，接近液面处集中滴加， 动作要轻柔，不要将床面冲起，亦不要沿柱壁加 入）。 3. 然后打开出口，使样品进入柱床面，滴加1~2倍样 品体积的蒸馏水（沿管壁轻柔滴加），待完全流 入柱床内后，再加蒸馏水进行扩展洗脱，直到两 条区带分开为止。
2. 特点
化学性质：
在水溶液、有机溶液、盐溶液中都较稳定。
在强碱和高温下易发生分解。
聚丙烯酰胺凝胶不带电荷，吸附效应小。 商品出售的聚丙烯酰胺凝胶为干凝胶形式， 使用前需溶胀。凝胶的型号见教材P18
凝胶过滤层析
【实验目的】
掌握凝胶过滤层析的原理及操作方法
【实验原理】
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
1、器材：核酸蛋白检测仪、层析柱、水浴锅、真空泵
2、试剂：SephadexG-25
【实验步骤】
（1）凝胶的选择：在经过膜分离后，分子量<5000。本次实验选用G-25葡聚糖凝胶（分离范围1000-5000）。
（2）柱子的选择：分子量<5000，膜分离后玉米肽中不同的小肽分子量比较接近，属于分级分离，所以选用50*1.6规格的柱子。
（3）干凝胶用量的计算：柱子体积/膨胀度，G-25膨胀度是4~6。
（4）凝胶的预处理：
将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。可以用玻璃棒搅拌，但是不能剧烈，防止凝胶破裂。多洗几次，尽量洗干净。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。充分溶胀后，进行真空脱气。
（5）洗脱液的选择：本实验采用蒸馏水做洗脱液。
（6）凝胶的填充：将层析柱与地面垂直固定在架子上，然后将处理好的凝胶倒入柱子里，不能有气泡，要防止干柱。
（7）柱平衡：装柱完成后，用洗脱液来平衡柱子，直至核酸蛋白检测系统基线保持水平半个小时以上。
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葡聚糖凝胶层析实验报告
一、实验目的
1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；
2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。
二、实验原理
凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。
对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排
阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水
体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的
筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。
分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出
柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子与小
分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这
些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶
层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
三、仪器、材料和试剂
1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。
2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。
四、实验步骤
1、装柱
将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。
2、上样
装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。
3、洗脱和收集
打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。
4、样品的检测
收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。
五、实验结果及分析
1、实验结果：
2、蛋白质样品洗脱曲线：
收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：
流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。