Taq酶的制备

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Taq DNA聚合酶的热纯化制备

Taq DNA聚合酶的热纯化制备丁燕华;刘树涛;齐庆远【摘要】[ Objective ] The paper was to improve the preparation efficacy of Taq DNA polymerase. [ Method ] Ni column was used to purify Taq DNA polymerase carrying with 6xHis tag, and recombined vector. Using the thermal -resistant characteristics of TaqDNA polymerase, the crude extract was treated at 75 ℃ for 1 h, and the activity of prepared enzyme solution was verified by PCR test. [ Result] The recombinant pET-32A-Taq could highly express in BL21 (DE3) host bacteria and remove hybrid protein by thermal denaturation. The enzyme preparation with the activity further higher than purchased TaqDNA polymerase was obtained. [ Conclusion ] Taq DNA polymerase prepared by thermal purification method is simple with low cost, and can meet the needs of a large number of conventional PCR amplification.%[目的]提高Taq DNA聚合酶的制备效率.[方法]利用Ni柱亲和色谱纯化载有6xHis标记的Taq DNA聚合酶,并重组载体,利用Taq DNA聚合酶的耐热特性,对粗提液75℃处理1h,之后通过PCR试验验证制备酶液的活力.[结果]所获重组的pET-32A-Taq能够在BL21(DE3)宿主菌中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白,获得了活力远高于购买的Taq DNA聚合酶的酶制剂.[结论]使用热纯化法制备的Taq DNA聚合酶工艺简单,成本较低,能满足常规大量PCR实验要求.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)017【总页数】3页(P10153-10155)【关键词】Taq DNA聚合酶;热纯化;pET-32A;BL21(DE3)【作者】丁燕华;刘树涛;齐庆远【作者单位】浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004;浙江师范大学化学与生命科学学院,浙江,金华,321004【正文语种】中文【中图分类】Q786Taq DNA聚合酶由水生嗜热菌(Thermus aquatics)YT-1菌株中分离而得。

Axygen Taq 酶产品说明书

11/02 Ver.1爱思进生物技术（杭州）有限公司电话：0571-******** 传真：0571-******** E-mail: technical@ 仅限于实验室研究和体外实验研究。

Axygen Taq 酶产品说明书产品组成：AP-TAQ-M-5 Taq polymerase 500U (5 U/µl) 100 μl 10×PCR Buffer (Mg 2+-Free) 2×1.2 ml 25 mM MgCl 2 Buffer 2×1.2 mldNTP Mixture (各10 mM) 400 µl产品组成：AP-TAQ- 5Taq polymerase 500U (5 U/µl) 100 μl 10×PCR Buffer (Mg 2+-plus) 2×1.2 mldNTP Mixture (各10 mM)400 µl注：经常使用避免反复冻融。

产品说明：本制品是94KDa 的耐热性Taq DNA 聚合酶(简称Taq 酶)。

基因来源为Thermus aquaticus DNA polymerase ，将其克隆到大肠杆菌中进行表达后，经分离提取而得到的。

其具有与天然Taq DNA 聚合酶相同的功能。

Taq 酶可以催化5’至3’方向的依赖于DNA 模板的脱氧核苷酸的聚合。

Taq 酶不具有3’到5’的外切酶活性。

活性定义：用活化的大马哈鱼精子DNA 作为模板/引物，在74℃下，30分钟内，将10nmol 的全核苷酸转化为酸性不溶物所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。

纯度：1)将10U 的酶与1μg λDNA 在50μl 反应体系中，25℃反应8小时，45℃反应4小时，74℃反应4小时，DNA 电泳条带不发生变化。

2) 将10U 的酶与1μg 超螺旋DNA(ΦX174 RFI DNA)在50 µl 反应体系中，25℃反应8小时，45℃反应4小时，74℃反应4小时，DNA 电泳条带不发生变化。

taq酶冻干工艺

taq酶冻干工艺Taq酶冻干工艺是一项重要的生物技术方法，广泛应用于分子生物学领域。

它以Taq酶为主角，通过冻干技术将其保存和利用，以实现高效、稳定的DNA扩增。

下面将从冻干工艺的原理、应用以及优势等方面进行阐述。

我们来了解一下Taq酶冻干工艺的原理。

Taq酶是一种从热泉中分离出的热稳定酶，具有较高的耐热性和DNA聚合酶活性。

在PCR （聚合酶链式反应）实验中，Taq酶起到了关键的作用，它能够在高温下扩增DNA模板，从而实现对DNA的复制。

然而，Taq酶的活性易受到环境条件的影响，如温度、湿度等。

为了保证Taq酶的活性和稳定性，科学家们开发出了冻干工艺。

冻干工艺的步骤相对简单，首先将Taq酶溶液冷冻至极低温，然后通过真空脱水的方式将水分从冷冻的Taq酶溶液中去除，最后将干燥的Taq酶溶液密封保存。

这样，Taq酶的活性和稳定性就得到了保证。

在需要使用Taq酶时，只需将其重新溶解即可，而且保持了原有的活性和稳定性，方便实验操作。

Taq酶冻干工艺在分子生物学领域有着广泛的应用。

首先，它是PCR技术的关键步骤之一，用于扩增目标DNA序列。

PCR技术在基因工程、医学诊断、疾病预防等方面具有重要的应用前景。

其次，Taq酶冻干工艺还可以应用于DNA测序、基因克隆、基因突变分析等领域。

这些应用都依赖于Taq酶的高效、稳定的活性。

与传统的酶保存方法相比，Taq酶冻干工艺具有明显的优势。

首先，冻干工艺可以将Taq酶保存在较长的时间内而不失活性，延长了其使用寿命。

其次，冻干Taq酶易于储存和运输，方便实验室的使用。

此外，冻干工艺还可以提高Taq酶的稳定性，减少不必要的损失。

因此，Taq酶冻干工艺在分子生物学研究中具有重要的应用价值。

Taq酶冻干工艺是一项重要的生物技术方法，通过冻干技术实现对Taq酶的高效、稳定的保存和利用。

其原理简单，步骤清晰，应用广泛，具有明显的优势。

Taq酶冻干工艺的发展为分子生物学领域的研究提供了有力的支持，为相关领域的进一步发展和应用提供了有力的技术支持。

Taq酶的制备

1、BufferA:20ml 0.5M Tris（8.0）1.9817g 葡萄糖0.4ml 0.5M EDTA（8.0）定容至200ml2、Pre-lysis Buffer:200mg 溶菌酶+50ml BufferA 定容至50ml3、Lysisi Buffer：2ml 0.5M Tris（8.0）0.2ml 0.5M EDTA(8.0)0.5ml Tween20372.5mg KCl17.4mg PMSF(苯甲基磺酰胺) （用的时候再加）将以上药品定容至100ml4、Storage Buffer5ml 1M Tris(7.4)0.02ml 0.5M EDTA (8.0)0.154ml 0.648M DTT (100mg/ml DTT=0.648M) (DTT:二硫苏糖醇) 0.3725g KCl50ml 甘油将以上药品定容至100ml4、Dialysis Buffer （2L）100ml 1M Tris（8.0）0.4ml 0.5M EDTA (8.0)2.08ml 0.648M DTT1.6ml 0.5M PMSF (0.1394g) （用的时候再加）7.45g KCl1L甘油将以上药品定容至2L具体步骤：1、划线过夜2、单菌落试管过夜（4ml）3、加20ul到6ml LB试管中，37O C ,200rpm，7.5h4、加100ul到500ml LB，200rpm ，5.5h，测OD600=0.455、加2.6ml IPTG（→125mg/L），37O C ,200rpm，14h6、菌液5000rpm，10min7、向沉淀中加大于50ml Buffer A，涡旋，5000rpm，10min8、沉淀加25ml Pre—lysis Buffer 重悬，RT 15min9、加25ml Lysis Buffer ，75 O C,80min10、15000rpm，10min ，收集上清11、上清加约15g （NH4）2SO4，混合5min，15000rpm ，10min，弃上清12、向沉淀中加入20ml storge buffer ，透析2d，换四次透析液13、分装由于我们的50ml离心管装不了50ml，实验操作中的试剂用量我是按比例缩小了。

taq酶测序原理

taq酶测序原理
Taq酶测序是一种基于DNA聚合酶的测序方法。

Taq酶是一
种热稳定的DNA聚合酶，能够耐受高温条件下的DNA扩增
反应。

Taq酶测序的原理基于DNA链延伸和截断反应。

在Taq酶测序中，首先需要将待测DNA片段进行扩增，通常
使用聚合酶链反应（PCR）方法。

PCR使用一对引物（primers）在模板DNA的两侧进行扩增。

引物在反应体系中
的高温下与目标DNA片段特异性结合，并由Taq酶催化下的DNA聚合酶链扩增。

在扩增反应中，加入一种特殊的二进制链终止核苷酸（ddNTPs），它们是缺少3'羟基的核苷酸。

由于缺少3'羟基，当ddNTPs被加入新合成的DNA链上时，DNA聚合酶无法再
在其上继续延伸，导致链的突然终止。

经过多轮PCR反应，会产生一系列不同长度的DNA片段，每个片段以ddNTPs停止的位置为终点。

这些DNA片段随后可
以通过凝胶电泳进行分离，然后通过染料标记或放射性测定等方法进行检测。

通过对不同长度的DNA片段的测定，可以推断出原始DNA
片段的序列。

由于每个ddNTPs只能终止于特定的碱基，因此
可以通过测定每条DNA片段上的终止核苷酸来确定原始序列。

taq酶标准

TAQ酶标准一、酶的分类TAQ酶（Thermostable DNA polymerase）是一种热稳定DNA聚合酶，属于DNA聚合酶的一种。

根据酶的来源和性质，可以将酶分为多种不同的类型，包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、酯酶、氧化还原酶、蛋白水解酶等等。

每种酶都有其特定的生物学功能和特点，在生物体内发挥着不同的作用。

二、酶的特性TAQ酶具有热稳定性，能够在高温条件下保持活性。

这种特性使得TAQ酶在PCR等高温反应中具有广泛的应用。

此外，TAQ酶还具有高催化效率和高度特异性，能够催化DNA合成等反应，且不易发生误合成。

三、酶的应用TAQ酶在生物学、医学和生物工程领域都有广泛的应用。

在生物学研究中，TAQ酶可以用于基因克隆、DNA序列分析、基因表达等实验中。

在医学领域，TAQ酶可以用于诊断和治疗各种疾病，例如遗传性疾病、癌症、病毒感染等。

在生物工程领域，TAQ酶可以用于基因工程、蛋白质工程等研究中。

四、酶的检测与定量对于TAQ酶的检测和定量，可以使用各种方法，例如活性测定、免疫分析、光谱分析等。

其中，活性测定是常用的方法之一，可以通过测定酶促反应速率来评估TAQ酶的活性。

免疫分析则可以通过检测抗体与TAQ酶的结合情况来定量。

光谱分析可以通过测定光谱变化来定量TAQ酶的浓度。

五、酶的纯化与制备TAQ酶的纯化与制备是保证其质量和应用的关键步骤之一。

通常采用的方法包括离子交换色谱、凝胶色谱、亲和色谱等。

其中，离子交换色谱是常用的方法之一，可以通过交换TAQ酶上的离子来达到纯化的目的。

亲和色谱则可以利用抗体与TAQ酶的特异性结合来纯化。

此外，还可以使用基因工程技术生产重组TAQ酶。

六、酶的结构与功能关系TAQ酶的结构与功能关系是理解其生物学活性的关键。

TAQ酶是一种球状蛋白，由多个亚基组成，每个亚基都具有催化活性。

结构决定功能，TAQ酶的结构决定了其在高温条件下的稳定性和催化效率。

此外，TAQ酶的结构也与其特异性有关，例如识别和结合DNA模板的能力。

Taq酶

关于PCR反应的延伸时间

③3400bp的基因PCR时怎样设定程序，尤其是延伸的时间？求指教这么长的PCR产物需要用特殊的Taq酶（如TAKARA的LA Taq，不知道这个酶是否换生产），普通的Taq酶一般延伸不到这么长。你需要根据Taq酶的延伸速度计算延伸时间（Taq 酶的延伸速度一般是几百bp/min，你可以查查你用的Taq酶的延伸速度），延伸时间=产物长度/延伸速度，然后留一些冗余。3400bp至少需要延伸4-5min左右。你要先看你所用的酶的说明书，上面有该酶的热启动温度，变性温度，延伸温度等等，不同的酶都是不一样的。如果酶的延伸速度是一分钟1kb，那么你就设3.5分钟，如果是半分钟1kb，就设2分钟，就这样。退火温度是看你设计的引物，你把引物放到设计软件上看一看，调整一下buffer的离子浓度，看看退火温度是多少。就可以了。 ④延伸时间要足够长，一般按1min/kb延伸。
那么它是怎么被发现的呢
？
Taq聚合酶是我国台湾科学家钱嘉韵女士所分离，钱嘉韵是第一个报道分离耐高温DNA聚合酶工作的，1973 年，钱嘉韵就读于美国俄亥俄州辛辛那提大学生物系，她的导师对黄石公园里热泉中发现的嗜热菌十分好奇，就让钱嘉韵以该细菌作为研究主题。在另一位老师的指导下，钱学会了从细胞中分离蛋白质，成功分离出该细菌耐高温的TaqDNA聚合酶。
Taq 酶的应用
水生栖热菌是一种生长在温泉、蒸汽管道等处的细菌，它体内的TAQ聚合酶可以耐受 90℃以上的高温而不失活，这在需要高温环境的PCR反应中有着重要意义。因此TAQ聚合酶取代了之前常用于PCR反应的大肠埃希菌中的DNA聚合酶。PCR反应中应用TAQ聚合酶，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷，大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。一般适用于DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、平末端加A等，产物可直接用于T-A克隆载体。

基因重组TaqDNA聚合酶的制备

收稿日期:2007-07-18基金项目:河南省科技厅自然科学基金(编号:511042300),河南省科技攻关资助项目(编号:624410041)作者简介:王天云(1968-),男,山东人,副教授,博士,研究方向为真核基因表达调控与基因工程。

基因重组Taq DNA 聚合酶的制备王天云1,秦川2,杨瑞2,杨献军2(1.新乡医学院生物化学与分子生物学教研室,河南新乡 453003;2.新乡医学院分子生物学研究室,河南新乡453003)摘要: 目的制备重组Taq D NA 聚合酶,为PCR 提供试剂。

方法用Taq D NA 聚合酶基因的p Taq 表达质粒转化E.coli 菌株,异丙基硫代2B 2D 2半乳糖苷(IPT G )诱导12h 表达Taq D NA 聚合酶,溶菌酶、NP40裂解细菌,硫酸铵沉淀、4e 透析,SDS 2聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS 2PAGE )和PCR 扩增分析其纯度和活性。

结果分离纯化制备的Taq 酶,纯度、活性都可与同类产品相比,能有效扩增DN A 片段。

结论该方法制备可用于PCR 的Taq 酶具有快速简便的优点。

关键词: Taq DNA 聚合酶;基因工程;分离纯化中图分类号:Q783 文献标识码:A 文章编号:100427239(2007)0620551203P repar a tion of r eco m b i n an t Taq DNA polym era se WANG T ian 2yun 1,Q IN Chuan 2,YANG Ru i 2,et a l(1.De par t m ent of B ioche m istry and M olecular B iology ,Xinxi a ng M edica l College ,X i nxiang 453003,China;bora tory o f M o 2lecul a r B iology ,X inxi a ng M e d ica l C ollege ,Xinxi a ng 453003,Chi na )Abstr ac t : Ob jec ti ve To prepa re reco m bi nant Taq DNA poly m erase for PCR.M e thods Taq DNA poly m erase was ex 2pressed i n reco mb i nant E .coli stra i n under i sopro py 2B 2D 2thiogalactoside(IPTG)inductio n for 12h ,d isrupted w i th l ysozy m e and NP 40,follo wed d i a l yzed a t 4e .Purificati on and activiti es of pol y m erase were analyzed under sodi u m dodecyl su lfate pol yacryl 2am ide gel electropheres i s (SDS 2PAGE)and pol y me rase cha i n reac ti on(PCR )m e t hods .R esults The prepared pol y m erase pur i 2fi catio n and acti vities could co mpare with the same product can be used to amp lify the DN A frag m ent .C onc l u sion The pre 2pared m e t hods of reco m binant Taq D NA poly m erase i n our laboratory are si m ple and rap i d l y .K ey word s : Taq D NA poly m erase ;gene engi neer i ng ;separa ti on and pur ifi catio n自从1985年Mu llis [1]提出聚合酶链式反应(pol y m erase chai n reaction,PCR )以来,PCR 技术发展十分迅速,并被广泛应用于生物学、医学等相关学科领域。

耐热性重组Taq DNA酶的制备及鉴定

ＡｂｔａｔＩｈｓｓｕｙ．ｏｉｓｔｎｆｒｄｗｔｌｓｄＰＴｑｃｎａｎｎｈａｓｒｃ：ｎｔｉｔｄ，ＥｃｌｉｒｓｏｍｅｉｐａｍｉａｏｔｉｉｇｔｅＴｑＤＮＡｐｌｍｅａｅａｈｏｙｒｓ
ＬａＩＹｕｎ，ＸＩＯＮＧＪｎ，ＹＡＮＪｎ — ｎ，Ｇｈｎｈｎ，ＤＯｉｌ，ＷＡＮＧＹｉｌｇｉｇｉｇｗｅＡＯＣｕ－ｏｇＮＧＬ－ｉ－ｉｎ（ｏｅｅｏｉｃｅｃ，ＳａｘＮｒｌｎｖｒｔ，Ｌｎｅ４４ＣｉａＣｌｇｆｆＳｉｅｈｎｉｏｉｓｙｉｆｎ００，ｈｎ）ｌＬｅｎｍａＵｅｉ１０
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第１４卷
第３期
２１０１年６月
ＬＡＢＯＲＡＴ０ＲＹＳＣＥＮＣＩＥ
Ｖｏ．４Ｎｏ３Ｊｎ２１１１．ｕ。０ｌ
耐热性重组ＴｑＤＡ酶的制备及鉴定ａＮ
李媛，熊静，闫静文，高春红，董丽丽，王秫玲
ｇｎ．ＴｑＤＡｐｌｍｒｓｒｐｒｄｕｄｒｓｐｏｙ — Ｂ－ｈｏａａｔｉｅ（ＰＧ）ｉｄｃｍｅｔｅｅａＮｏｅａｅｉｐｅａｅｎｅｏｒｐｙｓｉ —ＤｔｉｇｌｏｄＩＴｃｓｎｕｅｎ
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Taq DNA聚合酶的制备和纯化

Taq DNA聚合酶的制备和纯化詹庆才;詹祎捷;刘之熙;朱克永【摘要】Taq DNA聚合酶是分子生物学研究中最常用的热稳定DNA聚合酶之一.试验利用含Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化大肠杆菌E.coli菌株,用异丙基硫代-β-D-乳糖苷(IPTG)诱导表达耐热Taq DNA聚合酶;采用热变性沉淀杂蛋白,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测纯度,Bio-Rex 70柱层析纯化蛋白,PCR反应检测Taq DNA聚合酶的浓度和活性.结果表明:分离纯化制备的Taq DNA聚合酶,其纯度、酶活性和酶特异性均达到市售的Taq DNA聚合酶水平.【期刊名称】《湖南农业科学》【年(卷),期】2013(000)013【总页数】3页(P10-11,15)【关键词】Taq DNA聚合酶;Bio-Rex 70柱层析;聚丙烯酰胺凝胶电泳;PCR【作者】詹庆才;詹祎捷;刘之熙;朱克永【作者单位】湖南省水稻研究所,湖南长沙410125;北京联合大学应用文理学院,北京100083;湖南省水稻研究所,湖南长沙410125;湖南省水稻研究所,湖南长沙410125【正文语种】中文【中图分类】Q814.1PCR技术被广泛应用于分子生物学、食品科学、医学等相关研究领域。

作为PCR技术的主要试剂的Taq DNA聚合酶用量日益增多。

而目前大多数实验室主要依赖公司商品化的Taq DNA聚合酶。

为了降低研究和开发成本，一些实验室利用不同的分离纯化方法生产Taq DNA聚合酶[1-4]。

湖南省水稻研究所生物技术室利用含Taq DNA聚合酶基因的p Taq表达质粒转化大肠杆菌E.coli菌株，诱导表达耐热Taq DNA聚合酶，然后提取纯Taq DNA聚合酶，并用考马斯亮蓝法和PCR分析其纯度、浓度和活性。

该技术旨在制备Taq DNA聚合酶，降低分子生物学实验成本。

1 材料与方法1.1 材料含Taq酶基因的载体p Taq由中国科学院遗传与发育研究所提供，氨苄青霉素（Amp）、溶菌酶、苯甲基磺酰氟（PMSF）、异丙基硫代-b-D-半乳糖苷（IPTG）、Taq DNA 聚合酶、DNA Marker等生物化学试剂购自鼎国生物科技有限公司。

taq酶生产工艺

taq酶生产工艺
Taq酶是一种重要的DNA聚合酶，广泛应用于PCR反应中。

下面是Taq酶的生产工艺：
1. 培养生产菌株：选择具有高Taq酶产量的菌株，如Thermus aquaticus。

将菌株接种到含有适宜培养基的培养皿中，并进行
预培养以增加菌体数量。

2. 大规模培养：将预培养的菌体转移到大容量的培养基中，如发酵罐。

控制培养条件，如温度、pH、氧气供应和搅拌速度，以促进菌体生长和酶产量。

3. 收获细胞：当菌体生长到相对稳定的阶段时，通过离心和过滤等方法，将细胞从培养基中分离出来。

通常使用低温和低速度的离心来防止酶的变性和损失。

4. 细胞破碎：将收获的菌体进行破碎，使Taq酶释放到溶液中。

可以使用物理方法（如超声波破碎）或化学方法（如酶解剂）来实现破碎。

5. 纯化酶：通过多步酒精沉淀、色谱层析和凝胶过滤等步骤，从细胞破碎液中纯化出Taq酶。

这些步骤包括去除杂质和其
他的DNA聚合酶。

6. 活性检测：对纯化后的Taq酶进行活性检测，以确保其具
有良好的聚合活性和稳定性。

7. 包装和存储：将活性检测合格的Taq酶进行包装和标记，并在低温下存储，以保持其稳定性和活性。

以上是一般的Taq酶生产工艺，不同的生产厂家可能会有一些差异和特殊的步骤。

[最新]快速纯化taqdna聚合酶

快速纯化高活力基因工程T aq DNA聚合酶摘要:用含有Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化 E.coli DH5α菌株,IPTG诱导表达Taq DNA聚合酶.利用该酶的热稳定性,经两轮-70℃深度冷冻和75℃水浴,细菌裂解释放内容物,以高速离心除去冻融变性的细胞碎片及核酸蛋白的复合物以达到快速纯化Taq DNA聚合酶的目的.PCR扩增反应表明所制备的Taq DNA聚合酶的活力、敏感性、特异性均达到试验要求.该方法具有快速简便的优点.关键词:Taq DNA聚合酶;冻融;纯化;聚合酶链式反应1958年科学家分离出DNA聚合酶后,就曾设想利用DNA聚合酶扩增产生大量DNA.1983年Mullis发明了聚合酶链式反应(PCR)[1].但一般DNA聚合酶不耐高温,每一轮聚合反应完成后,都需加入新的聚合酶,这使操作既浪费时间又易出错.1986年Erlich分离纯化出热稳定的适用于PCR技术的Taq DNA聚合酶.Taq DNA聚合酶是一种耐热的单亚基酶(Mr =94000),具有5′→3′聚合酶的活性,在核苷酸掺入过程中,根据目的序列的不同,最适反应温度为75 ~ 80℃,最初是从耐热细菌Thermus aquaticus中纯化而得[2],现已有其基因工程酶[3].它很高的最适反应温度可消除DNA二级结构,有利于聚合反应顺利进行.基因工程Taq DNA聚合酶表达载体的构建便利了该酶的纯化.但从细菌培养物纯化酶的方法仍很繁琐,需要进行选择性沉淀和离子交换色谱分离[4,5]. Edith.G(1995)[5]利用Taq聚合酶的热稳定性,提出冻融法去除杂蛋白等大分子,所制备的酶可用于PCR和测序反应[5],但纯化中需要使用挥发性神经剧毒物质PMSF,且在长时间透析过程中部分酶的活力会丧失.在综合考虑Taq DNA聚合酶分子结构和PCR反应体系基础上,我们对所用试剂进行优化,不必使用融菌酶和剧毒物质PMSF,大大简化了纯化该酶的工艺,整个纯化过程仅用-70℃、75℃交替冻融和离心就纯化出产量、敏感性、特异性和活力均很高的Taq DNA聚合酶.1实验材料1.1宿主菌和聚合酶表达载体.宿主菌为大肠杆菌DH5α菌株;重组表达载体为pTaq表达质粒.插入原核表达质粒的TaqDNA聚合酶基因的转录由tac启动子控制.以pTaq转化E.coliDH5α菌株,获得转化子.1.2试剂(1)Taq DNA聚合酶纯化缓冲液A:50mM葡萄糖,50 mM Tris.HCl(PH 7.9) , 1mMEDTA;(2)Taq DNA聚合酶纯化缓冲液B:10 mM Tris.HCl (PH 7.9) ,100 mM NaCl ,1mMEDTA ,0.5% Tween 20,0.5% Nonidet-P40,1mM DTT;(3)LB (Lauria Bertaini )液体培养基、0.5×TBE缓冲液参照《分子克隆》[7].所用生化试剂购于Promega公司.1.3Taq DNA聚合酶的表达与纯化(1)以插入Taq DNA聚合酶基因的pTaq表达质粒转化E.coliDH5α菌株,具体方法见《基因工程操作技术[6]; (2)取一个已转化的DH5α克隆于5ml LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素),37℃200rpm振荡过夜;(3)1ml过夜培养液接种200ml LB液体培养基(含100μg/ml氨苄青霉素),37℃200rpm振荡4小时后加入IPTG(终浓度5mM)诱导聚合酶基因表达.继续培养10小时;(4)离心收集菌体;(5)以Buffer A清洗菌体二次,悬浮于8mlBuffer A ,反复二次-70℃、75℃交替冻融;(6)12000 g 离心20分钟,取上清;(7)上清液中加入等体积的Buffer B ,75℃水浴30分钟;(8)12000 g离心20分钟;(9)取上清液,加入等体积甘油,-20℃保存备用.1.4PCR反应检测Taq DNA聚合酶活力PCR扩增反应检查所纯化Taq DNA聚合酶活力.上海Sangno生物工程公司的商品酶为对照.随机挑取水稻cDNA文库7个克隆,抽提质粒为摸板;M13通用引物.PCR反应体系(50μl)为:摸板10μl(1ml LB培养物所抽提的质粒量的1/400),10×PCR缓冲液5μl,25mMMgCl23.5μl ,25μg/mlM13-Reverse引物1μl,25μg/ml M13-Forward引物1μl,20mM dNTP0.5μl ,自制Taq DNA聚合酶1μl ,对照组使用1个单位聚合酶.所用试剂和引物购于上海Sangno生物工程公司.图1所纯化Taq DNA聚合酶与商品酶PCR扩增结果PCR反应参数:94℃预变性5分钟,94℃变性30秒,57℃退火45秒,72℃延伸90秒,40个循环.PCR反应后取7μl产物于1%琼脂糖凝胶电泳检测.2结果与讨论以冻融法从200mlE.coli培养物中制备到15ml聚合酶溶液.加入等体积灭菌甘油后,PCR扩增水稻cDNA文库7个随机克隆的结果见图1.图1中上面一排1~7泳道为使用自制Taq DNA聚合酶的PCR扩增结果;下方一排是对照组,为使用商品酶对相应克隆进行PCR扩增的结果.使用自制酶,可将7个cDNA片段全部扩增出,其敏感性和特异性等同于商品酶.根据电泳结果,可以看出所纯化的Taq DNA聚合酶的活力超过1U/μl ,按此得率,每升细菌培养物中可纯化出超过15万单位的酶.影响Taq DNA聚合酶产量的主要因素是宿主菌株和IPTG诱导时间[4,5].使用更优良的宿主菌和相应的最佳诱导时间,可望进一步提高Taq DNA聚合酶产量.曾对所制备Taq DNA聚合酶以SDS-PAGE分析,发现所制备的蛋白分子量约为94Kda,与Taq DNA聚合酶的分子量相符,且纯度很高.一般来说,以经典方法分离纯化活性蛋白的工艺相当繁琐,多步骤、长时间的分离纯化不但直接提高了产品的成本,而且不利于酶的得率和活力.Taq DNA聚合酶具有很高的热稳定性,作用温度范围在20℃~ 85℃,在92.5℃下其活性半衰期为130分钟,所以-70℃低温冷冻和75℃高温处理对该酶的活力影响都不大;而普通E.coli菌体蛋白不具有忍受低温和高温处理的能力,在-70℃深度冷冻续以75℃融解后,细菌胞膜就会破裂而释放菌体蛋白.除了Taq DNA聚合酶,其他蛋白质在75℃水浴条件下会变性而DNA大分子缠绕,再经离心就可直接去除杂质而达到分离纯化酶的目的.目前Taq DNA聚合酶的最低商品价格为0.2~0.3元/单位,所以使用自制酶不仅可以取得很好的试验结果,而且还节省大量的科研经费.浙江大学生物技术研究所在使用所制Taq DNA聚合酶对水稻的6000个独立基因分别以T3,T7和M13-R,M13-F为引物进行了逾万次PCR扩增时,阴性对照组结果正常;并将产物点制成cDNA基因芯片,经中科院微生物所和中国农科院水稻研究所使用反映良好.。

TaqDNA polymerase酶提纯方法

TaqDNA polymerase酶提纯方法1.划Ampicillin 凝胶平板37℃过夜；2.取单个菌斑，接种3ml LB super broth media+100ug/ml Amp. 37℃过夜，摇床培养；3.取0.1ml过夜细菌培养，加到100ml LB super media+100ug/ml Amp，37℃摇床培养到OD600=0.3，然后加入IPTG到0.5mM，然后继续摇床培养16h（此时，可留2ml作为SDS-PAGE分析（溶于Lammaeli buffer），另2ml作酶活性分析（保存于50% glycerol at -20℃））；4.离心（5000*rpm）搜集细菌，重新溶于3ml Buffer A（50mM Tris-HCl，PH7.9，50mM dextrose，1mM EDTA）+4mg/ml Lysozyme(Sigma),室温裂解15min；5.加入3ml Buffer B（10mM Tris-HCl，PH7.9，50mM KCl，1mM EDTA，0.5% Tween20,0.5% NP-40）。

混匀，于75℃水浴中摇60分钟；6.4℃离心10min，12000*rpm，用Sorvall RC2B超速离心机，SS34 Rotor；7.取上清裂解液，加入等量（6ml）的Storage Buffer（50mM Tris-HCl，PH8.0,100mMNaCl，0.1mM EDTA，0.5mM DTT，1% Triton X-100）含50% Glycerrol；混匀，再加入等量（12ml）的Storage Buffer含75% Glycerol。

再混匀。

储存在-20℃。

8.测蛋白质浓度（Bio-Rad kit，at 595nm）；9.跑SDS-PAGE检测Taq酶的纯度；10.Taq酶活性检测。

将提纯的Taq酶用Buffer B作对倍稀释一直到1:1600倍。

用买来的PromegaTaq酶作参照，进行PCR反应。

taq酶冻干工艺

taq酶冻干工艺Taq酶冻干工艺的创作：冻干是一种常用的保存和制备生物样品的方法，而Taq酶冻干工艺则是一种利用冻干技术来保存和提取Taq酶的方法。

Taq酶是一种热稳定的DNA聚合酶，广泛应用于分子生物学领域的PCR技术中。

在PCR反应中，Taq酶能够在高温下承受极端条件，如变性、退火和延伸，从而实现DNA的扩增。

Taq酶的冻干工艺是为了解决Taq酶在长期保存过程中的不稳定性问题。

冻干工艺可以将Taq酶冷冻并在真空条件下脱水，将其转变为一种干燥的粉末状物质。

这种冻干的Taq酶具有较长的保质期，并且在重新溶解后仍然保持着其活性。

Taq酶冻干工艺的主要步骤包括酶液的冷冻、真空脱水和冻干。

首先，将Taq酶溶液加入冷冻剂中，使其迅速冷冻。

然后，将冷冻的Taq酶样品放入真空脱水设备中，通过减压去除酶液中的水分，使其逐渐转变为冻干酶粉。

最后，将冻干的Taq酶粉装入密封的容器中，以确保其长期保存。

Taq酶冻干工艺的优点在于能够有效地延长Taq酶的保质期。

由于Taq酶在常温下容易失活，通过冻干工艺可以将其保存在干燥的状态下，从而减少其受潮和降解的风险。

此外，冻干酶粉的使用也更加方便，可以根据需要精确地称取所需的酶量。

然而，Taq酶冻干工艺也存在一些限制。

首先，冻干工艺需要专门的设备和条件，成本较高。

其次，冻干过程中的真空脱水对Taq酶的活性有一定的影响，可能导致酶活性的损失。

因此，在进行Taq 酶冻干工艺时，需要仔细控制脱水的条件，以尽量减少活性的损失。

总的来说，Taq酶冻干工艺是一种有效的方法，可以延长Taq酶的保质期，并使其更方便地使用。

通过冻干工艺，Taq酶可以在干燥的状态下保存，并在需要时溶解使用。

然而，冻干工艺也需要注意一些技术细节，以保证酶的活性和稳定性。

对于需要长期保存和频繁使用Taq酶的实验室来说，Taq酶冻干工艺无疑是一种值得尝试的方法。

Taq酶纯化参考方法

一、溶液配制1：LB /Agar /Amp，配置100 mL。

1g tryptone、0.5g Yeast Extract、0.5g Nacl和1.5 g Agar。

121 ℃灭菌加8 mg Amp。

2：LB /Broth /Amp，配置100 mL。

1g tryptone、0.5g Yeast Extract、0.5g Nacl和100 ml H2O。

121 ℃灭菌后加8 mg Amp。

3：A buffer，配置1000 mL。

Tris 6.1 g（50mM）、右旋G+ dextrose 9.02 g（50mM）、EDTA 0.373 g（1mM）。

定容至1 L 时，pH为7.9。

4：Pre-lysis buffer，配置1000 mL。

Tris 6.1 g（50mM）、右旋G+ dextrose 9.02 g（50mM）、EDTA 0.373 g（1mM）。

定容至1 L 时，pH为7.9。

5：Lysis buffer，配置1000 mL。

Tris 1.22 g（10 mM）、Kcl 3.73 g（50mM）、EDTA 0.373 g（1mM）、PMSF（剧毒）0.1742 g（1mM）、Tween20 5 mL（0.5%）和NP-40（0.5%），定容至1 L。

6：存储缓冲液Storage buffer，配置1000 mL。

Tris 6.1 g（50 mM）、Kcl 3.73 g（50mM）、EDTA 0.373 g（0.1mM）、DTT 0.154g（1mM）、PMSF（剧毒）0.0871 g（0.5mM）和甘油500 mL（50%），定容至1 L。

7：（NH4）2S04 30g8：IPTG 125 mg。

9：溶菌酶，用Buffer A配置成4 mg/ml 的溶液50 ml。

二、实验步骤酶抽提；1、用含有pTaq的大肠杆菌划（LB /Agar /Amp）平板，37 ℃过夜培养，挑取单克隆，接种于50 mL LB /Broth /Amp中，220 rpm 37 ℃培养过夜。

无甘油taq酶纯化

无甘油taq酶纯化
Taq酶是一种热稳定的DNA聚合酶，常用于聚合酶链式反应（PCR）等分子生物学实验。

无甘油的Taq酶纯化通常涉及以下一般步骤：
1.细胞培养和收获：Taq酶通常从表达Taq聚合酶的大肠杆菌等
细菌中提取。

首先，将这些细菌在培养基中培养，并在适当时
机收获细胞。

2.裂解细胞：使用裂解剂（例如裂解缓冲液），将细胞打破，释
放Taq酶以及其他细胞组分。

3.固定化亲和层析：通过特异性的亲和作用，将Taq酶与某种亲
和柱（例如镍柱，根据Taq酶的His标签）结合。

这一步可以
帮助去除其他蛋白质。

4.洗脱：通过改变盐浓度或pH值等条件，使Taq酶从亲和柱上
洗脱。

5.离心浓缩：将洗脱的Taq酶溶液进行离心浓缩，减小体积。

6.柱层析：使用离子交换柱、凝胶过滤柱等进行层析，进一步纯
化Taq酶。

7.测定活性和纯度：使用聚合酶链式反应（PCR）等方法测定Taq
酶的活性。

通过SDS-PAGE等电泳技术检查纯度。

8.储存：将纯化得到的Taq酶在适当条件下保存，确保其长期稳
定性。

请注意，这只是一个通用的纯化步骤流程，具体的步骤和条件可能会根据实验室的具体需求、Taq酶的特性以及纯化系统的可用性而有
所不同。

在进行Taq酶的纯化前，请查阅相关文献或咨询具有经验的同行，以获得更详细的方法和建议。

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