无缝克隆,同源重组克隆

一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法[发明专利]

(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510507988.5(22)申请日 2015.08.18C12N 9/12(2006.01)C12N 15/63(2006.01)(71)申请人翌圣生物科技（上海）有限公司地址201203 上海市浦东新区张江高新科技园区蔡伦路781号504室(72)发明人方筱玉(74)专利代理机构上海旭诚知识产权代理有限公司 31220代理人郑立(54)发明名称一种重组酶复合物及体外同源重组无缝克隆的方法(57)摘要本发明涉及一种重组酶复合物，该重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec 同源重组酶，包括RecE、RecT 和Gamma 蛋白。

本发明还提供了一种体外同源重组无缝克隆的方法，只需将两端带有载体末端序列的PCR 产物和线性化克隆载体按一定比例混合，在该重组酶复合物的催化下，高效率地将目标DNA 定向克隆到任意载体的任意位点，克隆阳性率可高达95％以上。

本发明的方法尤其适用于DNA 大片段的克隆。

本发明弥补了传统克隆方法操作繁琐、费时、失败率较高等缺陷，可以为DNA体外重组提供一种快速便捷高效的克隆方法，在细胞学基础研究和工农业生产、医药保健等方面奠定重要的基础。

(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表3页附图1页CN 105087517 A 2015.11.25C N 105087517A1.一种重组酶复合物，其特征在于，所述重组酶复合物来源于大肠杆菌Rec同源重组酶，所述重组酶复合物包括RecE、RecT和Gamma蛋白。

2.根据权利要求1所述的重组酶复合物，其特征在于，所述RecE、所述RecT和所述Gamma蛋白三种重组酶的含量比例为1:1:2。

3.一种体外同源重组无缝克隆的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤一：制备线性化克隆载体；步骤二：制备插入片段PCR产物，通过在引物5’端引入所述线性化克隆载体的末端同源序列，使得所述插入片段PCR产物的5’端和3’端分别带有和所述线性化克隆载体两个末端对应的完全一致的序列；步骤三：将步骤一中获得的所述线性化克隆载体与步骤二中获得的所述插入片段PCR 产物在如权利要求1或2所述的重组酶复合物的作用下进行重组反应；步骤四：将步骤三中获得的重组产物进行细胞转化，获得转化细胞；步骤五：将步骤四中获得的所述转化细胞进行培养，并进行克隆鉴定，得到经所述克隆鉴定为阳性的重组DNA分子。

同源序列法克隆目的基因

同源序列法克隆目的基因同源序列法克隆是一种常用的基因克隆方法，用于获取目的基因的DNA序列。

同源序列法克隆的主要步骤如下：1. 设计引物：根据已知目的基因的序列，设计一对引物（即寡核苷酸片段），其中一个引物具有与目的基因的5'端相互匹配，另一个引物具有与目的基因的3'端相互匹配。

2. 提取模板DNA：从包含目的基因的源生物体中提取总DNA 或特定组织/细胞中的DNA作为模板。

3. 聚合酶链反应（PCR）扩增：在PCR反应中使用设计的引物和模板DNA来扩增目的基因的DNA序列。

PCR反应通过多次循环加热和冷却来产生大量DNA复制品。

4. 凝胶电泳分析：将PCR扩增产物与分子量标记物一起加载在琼脂糖凝胶上进行电泳分离。

通过比较扩增产物与标记物在凝胶上的迁移距离，可以确定是否成功扩增了目的基因。

5. 纯化目的基因：从PCR反应中纯化目的基因的扩增产物，一般使用凝胶切片、DNA纯化试剂盒等方法。

6. 连接到载体：将纯化的目的基因DNA与适当的载体（如质粒）进行连接。

这通常涉及酶切目的基因和载体的DNA，然后使用连接酶将它们连接在一起。

7. 转化宿主细胞：将连接的DNA导入宿主细胞中，使其自行复制和表达。

这可以通过转染、电穿孔或热激冲等方法实现。

8. 筛选与鉴定：通过对转化后的细胞进行选择性培养或检测，筛选出带有目的基因的克隆。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选等。

9. 验证目的基因：最终需要验证克隆中是否成功插入了目的基因。

这可以通过DNA测序、限制性酶切、PCR等方法来进行。

同源序列法克隆是一种有效的基因克隆技术，可用于获得感兴趣的基因序列并进一步研究其功能、表达和调控机制等。

综述：无缝克隆与基因融合(中文版)

无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具。

准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。

本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法前言随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。

基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。

传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。

然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。

这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。

这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。

无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。

这是获得杂交基因的理想情况。

以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。

启动子和外显子研究基因启动子含有许多调控元件。

转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。

启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。

然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。

基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。

分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。

在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。

在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。

只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。

综述：无缝克隆与基因融合(中文版)

无缝克隆与基因融合基因融合技术是基因功能研究的关键工具。

准确拼接的杂合分子，没有任何无关的序列，使我们可以对分子进行精确的研究。

本篇综述介绍了无缝融合基因和蛋白的应用，以及获得这些杂交分子的方法前言随着各种基因组测序项目的完成，人们越来越关注基因产物的功能分析。

基因融合技术在基因功能研究的许多方面具有重要的作用，包括基因和蛋白标记，报告基因的研究，结构域互换研究，突变研究和基因敲除或者插入实验。

传统的基因融合技术涉及到type II 限制酶消化和DNA连接反应（所谓的剪切/粘贴反应），曾被用来作为构建杂交基因的标准方法。

然而，这种方法常常会在接合处留下操作的序列，例如酶切位点。

这些多余的序列可以改变DNA元件的间隔，在接合处引入多余的氨基酸残基，可能对融合蛋白的结构和功能产生不需要的影响，因此影响对融合基因精确的研究。

这篇综述讨论了精确融合基因的应用之处，概括了实现无缝基因融合的方法。

无缝基因融合及其应用无缝克隆和基因融合就是将两个或者更多DNA片段精确结合在一起，在DNA片段的接合处没有任何不需要的序列。

这是获得杂交基因的理想情况。

以下强调几个例子，以表明无缝基因融合的重要性。

启动子和外显子研究基因启动子含有许多调控元件。

转录因子与它们结合并互相影响来调控转录。

启动子删除分析使我们鉴定到这些功能元件，获得关于基因调控机制的重要信息。

然而，因为不同调控元件之间的间隔常常是非常重要的，通常需要长度不变的linker来维持这些元件的间隔和螺旋面。

基因启动子的linker扫描分析需要无缝DNA融合或者序列替换技术。

分子演化方法例如外显子和DNA转移来获得具有需要生化和/或生理特征的蛋白也需要不同功能元件的无缝拼接。

在真核细胞中，通过内含子介导的RNA拼接可以构建嵌合体基因和/或蛋白。

在这些实验中RNA底物的合成和/或外显子标记核酶需要认真的设计，得到嵌合体前体基因。

只要杂合基因形成正确，无缝融合就可以通过拼接实现。

实例分享-一步法构建同源重组载体

汉恒生物科技(上海)有限公司 400-092-0065一步法构建同源重组载体同源重组载体构建需要分别克隆目的片段两端的同源臂（长度~1kb ），并与Marker 基因进行连接。

传统的构建方法是两段同源臂分别克隆构建到目的载体，费时费力。

在本例中，本人已经成功应用汉恒生物科技（上海）有限公司的HB-Infusion TM 无缝克隆试剂盒，将同源臂及Marker 基因一步成功构建到载体上，现将实验过程及结果分享如下：1. 目的片段引物的设计用NEB builder （https:///watch?v=8_-t5xtJ3y8），或snapgene ，genome compiler 等软件，将三个目的片段的基因序列、线性化载体的基因序列按照软件使用说明依次填入，将自动生成所需要的引物序列（如下表）。

将引物提交华大基因进行合成。

引物序列列表2. 目的片段的扩增反应体系汉恒生物科技(上海)有限公司 400-092-0065DNA(248ng/μL) 1 μL Forward Primer (10μM)2 μLReverse Primer(10μM) 2 μL ExTaq premix 25 μL DDW 20 μL Total50 μL（注：此步反应中的酶最好用高保真酶，以免产物出现错配）PCR 反应程序95℃ 4 min95℃ 30 s 65℃ 30 s 72℃ 1~2.5 min 72℃10 min将扩增到的PCR 产物，用1%琼脂糖凝胶电泳后，进行胶回收并用Nanodrop 测量核酸浓度。

图1. 三个目的片段凝胶电泳结果34cycles汉恒生物科技(上海)有限公司 400-092-00653. 载体的线性化酶切：Plasmid 2 μg SacI 2 μL XbaI2 μL 10×M bμffer 5 μL DDW 39 μL Total50 μL37℃酶切4h 后，用1%凝胶电泳进行分析，并用Axygen 凝胶回收试剂盒进行胶回收。

同源重组法分子克隆 -回复

同源重组法分子克隆 -回复同源重组法是分子克隆技术中的一种重要方法，其基本原理是利用DNA的同源性重组来插入外源DNA序列到宿主DNA中。

同源重组法在基因克隆、遗传工程等领域得到了广泛应用。

本文将详细介绍同源重组法的原理、步骤及应用。

一、同源重组法的原理同源重组法的原理基于DNA分子的自身结构和功能，DNA分子在某些条件下能够进行重组、修复和重复。

同源重组是指两个DNA分子之间具有相似序列（同源）的区域进行交换而形成的DNA分子重组。

同源重组法基于此原理，通过在宿主DNA中引入重组的同源片段，将外源DNA序列插入到宿主DNA中。

同源重组法的原理可以分为两个步骤：相互间接断裂和互补配对。

两个DNA分子的同源片段同时发生间接断裂，获得可供基因重组的末端。

接下来，由于互补配对的作用，从两个DNA分子中间的同源片段在一定条件下进行配对，形成插入、缺失、互换等不同类型的重组产物。

1. 构建载体DNA：载体DNA是将外源DNA插入到宿主DNA中的重要工具，构建载体DNA 需要选择有适当限制酶切位点的载体和外源DNA。

一般来说，常用的载体包括质粒、噬菌体、噬菌体样颗粒等。

2. 制备DNA片段：外源DNA片段可以通过PCR扩增、酶切和DNA合成等技术制备。

需要注意的是，PCR扩增要确保扩增的DNA片段与宿主DNA具有一定的同源性。

3. 利用限制酶切割载体和外源DNA：根据预定的酶切位点设计限制酶切位点并进行酶切。

4. 进行杂交和拼接：将外源DNA片段与载体DNA杂交，并通过互补配对将DNA片段与载体DNA进行拼接。

5. 转化大肠杆菌：利用化学方法或电击法将构建好的载体DNA转化到大肠杆菌中，转化后得到含外源DNA的菌落。

6. 筛选阳性菌落：利用选择性培养基和荧光素酯分析方法等技术筛选阳性菌落。

7. 测序鉴定：对筛选出的阳性菌落进行测序，并鉴定插入的外源DNA序列是否正确。

同源重组法是分子克隆领域中一种非常实用的技术。

汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)

汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)HB-infusion TM无缝克隆试剂盒使用说明（附原理说明）一、产品简介HB-infusion TM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。

HB-infusion TM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp同源序列（图1，图3）。

将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。

图1. HB-infusion TM快速克隆试剂盒原理示意图。

1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR获取目的片段。

设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM的2⨯预混液内，50︒C反应20 min后直接转化E.coli即可。

二、HB-infusionTM试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；注：1. 为了降低载体自连背景，提高阳性率，建议采用双酶切载体质粒。

酶切最好能切出一个较大片段，这样回收的目的条带可以和没有切开的质粒明显分开。

2. 质粒单酶切容易造成载体切割不完全和自连，导致假阳性的产生。

因此，必须单酶切的时候建议延长酶切时间并脱磷处理（酶切2h-过夜，CIP处理20 min），同时做好空载的对照。

3. 请务必跑胶回收线性化的载体，否则非线性化质粒会带来极高的背景。

同源重组技术的原理和应用

同源重组技术的原理和应用同源重组技术（Homologous recombination technology，HRT）是一种常用的基因编辑技术，它能够在特定部位改变DNA序列，用于治疗某些遗传性疾病、研究基因表达调控和蛋白质结构等方面。

本文将介绍同源重组技术的原理和应用。

1. 同源重组技术的原理同源重组技术是利用质粒、病毒等载体携带的外源基因通过靶向指向的方式将其导入到细胞或生物体中，从而达到改变生物体基因组的目的。

具体来说，同源重组技术是基于DNA的相互作用原理进行的。

DNA由四种碱基（腺嘌呤、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和胞嘧啶）构成，它们之间形成了氢键，使得两条互补的DNA链可以通过这些氢键相互结合。

在同源重组中，DNA分子的另一端则通过DNA酶和锌指核酸酶来实现切割和精准定位。

一旦发现了具备相同序列的区域，这些酶就会将外源基因定向到位点，与染色体上的同源序列组成DNA双链，从而取代了原有的序列，以达到修复或替换某些基因的效果。

2. 同源重组技术的应用同源重组技术的应用广泛，其中最重要的是对基因的编辑和修复。

以下将介绍几种常见的同源重组技术应用：(1)质粒介导同源重组质粒介导同源重组是一种常用的基因工程技术。

这种技术主要是利用菌单倍体的同源重组能力，通过转化质粒来实现有选择性地在DNA的特定区域插入新基因。

这种技术特别适用于菌类以及一些单细胞真菌和原生生物。

(2)病毒介导同源重组病毒介导同源重组则运用了病毒自身的重组机制特征，对其进行了改造，使其能够以带选择性的方式在目标细胞中整合外源基因。

这种方法目前已经广泛应用于人类基因治疗领域，尤其在修复致病基因和引入新基因方面取得了显著进展。

(3)基因组编辑基因组编辑技术可以通过同源重组来治疗遗传性疾病。

比如，在用于治疗Friedreich's ataxia（FA）的基因治疗研究中，研究团队采用基因克隆技术构建了能够靶向FA基因的重组质粒，并通过同源重组的方式将其导入细胞中。

ClonExpress_MultiS多片段一步克隆定向克隆无缝克隆快速克隆试剂盒说明书

TM
环状质粒扩增特异 PCR制备有明显非特异性扩增预线性化质粒、基因组、cDNA
胶回收
表一：线性化克隆载体的使用方式注：直接使用酶切产物或扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5) 。
４．２线性化克隆载体制备选择合适的克隆位点，并对克隆载体进行线性化。我们推荐您尽量选择无重复序列且GC含量均匀的区域进行克隆。当载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量均在
图二：第一片段的正向扩增引物和第三片段的反向扩增引物设计示意注：如最终引物长度超过40 bp，我们推荐您在引物合成时选用PAGE纯化，可提高克隆成功率。计算扩增引物退火温度时，只需计算基因特异性扩增序列的Tm值，载体末端同源序列不应参与计算。

05/ 06
PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产量和特异性。 ClonExpressTM MultiS重组反应体系兼容常规PCR反应体系。因此，如扩增模板不是与克隆载体抗性相同的环状质粒，且PCR产物电泳条带单一，扩增产物可以无需纯化直接用于重组反应。 PCR扩增产物DNA纯度较低，直接使用进行重组反应时，重组效率、克隆阳性率都会有所降低。因此，在进行较大片段 (>5kb) 克隆实验时，我们推荐您使用高质量的试剂盒对扩增产物进行胶回收纯化以提高DNA纯度。插入片段扩增产物的使用方式可查阅表二。
注意: 我们推荐您在PCR仪或者水浴锅等温控比较精确的仪器上进行反应。重组效率在反应30 min左右达到最高，反应时间不足或者太长都将会降低克隆效率。
扩增特异
有明显非特异性扩增
表二：扩增产物推荐使用方式注：直接使用扩增产物进行重组反应时，使用体积不应超过4 μl (重组反应总体积的1/5)。 * 当线性化克隆载体为酶切制备时，插入片段扩增产物经DpnI消化结束后应置于85℃加热20 min将DpnI 失活，以避免重组反应时残留DpnI 对克隆载体的降解。

无缝克隆,同源重组克隆

简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。

它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。

装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。

（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。

首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。

然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。

最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。

这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。

下面是组装的示意图。

材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。

如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。

同源重组的原理和应用

同源重组的原理和应用原理同源重组是一种基因工程技术，旨在将不同物种或同一物种中的不同基因进行重新组合，以产生新的组合基因。

它基于DNA重组的原理，通过将两个或多个DNA片段切割并重新连接，创建具有新功能或表现的重组DNA序列。

DNA重组可以通过不同的方式进行，包括酶切和基因重配等。

其中酶切是最常用的方法，它利用特定的限制酶识别并切割DNA的特定序列，然后将切割后的DNA片段重新连接起来。

通过这种方式，可以将不同物种或同一物种中的不同基因片段进行重组，产生全新的DNA序列。

同源重组的原理基于两个主要的相似性原则：同源性和互补性。

同源性指的是两个或多个DNA片段具有相似的序列或结构，使得它们可以相互重组。

互补性则是指两个DNA片段的互补碱基序列可以通过酶的作用进行配对，从而实现重组。

应用同源重组的技术在生物科学和医学领域有着广泛的应用。

以下是一些重要的应用领域：1.基因克隆：同源重组是基因克隆的核心技术之一。

通过将目标基因与载体DNA进行同源重组，可以将目标基因插入到载体DNA中，然后将复合物转入宿主细胞中进行表达。

这种技术可以用来研究基因功能、制备基因工程药物等。

2.转基因生物：同源重组在转基因生物的制备中起着重要的作用。

通过将外源基因与宿主基因进行同源重组，可以将外源基因导入到宿主细胞中，从而使得宿主细胞表达外源基因产生新的性状或功能。

3.基因治疗：同源重组在基因治疗中也有广泛的应用。

通过将具有治疗效果的基因与载体DNA进行同源重组，可以将治疗基因导入到患者的细胞中，从而治疗一些遗传性疾病或造成器官损伤的疾病。

4.研究基因功能：同源重组可以用来研究基因的功能和调控机制。

通过将特定的基因进行删除、替换或重组，可以观察到基因功能的变化，从而揭示基因的生物学功能和相互作用。

5.创新药物研发：同源重组在新药研发中有着重要的作用。

通过对已知药物的基因进行同源重组，可以创造出具有更高效率或更低毒性的新药物。

ClonExpress

使用说明书Version 22.101/产品概述 02/产品组分03/保存条件04/适用范围05/自备材料06/注意事项07/实验原理与流程概要08/实验流程08-1/线性化载体制备08-2/插入片段获得08-3/线性化载体与插入片段的使用量08-4/重组反应08-5/重组产物转化08-6/重组产物鉴定09/常见问题与解决方案.....................................................................................................02 .................................................................................................... 02.................................................................................................... 02..................................................................................................... 02.................................................................................................... 02.................................................................................................... 03.................................................................................. 04.................................................................................................... 04.. (04) (04) (06) (07) (07) (07).................................................................................. 09目录 Contents*所有商标均属于各自商标所有者的财产。

无缝克隆技术的原理文献

无缝克隆技术的原理文献
无缝克隆技术（Seamless Cloning）是一种先进的基因克隆技术，其原理基于同源重组。

该技术利用同源序列将外源DNA片段精确地插入到载体DNA的特定位置，实现无缝拼接。

在无缝克隆过程中，首先需要构建一个含有目标DNA片段的载体，该载体通常是一个具有同源臂的质粒或噬菌体。

同源臂是位于载体DNA两端与目标DNA片段具有相同或相似碱基序列的DNA片段，其长度通常在几十到几百碱基对之间。

然后，将目标DNA片段与载体DNA在体外进行同源重组，生成重组DNA分子。

同源重组的效率取决于同源臂的长度、互补性以及是否存在促进重组的酶。

如果同源臂的长度足够长且互补性好，同源重组的效率就会很高。

最后，将重组DNA分子导入到宿主细胞中，并在宿主细胞内进行筛选和扩增，最终获得含有目标DNA片段的无缝克隆。

无缝克隆技术的优点在于其高效率和精确性，可以避免传统基因克隆方法中可能出现的错配和突变等问题。

此外，该技术还可以用于定点突变、基因敲除和基因敲入等基因编辑操作，因此在基因工程、基因治疗和合成生物学等领域具有广泛的应用前景。

请注意，无缝克隆技术需要精确的设计和操作，以确保同源臂的正确匹配和重组的成功。

此外，由于该技术涉及到基因操作，因此需要遵守相关的伦理和法规规定。

同源重组法

同源重组法同源重组法是一种基因工程技术，它利用两个相似的DNA序列进行重组，从而获得新的DNA序列。

同源重组法可以用于制造基因突变、研究蛋白质结构和功能、制造转基因生物等方面。

下面将从原理、步骤、应用等方面详细介绍同源重组法。

一、原理同源重组法是利用两个相似但不完全相同的DNA序列进行交换来实现基因突变或转移的技术。

其原理是利用同源性使两个DNA分子在某些区域上发生配对并形成交叉点，然后通过切割和连接过程使两个分子互换部分或全部的DNA片段，从而形成新的DNA序列。

二、步骤同源重组法主要包括以下几个步骤：1.选择合适的启动子和标记基因首先需要选择一个适合的启动子和标记基因，以便在实验中检测到目标基因是否已经被成功地插入到宿主细胞中。

2.构建质粒接下来需要构建一个含有目标基因及其上下游区域的质粒。

这可以通过PCR扩增目标基因及其上下游区域，并将其与适当的质粒进行连接来实现。

3.转化宿主细胞将构建好的质粒导入宿主细胞中，使其能够表达目标基因。

4.筛选阳性克隆通过筛选阳性克隆，确定哪些宿主细胞已经成功地转化并表达了目标基因。

5.验证重组最后需要验证重组是否成功。

这可以通过PCR、Southern blotting、Western blotting等方法来实现。

三、应用同源重组法在生物学研究和工业生产中有广泛的应用。

以下是一些常见的应用：1.制造基因突变同源重组法可以用于制造基因突变。

通过将一个DNA分子与另一个相似但不完全相同的DNA分子进行交换，可以在目标基因上引入点突变或插入/删除突变等。

2.研究蛋白质结构和功能同源重组法还可以用于研究蛋白质结构和功能。

通过将两个不同的蛋白质序列进行交换，可以得到新的蛋白质序列，并进一步研究其结构和功能。

3.制造转基因生物同源重组法也可以用于制造转基因生物。

通过将目标基因插入到宿主细胞的染色体中，可以实现转基因生物的制造。

四、总结同源重组法是一种非常重要的基因工程技术，其原理简单但应用广泛。

无缝克隆,同源重组克隆

简介（INTRODUCTION）原理：Gibson assembly是一种one step, one pot的快速基因组装方法。

它只需要将基因片段和需要的三种酶混合在同一个管内在50°C下培养15-60 min就可以得到组装好的DNA。

装配原理基于DNA片段间的重叠区域，过程依赖于三种酶：DNA 外切酶（T5 exonuclease）,高保真DNA聚合酶。

（Phusion polymerase）和耐热DNA连接酶（Taq DNA ligase）的共同作用。

首先，T5 核酸外切酶消化DNA片段的链方向是从5’到3’. 每个DNA片段分别形成一个单链的突出部分，由于着这两个相邻的突出片段有一部分具有同源性能够互补，所以DNA片段退火，互补的序列重新配对连接。

然后，在空缺的部分DNA聚合酶以另一条DNA 单链为模板，沿3' 方向将对应的脱氧核苷酸连接到单链上，填补缺口。

最后，连接酶将两条DNA 单链黏合起来，密封裂缝。

这样具有重叠区域的DNA片段就组装成一整条DNA分子了。

下面是组装的示意图。

材料（MATERIALS）试剂（REAGENTS）NAD，H2O ，1 M MgCl2，1 M DTT，10 mM dNTP mix，1 M Tris-HCl pH 7.5，50% PEG-8000，2.7 mg/ mL Tag ligase，0.85 μg/ mL T5_ExO，Phusion(1×)、LB培养基、抗生素（据载体而定）、LB平板（相应抗性）实验前准备（SETUP）于冰水浴中配制如下反应体系。

如果不慎将液体粘在管壁，可通过短暂离心使其沉入管底。

4x isothermal assembly bufferNAD 20 mgH2O 300 μL1 M MgCl2300 μL1 M DTT 300 μL10 mM dNTP mix 600 μL1 M Tris-HCl pH 7.5 3 mL50% PEG-8000 3 mL加水到7.5 mL，每管分500 μL存于-20°C 或-80°C冰箱,够3000个反应2× assembly mix: best combination:100 reaction 1 mL2.7 mg/ mL Tag ligase 10 μL0.85 μg/ mL T5_ExO 100 μLPhusion(1× ) 25 μL4× G.A. buffer 500 μL加水365 μL，存于-20°C冰箱，有效期1年。

汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)

汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)HB-infusion TM无缝克隆试剂盒使用说明（附原理说明）一、产品简介HB-infusion TM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。

HB-infusion TM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp同源序列（图1，图3）。

将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。

图1. HB-infusion TM快速克隆试剂盒原理示意图。

1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR获取目的片段。

设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM的2⨯预混液内，50︒C反应20 min后直接转化E.coli即可。

二、HB-infusionTM试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。

三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-infusion TM Master mix20 tests 200 μlPositive linearized pUC vector （250 ng） 5 tests 25 μlPositive control insert (500 ng) 5 tests 25 μl储存条件-20 ℃四、使用说明汉恒生物建议2-3个片段连接时，DNA片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6片段连接时加入的DNA总量为0.2~1.0 pmols。

同源重组的原理

同源重组的基本原理同源重组是一种基因工程技术，用于将来自不同来源的基因片段进行重组，以产生具有新功能的DNA序列。

同源重组在基因工程、生物医学研究和农业领域中得到广泛应用。

其基本原理涉及到DNA序列的剪接、连接和修复过程。

1. DNA序列剪接DNA序列剪接是同源重组的第一步。

它涉及到将两个或多个DNA片段进行切割，以便在适当的位置生成可连接的末端。

常用的DNA剪切酶如限制性内切酶（restriction endonuclease）可以识别特定的DNA序列，并在其特定位点上切割DNA链。

如果我们有两个DNA片段A和B，它们都被限制性内切酶切割成具有互补末端的片段：片段A：5’ - GATC - 3’ | 3’ - CTAG - 5’片段B：5’ - CTAG - 3’ | 3’ - GATC - 5’2. DNA序列连接DNA序列连接是同源重组的第二步。

它涉及到将经过切割并具有互补末端的DNA片段进行连接，以形成一个新的DNA序列。

连接通常通过DNA连接酶（DNA ligase）来完成。

在上面的例子中，DNA连接酶可以将片段A和B的互补末端连接起来：片段A：5’ - GATC - 3’ | 3’ - CTAG - 5’片段B：5’ - CTAG - 3’ | 3’ - GATC - 5’连接后的结果为：新序列：5’ - GATCCTAG - 3’ | 3’ - CTAGGATC - 5’3. DNA修复DNA修复是同源重组的最后一步。

在同源重组过程中，DNA片段被切割和连接，可能导致一些错误或缺失。

需要进行DNA修复以纠正这些错误并恢复完整的DNA序列。

常见的DNA修复机制包括非同端接合（non-homologous end joining）和同端接合（homologous recombination）。

•非同端接合是一种快速但不准确的修复机制，它将两个断裂的DNA末端直接连接起来，但可能引入缺失或突变。

汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)

HB-infusion TM无缝克隆试剂盒使用说明（附原理说明）一、产品简介HB-infusion TM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。

HB-infusion TM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段PCR引物的5’端引入与载体克隆位点两端完全一致的15~25 bp同源序列（图1，图3）。

将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按合适比例混合，并加入HB-infusion TM Master mix，通过反应体系中DNA外切酶、DNA聚合酶以及连接酶的在50℃反应20 min即可快速完成定向克隆，阳性率几近100%。

图1. HB-infusion TM快速克隆试剂盒原理示意图。

1. 线性化目的载体（左上）；2. PCR获取目的片段。

设计的引物５’需要和线性化载体末端有15~25 bp的重叠（图中蓝色和黄色片段，细节可参考图3）；3. 按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM的2⨯预混液，50︒C反应20 min后直接转化E.coli即可。

二、HB-infusionTM试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反应即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；3. 连接片段之间不会引入任何其他序列；4. 可以同时克隆多个片段。

三、产品包装四、使用说明汉恒生物建议2-3个片段连接时，DNA片段的使用总量为0.02~0.5 pmols，4~6片段连接时加入的DNA总量为0.2~1.0 pmols。

DNA拼接效率随着拼接片段的数量增加或者拼接片段长度的增加逐渐降低。

附：片段摩尔数量计算公式：pmols=片段质量(ng)⨯1000/(碱基对数⨯650 daltons)（碱基数越多，pmols越少；质量越大，pmols越多），举例如下：注：50 ng的5000 bp（0.015 pmols）的线性化dsDNA和10~25 ng（0.03~0.075 pmols）500 bp的PCR产物体系（PCR产物和线性化载体的摩尔比=2：1~5：1）。