生物化学--第二章 蛋白质化学-物大分子分离纯化主要方法
蛋白质的分离纯化
蛋白质的分离纯化蛋白质是生命体中最基本的分子之一，它在细胞内发挥着重要的功能。
由于蛋白质的复杂性和多样性，研究人员通常需要从复杂的混合物中分离和纯化蛋白质。
蛋白质的分离纯化是生物化学和生物技术领域中非常重要的一项工作，它为我们深入研究蛋白质的结构和功能提供了必要的条件。
蛋白质的分离纯化可以通过多种不同的方法实现，这些方法包括离心法、凝胶过滤法、电泳法、层析法等。
在选择合适的方法时，研究人员需要考虑到蛋白质的特性以及实验的要求。
离心法是最常用的分离方法之一，在离心过程中，通过调整离心力和离心时间，可以实现不同密度的蛋白质的分层。
这种方法适用于分离大分子量的蛋白质。
凝胶过滤法是利用孔径不同的凝胶将蛋白质分离开来。
通常使用的凝胶有琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶，这些凝胶具有不同的孔径，可以根据蛋白质的分子量选择合适的凝胶进行分离。
电泳法是基于蛋白质的电荷和分子量差异而进行分离的方法。
最常用的电泳方法是SDS-PAGE电泳，通过使用SDS（十二烷基硫酸钠）对蛋白质进行解性和蛋白质间的形成复合物，使得蛋白质在电泳过程中仅仅受到电场力的影响，从而实现蛋白质的分离。
层析法是一种利用物质在载体上的分配和吸附性质进行分离的方法。
常见的层析方法有凝胶层析、亲和层析、离子交换层析等。
凝胶层析是通过利用载体颗粒的孔径进行分离，亲和层析是将特定配体固定在载体上，与目标蛋白质结合，从而实现分离，而离子交换层析是利用载体表面电荷与目标蛋白质的电荷相互作用进行分离。
在进行蛋白质的分离纯化时，需要注意以下几个关键步骤。
首先是样品制备，通常样品要经过细胞破碎、蛋白质提取等步骤，使得目标蛋白质从复杂的混合物中提取出来。
其次是样品的处理，包括去除杂质、调整蛋白质的溶液环境等。
然后是选择合适的分离方法，根据蛋白质的特性和实验要求来确定最适合的方法。
最后是纯化过程中的监测和分析，通过使用各种蛋白质分析方法，如SDS-PAGE、Western blot等，来确定目标蛋白质的纯化程度和鉴定其存在。
生物大分子的分离纯化
生物大分子的分离纯化由于生物体的组成成分是如此复杂，数千种乃至上万种生物分子又处于同一体系中，因此不可能有一个适合于各类分子的固定的分离程序，但多数分离工作关键部分的基本手段是相同的。
为了避免盲目，节省实验探索时间，要认真参考和借鉴前人的经验，少走弯路。
常用的分离纯化方法和技术有：沉淀法（包括：盐析、有机溶剂沉淀、选择沉淀等）、离心、吸附层析、凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、快速制备型液相色谱以及等电聚焦制备电泳等。
本章以介绍沉淀法为主。
1 沉淀法沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。
沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不仅用于实验室中，也用于某些生产目的的制备过程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。
通过沉淀，将目的生物大分子转入固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。
此方法的基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH 值、离子强度和极都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：⑴中盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。
⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。
⑶选择沉淀（热变沉淀和酸碱变沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变的杂蛋白。
⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。
⑸有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法，主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作为沉淀剂。
1.1 中盐沉淀（盐析法）在溶液中加入中盐使生物大分子沉淀析出的过程称为"盐析"。
除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离，20％～40％饱和度的硫酸铵可以使许多病毒沉淀，43％饱和度的硫酸铵可以使DNA和rRNA沉淀，而tRNA保留在上清。
1生物大分子的制备2蛋白质(酶)的分离纯化
(1) 机械法： ① 研磨：将剪碎的动物组织或其它生物材料置于研 钵或匀浆器中，加入少量石英砂研磨成匀浆。 ② 组织捣碎器：这是一种较剧烈的细胞破碎方法， 通常可先用家用食品加工机械将组织打碎，然后 再用10000～20000r/min的内刀式组织捣碎机（即 高速分散器）将组织的细胞打碎。
(2) 物理法：
检查NaCl、KCl等。
1.3.3 超滤
超过滤即超滤，是一种加压膜分离技术， 即在一定的压力下，使小分子溶质和溶剂穿过 一定孔径的特制的薄膜，而使大分子溶质不能 透过，留在膜的一边，从而使大分子物质得到 了部分的纯化。 超滤可广泛用于含有各种小分子溶质的各 种生物大分子（如蛋白质、酶、核酸等）的浓 缩、分离和纯化。
1.3.1 沉淀法
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相而析出的过 程。沉淀法（即溶解度法）操作简便，成本低廉，不 仅适用于实验室中，也可用于某些生产目的的制备过 程，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶 时最常用的方法。通过沉淀，将目的生物大分子转入 固相沉淀或留在液相，而与杂质得到初步的分离。 沉淀法 的基本原理是根据不同物质在溶剂中的 溶解度不同而达到分离的目的，不同溶解度的产生是 由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差 异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质 及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及 改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解 度产生明显的改变。
生物大分子的制备通常可按以下步骤进行：
① 确定要制备的生物大分子的目的和要求，是进行科研、开发还是要发现新
的物质。
② 建立相应的可靠的分析测定方法，这是制备生物大分子的关键。 ③ 通过文献调研和预备性实验，掌握生物大分子目的产物的物理
化学性质。
蛋白质分离纯化原理
蛋白质分离纯化原理
蛋白质分离纯化的原理主要基于其在溶液中的物理化学性质的差异。
以下是几种常见的蛋白质分离纯化方法及其原理：
1. 溶液pH调节：许多蛋白质在不同pH值下的带电性质不同，可以利用溶液pH的调节来使具有不同电荷的蛋白质发生电离，从而实现分离纯化。
例如，利用离子交换层析法，可以根据蛋白质的带电性质来选择性地吸附和洗脱目标蛋白质。
2. 亲和层析法：某些蛋白质具有与特定小分子结合的能力，可以利用这种亲和性质来实现蛋白质的分离纯化。
常见的亲和层析包括亲和吸附、亲和洗脱和竞争洗脱等步骤。
例如，利用亲和层析柱上特异性结合靶蛋白质的配体，可以选择性地富集和纯化目标蛋白质。
3. 分子量筛选：利用蛋白质的分子量差异进行分离纯化。
常见的方法包括凝胶过滤层析（Gel filtration chromatography）和凝胶电泳（Gel electrophoresis）。
在凝胶过滤层析中，根据蛋白
质的分子量大小，通过孔径大小不同的凝胶来分离不同大小的蛋白质。
而在凝胶电泳中，蛋白质会受到电场的作用而迁移，根据蛋白质在凝胶中的迁移速率和电荷大小来分离不同的蛋白质。
4. 溶剂萃取：利用不同溶剂对蛋白质的亲水性和亲油性差异进行分离的方法。
例如，利用氯仿和甲醇的溶解性差异，可以将蛋白质从溶液中提取至有机相中。
5. 冷沉淀：利用低温和高盐浓度的方法使蛋白质从溶液中沉淀出来。
具有固定温度和浓度阈值的蛋白质会在特定条件下沉淀而分离纯化。
生物大分子分离纯化技术(159页)
F1 平衡作用
分离主要的
依
据
极性、 位阻因素 离子性质 分子大小 极性因素
分子大小 极性因素
离子性质 离子性质
离子性质 分子大小 离子性质 离子性质
分子大小 离子性质
分子大小 分子大小 分子大小
分子大小 形状
分子大小 分子大小 介质密度
（细胞外液）
（细胞内液） 发酵液→预处理→细胞分离→细胞破碎→碎片分离→提取 → 精制 → 成品制作
静电引力，极化度分子筛效应
扩散，偶极作用， 缔合和解离效应 渗透作用, 渗透，缔合和解离效应
分子摩擦力，极化度动电作用 分子摩擦力，极化度动电作用， 表面能 分子筛效应
分子摩擦效应
分子筛效应
电动力 分子筛效应 分子筛效应，表面能（吸附） 分子摩擦效应
扩散
分子摩擦效应
占优势的 作用力
F2 F2 F2 F2 F2 F1 F1 F1和F2 平衡作用 F1 F1和F2
分离纯化是整个生化制备过程的核心部分。生 物体的组成成分千千万万种，分离纯化的实验方案 也千变万化。没有一种分离纯化方法可适用于所有 物质的分离纯化，一种物质也不可能只有一种分离 纯化方法。所以对于某一种物质，究竟选用什么分 离纯化方法最理想，主要是根据该物质的物理化学 性质和具体实验条件而定。认真参考借鉴前人经验 可以避免许多盲目性，节省实验摸索时间。即使是 分离一个新的未知组分，根据分析和预试验的初步 结果，参考别人对类似物质分离纯化经验，也可以 帮助少走弯路。
五．结晶
六．沉降 （a）动力学的 （b）等密度的
生化分离方法分类表
推 动 力 F1
流体动力
流体动力
流体动力
流体动力 机械作用
蛋白质纯化的方法
蛋白质纯化的方法
蛋白质纯化是从复杂的混合物中分离出目标蛋白质的过程。
常用的蛋白质纯化方法包括：
1. 色谱：色谱是最常用的蛋白质纯化方法之一。
其中，离子交换色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱和逆向相色谱等都被广泛应用于蛋白质纯化。
2. 均一化：均一化是通过一系列技术将蛋白质从混合物中直接分离出来，如超声波、高压均质和离心等。
3. 电泳：凝胶电泳包括聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）等，常用于蛋白质的初步分离和纯化。
4. 过滤和浓缩：通过蛋白质的大小和分子量差异，利用滤膜和纤维素中心质等材料进行蛋白质的过滤和浓缩。
5. 溶剂析：溶剂析是利用溶剂中溶解度的突然变化，将蛋白质从某一浓度下聚集到另一浓度下。
6. 透析：透析是将混合物中的蛋白质通过半透膜与透析液进行分离，透析液可以去除杂质，同时保留目标蛋白质。
这些方法可以单独应用，也可以进行组合使用，以达到最佳的蛋白质纯化效果。
(生物化学)蛋白质分离纯化技术
蛋白质分离纯化技术摘要：蛋白质分离纯化是蛋白质产品工业化生产的关键之一。
本文分析了蛋白质分离纯化的特点及一般原则；综述了蛋白质分离纯化的传统技术：凝胶过滤层析、离子交换层析、吸附层析、亲和层析、疏水作用层析、高效液相色谱层析(HPLC)、电泳法等及新型技术：亲和超滤、内含肽介导的蛋白质亲和纯化。
关键词：蛋白质分离纯化蛋白质是生命的物质基础,是生命活动的最终控制者和直接执行者,它参与生物体内几乎所有的生命活动过程,如生长、发育、遗传、代谢、应激、能量转换、信号传导等。
以蛋白质和结构与功能为基础，从分子水平上认识生命现象，已经成为现代生物学发展的主要方向。
对蛋白质进行纯化，得到高纯度的"高活性的蛋白质是生物学科研人员经常要面对的问题。
蛋白质的分离纯化主要包括4个步骤：预处理、蛋白质的抽提、蛋白质的粗分级和蛋白质的分离纯化[1]。
本文针对近年来有关蛋白质的分离纯化技术所取得的进展进行了综述,为今后的理论和应用研究提供依据。
1 蛋白质分离纯化的特点及一般原则1.1蛋白质分离纯化的特点1）大多数蛋白质产品是生物活性物质,在分离纯化过程中,有机溶剂、溶液pH值、离子强度的变化均可使蛋白质变性失活。
2）蛋白质产品在物料中含量很低,且物料组成非常复杂。
例如,利用基因工程菌发酵生产蛋白质,物料中含有大量组成复杂的培养基、菌体生产代谢物等,目标蛋白质的含量常常不到蛋白质总量的1%。
有些目标蛋白质存在于细胞内或在胞内形成包含体,为获取蛋白质,还需进行细胞破碎,结果物料中含有大量的细胞碎片和胞内产物。
3）含蛋白质产品的物料不稳定,蛋白质产品易受料液中蛋白水解酶降解。
4）很多蛋白质产品作为医药、食品被人类利用,因而要求蛋白质产品必须是高度纯化的,产品无菌、无致热源等[2]。
1.2蛋白纯化的一般原则1）蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异，利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染，而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。
生物化学第二章蛋白质知识点归纳
一、概述
结合蛋白：由简单蛋白与其它非蛋白成分结合而成。按辅基种类分为： 1 核蛋白（nucleoprotein ） 核酸 2 脂蛋白（lipoprotein ） 脂质 3 糖蛋白（glycoprotein） 糖 4 磷蛋白（phosphoprotein） 磷酸基 5 血红素蛋白（hemoprotein ） 血红素 6 黄素蛋白（flavoprotein ） FAD 7 金属蛋白（metallaprotein ） 金属
据R基团 极性分类
例外：
COO+α
H3N C H
R
Gly —— 没有手性
构型与旋光方向没有直接对应关系，L-α-氨基酸有的为左旋，有的为右旋， 即使同一种L-α-氨基酸，在不同溶剂也会有不同的旋光度或不同的旋光方向。
二十种常见蛋白质氨基酸的分类、结构及三字符号
据R基团化学 结构分类
脂肪族ＡA（烃链、含羟基或巯基、羧基、碱性基团） 杂环ＡＡ(His、Pro) 芳香族ＡA(Phe、Tyr、Trp)
6 结构蛋白（structural protein）
7 防御蛋白（defense protein） 8 异常蛋白 (exotic protein)
二
氨基酸
1.蛋白质的水解 2.氨基酸的结构与分类 3.氨基酸的理化性质
一、蛋白质水解
完全水解得到各种氨基酸的混合物； 部分水解通常得到肽片段及氨基酸的混合物。 氨基酸是蛋白质的基本结构单元。 大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成，这20种
一、概述
按生物功能分：
1 酶（enzyme）
2 调节蛋白（regulatory protein）
3 转运蛋白（transport protein） 4 储存蛋白（nutrient and storage
分离纯化蛋白质的方法
分离纯化蛋白质的方法
分离纯化蛋白质的方法有多种，常用的方法包括：亲和层析、凝胶过滤色谱、离子交换色谱、逆流层析、尺寸排除层析、亲和吸附等。
1. 亲和层析：利用目标蛋白与某种特定配体的特异性结合，将目标蛋白与其他非特异结合的蛋白质分离开。
2. 凝胶过滤色谱：通过选择性大小排除来分离蛋白质。
较大的蛋白质无法进入凝胶孔道，较小的蛋白质可以顺利通过凝胶，实现分离纯化。
3. 离子交换色谱：通过蛋白质与离子交换基质之间的电荷作用进行分离。
离子与蛋白质的电荷性质决定了它们在离子交换基质上的吸附和洗脱特性。
4. 逆流层析：利用生物化学吸附系数的差异分离纯化蛋白质，结合了某种特定的结合物质与逆流洗脱的过程。
5. 尺寸排除层析：根据蛋白质的大小或分子量差异进行分离纯化，较大的蛋白质会直接通过层析柱，较小的蛋白质则会在柱中留下并延时流出。
6. 亲和吸附：利用蛋白质与特定亲和配体之间的特异性结合进行分离纯化。
这种方法具有高选择性和高效率。
这些方法可以单独使用，也可以联合使用，根据目标蛋白质的特性和需求来选择合适的分离纯化方法。
大学生物化学简答题总结(蛋白质)免费
大学生物化学简答题总结(蛋白质)免费第二章蛋白质蛋白质分类1、根据蛋白质分子的外形，可以将其分作3类。
①球状蛋白质：分子形状接近球形，水溶性较好，种类很多，可行使多种多样的生物学功能。
②纤维状蛋白质：分子外形呈棒状或纤维状，大多数不溶于水，是生物体重要的结构成分，或对生物体起保护作用，如胶原蛋白和角蛋白。
有些可溶于水，在一定的条件下聚集成固态，如血纤维蛋白原。
还有一些与运动机能有关，如肌球蛋白。
有些纤维状蛋白质是由球蛋白聚集形成的，一般归类于球蛋白，如微管蛋白和肌动蛋白。
③膜蛋白质：一般折叠成近球形，插入生物膜，也有一些通过非共价键或共价键结合在生物膜的表面。
生物膜的多数功能是通过膜蛋白实现的。
2、根据分子组成可将蛋白质分为两类。
（1）简单蛋白质：仅由肽链组成，不包含其它辅助成分的蛋白质称简单蛋白质（simple protein），按照溶解度的差别，可将简单蛋白质分为7类，清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白、硬蛋白（2）结合蛋白质：结合蛋白质（conjugated protein）由简单蛋白质和辅助成分组成，其辅助成分通常称为辅基。
根据辅基的不同，结合蛋白质可分为5类：核蛋白、糖蛋白、脂蛋白、色蛋白和金属蛋白。
3、按功能将蛋白质分为10类。
（1）酶：酶是具催化活性的蛋白质，是蛋白质中种类最多的类群，新陈代谢的每一步反应都是由特定的酶催化完成的。
（2）调节蛋白：许多蛋白质具有调控功能，这些蛋白质称为调节蛋白。
其中一类为激素，如调节动物体内血糖浓度的胰岛素，刺激甲状腺的促甲状腺素，促进生长的生长素等。
另一类可参与基因表达的调控，它们能激活或抑制基因的转录或翻译。
（3）贮存蛋白质：有些蛋白的生物功能是贮存必要的养分，称贮存蛋白。
例如，卵清蛋白为鸟类胚胎发育提供氮源。
许多高等植物的种子含高达60%的贮存蛋白，为种子的发芽准备足够的氮素。
铁蛋白能贮存铁原子，用于含铁蛋白如血红蛋白的合成。
（4）转运蛋白质：主要有两类，一类存在于体液中，如血液中的血红蛋白转运氧气，血清蛋白转运脂肪酸。
分离纯化蛋白质的方法及原理
分离纯化蛋白质的方法及原理
蛋白质纯化是生物分子的一项重要技术，它是分子生物学的核心技术之一，也是蛋白质结构及功能的研究的基础。
它可以从生物样本中分离出蛋白质，研究其结构、性质、功能及相关特性。
根据蛋白质纯化的原理和方法，可以分为物理法、化学法和生物学法等。
1.物理法
物理法是纯化蛋白的最简单方法之一，通常通过使用力场或温度去把一定浓度的蛋白质从溶质中萃取出来。
物理法不耗费能量也不会改变蛋白质的化学结构，不改变蛋白质的结构和功能，但有时可能会引发蛋白质的活性降低，因为櫛发性和相互之间复合物的结合可能会受到改变。
例如分子筛膜技术、沉淀离心技术等。
2.化学法
化学法是一种可以改变蛋白质结构的方法，一般是通过有机溶剂或水溶性固定相，以水或有机溶剂和化学试剂实现蛋白质的分离和纯化。
化学法可以破坏蛋白质的活性，从而改变其化学结构和功能，或者通过改变蛋白质的电性或物理状态来实现蛋白质的分离和纯化。
例如偏光技术、电泳技术、蛋白质酶剪切技术等。
3.生物学法
生物学法是一种比较复杂的蛋白质分离方法，是利用特定生物因子。
《生物化学》思考题第二章 蛋白质化学
第二章蛋白质化学学习要求一、掌握蛋白质分子平均含氮16％的意义，20种氨基酸名称(及三字符号)，R结构特点及分类法；蛋白质一、二、三、四级结构基本特点；蛋白质生物学功能。
二、熟悉蛋白质重要的理化性质；其他为应了解的内容。
习题一、名词解释1．等电点(pI) 2．肽键 3．蛋白质的变性作用 4．非编码氨基酸 5.α螺旋 6．结合蛋白 7．盐析作用 8．亚基 9．分子病 10．透析二、思考题1.不同蛋白质的含量颇为相近，平均含量为％。
2.20种基本氨基酸可以分为哪几类？其分类依据是什么？其中，酸性氨基酸和碱性氨基酸各包含哪几种氨基酸？3.蛋白质的一、二、三、四级结构的各自定义及其特点。
4.蛋白质的二级结构有哪些？维持二级结构的化学键是？5.维持蛋白质一级结构的化学键是键，而维持蛋白质高级结构的化学键有哪些？6.如果组成蛋白质的2条多肽链之间存在共价键（如二硫键），就没有四级结构。
7.试说明蛋白质结构与功能的关系。
8.维持蛋白质亲水胶体稳定的两个因素是？9.引起蛋白质变性的理化因素有哪些？蛋白质变性后，其理化性质．．．．和生物学活性．．．．．会发生怎样的改变？10.沉淀蛋白质的方法有哪些？其中法在常温下沉淀出的蛋白质不变性。
11.试举二例说明蛋白质变性在医学、食品工业等实践中的应用。
12.蛋白质和核酸对紫外光均有吸收。
蛋白质的最大吸收波长是 nm；核酸的最大吸收波长是 nm。
13.蛋白质的生理功能有哪些？试从含量及生理功能说明蛋白质在生命过程中的重要性。
14.氨基酸的等电点和中性点(pH 7.0)有何区别?15.如将氨基酸混合液(甘氨酸、精氨酸、谷氨酸)点在滤纸上，在pH6.8的缓冲液中进行电泳，试推测它们从正极至负极的顺序。
第三章酶学学习要求一、掌握酶的概念与作用特点(催化效率高、专一性强、不稳定性及可调控性等)．酶蛋白、辅助因子(辅酶或辅基)、参与辅酶或辅基组成的B族维生素及其功能、全酶；必需基团与活性中心；酶原激活及同工酶概念。
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质的分离纯化方法
蛋白质分离纯化是生物学研究的基础，也是生物技术的重要内容。
蛋
白质的分离纯化包括各种技术，有基于物理性质的分离技术，基于化学性
质的分离技术，也有基于生物学性质的分离技术，以及结合物理学、化学
和生物学的复合分离技术。
（一）物理性质分离
物理性质分离是指根据蛋白质的热稳定性、电荷和非电荷性等物理性质，运用精馏、沉淀等方法来分离纯化蛋白质。
例如通过超速离心可以将
悬浮于溶液中的悬液分离出来；用电泳来分离稠浆状溶液中的粒状固体；
通过精馏来分离不同分子量的蛋白质；结构性蛋白质可以利用蒸发或热稳
定性差异进行分离；在高倍弥散能够分离多肽链；通过简单沉淀和浓缩等
技术也可以分离纯化蛋白质。
（二）化学性质分离法
化学性质分离法是指根据蛋白质的氨基酸组成、汞结合能力、还原性、可溶性等化学特性，运用离子交换色谱、酸-碱色谱、凝胶电泳、乙醇沉
淀等技术来分离纯化蛋白质。
蛋白质分离纯化主要方法
蛋白质分离纯化主要方法
一、抽提
1、抽提冷冻干燥法
抽提冷冻干燥法是抽提当中常用的一种方法，能将活性蛋白以及未发生水解的蛋白从膜结构层中抽提出来，这种方法是一种简单、快捷、方便的抽提方法，可以较为有效的分离纯化未发生水解的蛋白，其原理是，将膜结构或者蛋白质复合物冷冻干燥，冷冻干燥后的蛋白质复合物会在温度迅速升高的情况下发生水解，蛋白质以抽提的形式分离出来，进而得到纯的蛋白质。
2、抽提凝胶凝集法
抽提凝胶凝集法是将蛋白质和抗体通过凝胶结合产生凝集反应，分离纯化蛋白质的一种方法。
这种方法可以将蛋白质从活性溶液和抗性溶液中分离出来，凝胶凝集反应主要是利用结合反应，将蛋白质物质结合到凝胶表面上，然后用浓盐溶液洗去不结合的物质。
生物化学实验技术(2)常用分离技术
二．硫酸铵的使用
硫酸铵中常含有少量的重金属离子， 硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基 有敏感作用，使用前必须用H 处理： 有敏感作用，使用前必须用H2S处理：将硫酸铵配成浓 溶液，通入H 饱和，放置过夜， 溶液，通入H2S饱和，放置过夜，用滤纸除去重金属离 浓缩结晶，100℃烘干后使用 烘干后使用。 子，浓缩结晶，100℃烘干后使用。 另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左 另外，高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（PH=5.0左 ），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。 使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH 右），使用前也需要用氨水或硫酸调节至所需PH。
第三节 其他沉淀法一．Fra bibliotek电点沉淀法 二．生成盐复合物沉淀法 三． 选择性变性沉淀 四．非离子多聚物沉淀法
一．等电点沉淀法
两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低， 两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的 两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性， 不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后， 不然盲目使用十分危险。 不少蛋白质与金属离子结合后，等 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH 值。 等电点法常与盐析法、 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联 合使用，以提高其沉淀能力。 合使用，以提高其沉淀能力。
使用硫酸铵时： 使用硫酸铵时：
1）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有0℃或室温两种， ）必须注意饱和度表中规定的温度，一般有 ℃或室温两种， 加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 加入固体盐后体积的变化已考虑在表中； 2）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。一种 ）分段盐析中，应考虑每次分段后蛋白质浓度的变化。 蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（ 蛋白质如经二次透析，一般来说，第一次盐析分离范围（饱 和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 和度范围）比较宽，第二次分离范围较窄。 3）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或 ）盐析后一般放置半小时至一小时， 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下， 离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫 酸铵密度较大， 酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离 心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。 心操作，耗时耗能。离心多用于低浓度硫酸铵溶液。
生物化学复习资料(全)
生物化学复习资料第一章蛋白质化学第一节蛋白质的基本结构单位——氨基酸凯氏定氮法：每克样品蛋白质含量（g）=每克样品中含氮量x 6.25氨基酸结构通式：蛋白质是由许多不同的α-氨基酸按一定的序列通过肽键缩合而成的具有生物学功能的生物大分子。
氨基酸分类：（1）脂肪族基团：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸、脯氨酸（2）芳香族基团：苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸（3）含硫基团：蛋氨酸（甲硫氨酸）、半胱氨酸（4）含醇基基团：丝氨酸、苏氨酸（5）碱性基团：赖氨酸、精氨酸、组氨酸（6）酸性基团：天冬氨酸、谷氨酸（7）含酰胺基团：天冬酰胺、谷氨酰胺必需氨基酸（8种）：人体必不可少，而机体内又不能合成，必需从食物中补充的氨基酸。
蛋氨酸（甲硫氨酸）、缬氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、亮氨酸、色氨酸、苏氨酸氨基酸的两性性质：氨基酸可接受质子而形成NH3+，具有碱性；羧基可释放质子而解离成COO-，具有酸性。
这就是氨基酸的两性性质。
氨基酸等电点：指氨基酸的正离子浓度和负离子浓度相等时的pH值。
蛋白质中的色氨酸和酪氨酸两种氨基酸具有紫外吸收特性，在波长280nm处有最大吸收值。
镰刀形细胞贫血：血红蛋白β链第六位上的Glu→Val替换。
第二节肽肽键：一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水综合而形成的酰胺键叫肽键。
肽键是蛋白质分子中氨基酸之间的主要连接方式，它是由一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基缩合脱水而形成的酰胺键。
少于10个氨基酸的肽称为寡肽，由10个以上氨基酸形成的肽叫多肽。
谷胱甘肽（GSH）是一种存在于动植物和微生物细胞中的重要三肽，含有一个活泼的巯基。
参与细胞内的氧化还原作用，是一种抗氧化剂，对许多酶具有保护作用。
化学性质：（1）茚三酮反应：生产蓝紫色物质（2）桑格反应第三节蛋白质的分子结构蛋白质的一级结构：是指氨基酸在肽链中的排列顺序。
蛋白质的二级结构：是指蛋白质分子中多肽链本身的折叠方式。
生物化学--(王镜岩)精心整理 精要知识点速览
生物化学精要速览（希望对广大生化初学者有助）第一章绪论一、生物化学的的概念：生物化学（biochemistry)是利用化学的原理与方法去探讨生命的一门科学，它是介于化学、生物学及物理学之间的一门边缘学科。
二、生物化学的发展：1．叙述生物化学阶段：是生物化学发展的萌芽阶段，其主要的工作是分析和研究生物体的组成成分以及生物体的分泌物和排泄物。
2．动态生物化学阶段：是生物化学蓬勃发展的时期。
就在这一时期，人们基本上弄清了生物体内各种主要化学物质的代谢途径。
3．分子生物学阶段：这一阶段的主要研究工作就是探讨各种生物大分子的结构与其功能之间的关系。
三、生物化学研究的主要方面：1．生物体的物质组成：高等生物体主要由蛋白质、核酸、糖类、脂类以及水、无机盐等组成，此外还含有一些低分子物质。
2．物质代谢：物质代谢的基本过程主要包括三大步骤：消化、吸收→中间代谢→排泄。
其中，中间代谢过程是在细胞内进行的，最为复杂的化学变化过程，它包括合成代谢，分解代谢，物质互变，代谢调控，能量代谢几方面的内容。
3．细胞信号转导：细胞内存在多条信号转导途径，而这些途径之间通过一定的方式方式相互交织在一起，从而构成了非常复杂的信号转导网络，调控细胞的代谢、生理活动及生长分化。
4．生物分子的结构与功能：通过对生物大分子结构的理解，揭示结构与功能之间的关系。
5．遗传与繁殖：对生物体遗传与繁殖的分子机制的研究，也是现代生物化学与分子生物学研究的一个重要内容。
第二章蛋白质的结构与功能一、氨基酸：1．结构特点：氨基酸(amino acid)是蛋白质分子的基本组成单位。
构成天然蛋白质分子的氨基酸约有20种，除脯氨酸为α-亚氨基酸、甘氨酸不含手性碳原子外，其余氨基酸均为L-α-氨基酸。
2．分类：根据氨基酸的R基团的极性大小可将氨基酸分为四类：①非极性中性氨基酸(8种)；②极性中性氨基酸(7种)；③酸性氨基酸(Glu和Asp)；④碱性氨基酸(Lys、Arg和His)。
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各类层析的原理和载体
类别
分离原理
吸附层析
化学、物理吸附
分配层析
两溶剂相中的溶解效应
凝胶层析
分子筛效应的排阻效应
离子交换层析 离子基团的交换反应
亲和层析 聚焦层析
分离物与配体之间有 特殊亲和力 等电点和离子交换作用
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基质或载体
硅胶、氧化铝 、羟基磷酸
纤维素、硅藻土 、硅胶
sepharose 、sephadex
生物大分子分离纯化主要方法
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生物大分子分离纯化的一般步骤
层析法
电泳法
生物组织→无细胞提取液→粗产品→
→结晶 超离心法
超滤
│←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│
•材料选择与处理 •细胞破碎（机械破 碎、溶涨和自溶、 酶解、化学处理）
•盐析（硫酸铵盐析） •等点电沉淀 •有机溶剂沉淀 •透析
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pH梯度的形成(由多缓冲剂和多缓冲交换剂形成)是聚焦效 应的先决条件，如果一种蛋白质加到已形成pH梯度的层 析柱上时，由于洗脱液的连续流动，蛋白质将迅速地 迁 移到与它等电点相同的pH处。从此位置开始，该蛋白质 将以缓慢的速度进行吸附、解吸附，直到在等电点pH时 被洗出。在聚焦层析过程中，一种样品分次加入时，只要 先加入者尚未洗出，并且有一定的时间进行聚焦，剩余样 品还可以加到柱上，其聚焦过程都能顺利完成。
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沉淀法
盐析法、有机溶剂沉淀法、重金属盐
沉淀法、生物碱或酸类沉淀法、加热 变性沉淀法
分
离子交换层析 吸附层析
离
层析法
凝胶过滤（分子筛）
纯
亲和层析
化
等电聚集层析
方
电学法
电泳法
法
等电聚焦
离心法
透析
膜分离技术 超滤
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纯度鉴定 分子量测定
层析法：凝胶过滤; 高效液相色谱法(HPLC) 电泳法：PAGE、梯度凝胶电泳、等电聚焦电泳等 免疫化学法：专一的沉淀线
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分类： 根据交换剂上吸附的离子交换基团不同，
阳离子交换剂; 阴离子交换剂； 按其解离度的大小， 分为强、中强、弱三种：
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阳
离 子 交
离 子 交 换 剂
强酸型 中等酸型 弱酸型
结合磺酸基团（ SO3H） 磷酸基团（ PO3H2）和亚磷酸基团（ PO2H） 结合酚羟基（ OH ）或羧基（ COOH）
K=Cs/Cm
Cs: 固定相中的浓度，Cm: 流动相中的浓度。 迁移率（或比移值）是指：在一定条件下，在相同 的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相 本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。
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相对迁移率：是指在一定条件下，在相同时 间内，某一组分在固定相中移动的距离与 某一标准物质在固定相中移动的距离之比 值。它可以小于等于1，也可以大于1。用 Rx来表示。分配系数主要与下列因素有关：
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5.正相色谱与反相色谱
正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极 性，因此，在这种层析过程中非极性分子或极性 小的分子比极性大的分子移动的速度快，先从柱 中流出来。
反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极 性，在这种层析过程中，极性大的分子比极性小 的分子移动的速度快而先从柱中流出。
亲和层析（affiuity chromatography）
原理
欲分离的大分产物质S和相对应的专一 物质L(配体)以次级键结合，能生成一种可 解离的络合物L—S。其中的L又能与活化的 基质M以共价键首先结合，而形成M—L—S 复合物。根据L—S之间能可逆地结合与解 离的原理发展起来的层桥方法称为亲和层 析法。
①被分离物质本身的性质；
②固定相和流动相的性质；
③层析柱的温度。
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4.分辨率（或分离度）
分辨率一般定义为：相邻两个峰的分开
程度。用Rs来表示。Rs值越大，两种组分 分离的越好。当Rs = 1时，两组分具有较好 的分离，互相沾染约2%，即每种组分的纯 度约为98%。当Rs=1.5时，两组分基本完 全分开，每种组分的纯度可达到99.8%。如 果两种组分的浓度相差较大时，尤其要求 较高的分辨率。
凝胶过滤（gel filtration）、凝胶渗透层析 （gel permeation chromatography）等。
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原理p303
凝胶层析是依据分子大小这一物理性 质进行分离纯化的。凝胶层析的固定相是 惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部具 有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有 不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析 柱后，各个组分就向固定相的孔穴内扩散， 组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分 分子大小。
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换
层 阴 强碱型
季胺基团（ N(CH3)3），
析 分
离 子
中等碱型叔胺（
N(CH3)2）、仲胺（
NHCH3）、伯胺（-N
类 交 弱碱型
二乙基氨基乙基（DEAE）
换
剂
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离子交换剂可以 分为三部分：
(高分子聚合物)基质、电荷基团和 平衡离子
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吸附层析根据操作方式的不同，分为 柱层析和 薄层层析两种
洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
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载体 ： 硅胶 氧化铝 羟基磷灰石
应用：
分离纯化蛋白质、酶、氨基酸、核苷 酸 等生化物质
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a. 待纯化分子和配体间具有亲和性
+
配体 待纯化分子
b. 活性基质与配体结合产生亲和吸附剂
+
基质
c. 待纯化分子与亲和吸附剂结合，与杂质分离
+
+
杂质
d. 偶联复合物经解离后，得到纯的待纯化分子
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+
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配体 L
待分离物质 S L-S复合物
基质 M
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基质 纤维素、聚丙烯酰胺凝胶、
sepharose、sephadex
应用 分离纯化酶、 抗原、抗体
分离纯化核酸 研究酶的结构与功能
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聚焦层析（Chromatofocusing） 原理
该法是在等电点聚焦方法基础上发展起来的，其分离纯化 蛋白质的依据是等电点的差异和离子交换行为。蛋白质按其等 电点在pH梯度环境中进行排列的过程叫做聚焦效应。
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数值越大，表明基质对该物质的亲合力越强。 应当注意，同一种基质对不同种类分子的 操作容量是不相同的，这主要是由于分子 大小（空间效应）、带电荷的多少、溶剂 的性质等多种因素的影响。因此，实际操 作时，加入的样品量要尽量少些，特别是 生物大分子，样品的加入量更要进行控制， 否则用层析办法不能得到有效的分离。
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载体
葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（sepharose）
应用:
测定分子量 脱盐和浓缩 分离提纯生物 大分子 除去热原物质
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离子交换层析（ion-change chromatography）
原理 离子交换层析是依据各种离子或离子
化合物与离子交换剂的结合力不同而进行 分离纯化的。离子交换层析的固定相是离 子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高 分子聚合物基质通过一定的化学反应共价 结合上某种电荷基团形成的。
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二、层析法分类（按分离原理分类 ）
分配层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛层析） 离子交换层析 亲和层析 聚焦层析
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层析法分类（按装置分类 ）
纸层析 薄膜层析 柱层析17.11.2020源自h19洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
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Rf = ────────────── 溶剂前缘至原点中心的距离
载体 ： 纤维素 硅藻土 硅胶
应用：各种生化物质的分离鉴定
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凝胶层析（gel filtration）
又称为凝胶排阻层析（gel exclusion chromatography）、分子筛层析 （molecular sieve chromatography）、
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2.流动相：
在层析过程中，推动固定相上待分离的 物质朝着一个方向移动的液体、气体或超 临界体等，都称为流动相。柱层析中一般 称为洗脱剂，薄层层析时称为展层剂。它 也是层析分离中的重要影响因素之一。
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3.分配系数及迁移率（或比移值）： 分配系数是指在一定的条件下，某种组分在固定 相和流动相中含量（浓度）的比值，常用K来表 示。分配系数是层析中分离纯化物质的主要依据。