纳米羟基磷灰石／丝素蛋白多孔支架材料的制备和表征

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纳米羟基磷灰石的常压合成与表征

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小结
自然骨磷灰石是细针状，弱结晶，含 CO2 3 、
本实验研制的纳 HPO2 4 等离子的纳米磷灰石晶体，
米磷灰石晶体也具有相同性状。也就是说，本方法常压下合成的磷灰石晶体和自然骨磷灰石在组成结
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左
奕等：纳米羟基磷灰石的常压合成与表征 Mater Sci ： Mater
［ 7］ Li Yubao. In：Synthesis and characterization of bone-iike minerais： macro-scopic approach and microscopic emuiation. Preparation and characterization of nanograde caicium phosphate needie-iike crystais. Amsterdan： Academic Pers Press， 1994 . 66 ［ 8］ Osaka A，Miura Y，et ai. 51 ［ 9］ Li Y，Zhang X，de Groot K. Biomaterials ，1997，18：737 ［10］Zhou J，Zhang X， Chen J， et ai. 1993，4：83 ［11］ Rey C，Giimcher MJ. In：Siavkin H，Price P，ed. Chemistry and bioiogy of mineraiized tissues. North Hoiiand：Eisevier， 1992，5 ［12］ Neison D G A. Dent Res 1981，60C：1621 ［13］ Aoki H. Science and medicai appiications of hydroxyapatite. （ JAAS） . Tokyo： TakayaJapan Association of Apatite Science ma Press System Center Co，1991 ［14］马克昌，冯坤，朱太泳等主编 . 骨生理学 . 河南：河南医科大学出版社， 2000 . 137 Mater Sci Mater Med ， Mater Sci ：Mater Med ， 1991， 2：

丝素蛋白-明胶-壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估

丝素蛋白-明胶-壳聚糖-羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估作者：谷明西王常成田丰德郝瑞胡安宁郭林来源：《丝绸》2023年第11期Preparation and performance evaluation of silk protein-gelatin-chitosan-hydroxyapatiteporous scaffolds摘要：文章以絲素蛋白（SF）、明胶（Gel）、壳聚糖（CS）和羟基磷灰石（Hap）为基础材料，通过真空冷冻干燥和化学交联制备了5组SF-CS-Gel-nHap多孔支架（Hap-1%、Hap-2%、Hap-3%、Hap-4%、Hap-5%）。

通过扫描电子显微镜、X射线衍射仪（XRD）、孔隙率、吸水膨胀率、生物降解率及力学性能研究，筛选出理化性能优越适合全层软骨缺损再生重建的复合支架。

随后将其与骨关节炎患者分离提取的软骨细胞共培养，通过细胞黏附率测定、细胞活死染色和CCK-8细胞活性增殖实验等方法评估多孔支架的生物性能，探索其用于修复全层软骨缺损的可行性。

结果显示，基于明胶、壳聚糖、丝素蛋白和纳米羟基磷灰石制备的SF-CS-Gel-2%Hap多孔复合支架不仅可以模拟天然骨软骨的细胞外基质（ECM），而且具有良好的生物相容性，能够为营养物质的转运和细胞黏附、增殖和立体生长提供良好的网状骨架，为全层软骨缺损的治疗提供新的选择。

关键词：组织工程;支架;全层软骨缺损;丝素蛋白;壳聚糖;明胶;羟基磷灰石中图分类号：TS102.1; Q813文献标志码：A文章编号： 10017003（2023）110001起始页码09篇页数引用页码：111101DOI： 10.3969/j.issn.1001-7003.2023.11.001（篇序）收稿日期：20230128;修回日期：20231011基金项目：作者简介：谷明西（1992），男，医学硕士，主要从事骨关节炎和组织工程方面的研究。

通信作者：郭林，教授，**************。

纳米羟基磷灰石_丝素蛋白_聚己内酯复合超细纤维的制备及表征

复合材料学报第27卷　第2期 4月　2010年A ct a M ateri ae C om p o sit ae Sini c aVol 127No 12April2010文章编号:100023851(2010)022*******收稿日期:2009204208;收修改稿日期:2009207202基金项目:973计划前期研究课题(2008CB617506);长江学者和创新团队发展计划资助(IR T0654);先进纺织材料与制备技术教育部重点实验室开放基金资助项目(2006003)通讯作者:熊　杰,教授,博士生导师,主要从事纤维及其复合材料研究工作　E 2mail :jxiong @纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚己内酯复合超细纤维的制备及表征唐圣奎1,熊　杰31,李　妮1,谢军军2,肖红伟1,张红萍1(1.浙江理工大学先进纺织材料与制备技术教育部重点实验室,杭州310018;2.杭州师范大学临床医学院,杭州310036)摘　要:　通过静电纺丝法制备出纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚己内酯复合超细纤维,利用扫描电镜、红外光谱仪、X 射线衍射仪对纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚己内酯复合超细纤维形貌和结构进行表征,并进行了拉伸测试。

结果表明,随着超细纤维中羟基磷灰石含量的增加,纤维的直径逐渐降低,纤维中聚己内酯的结晶逐渐变差。

相比于丝素蛋白/聚己内酯超细纤维,含有质量比为30%羟基磷灰石的复合超细纤维仍具有较好的力学性能。

体外小鼠成纤维细胞(L929)培养表明,纳米羟基磷灰石/丝素蛋白/聚己内酯复合超细纤维对细胞没有毒性。

关键词:　纳米羟基磷灰石;丝素蛋白;聚己内酯;静电纺丝;复合超细纤维中图分类号:　TB332 文献标志码:APreparation and characterization of ultraf ine nano 2hydroxyapatite/silk f ibroin/poly(ε2caprolactone)composite f ibersTAN G Shengkui 1,XION G Jie 31,L I Ni 1,XIE J unjun 2,XIAO Hongwei 1,ZHAN G Hongping 1(1.Key Laboratory of Advanced Textile Materials and Manufacturing Technology ,Ministry of Education ,Zhejiang Sci 2Tech University ,Hangzhou 310018,China ;2.Clinical Medical College ,Hangzhou Normal University ,Hangzhou 310036,China )Abstract :　Ultrafine nano 2hydroxyapatite (n HA )/silk fibroin (SF )/poly (ε2caprolactone )(PCL )composite fibers were prepared via electrospinning.Scanning electron microscopy (SEM ),attenuated total reflectance 2Fourier transform infrared spectroscopy (A TR 2FTIR )and X 2ray diff raction (XRD )were used to characterize the electrospun ultrafine n HA/SF/PCL composite fibers.The mechanical properties of fibers were also tested.The results show that the diameter of the fibers decreases and the crystallinity of PCL in the fibers becomes poor with increasing n HA content in the pared with SF/PCL fibers ,the mechanical properties of ultrafine n HA/SF/PCL composite fibers are still well when the n HA mass ratio is 30%in the fibers.In vitro mouse fibroblast (L929)cell culture indicates that the ultrafine n HA/SF/PCL composite fibers are non 2toxicity.K eyw ords :　nano 2hydroxyapatite ;silk fibroin ;poly (ε2caprolactone );electrospinning ;ultrafine composite fiber 静电纺丝是一种简单、快速而高效的制备超细纤维技术,所得超细纤维膜具有孔隙率高、比表面积大等优点,使其在生物医用材料、过滤材料、传感器材料等领域有很好的应用前景。

丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估

研究与技术丝绸ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＳＩＬＫ丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ谷明西１ꎬ王常成２ꎬ田丰德３ꎬ郝瑞胡３ꎬ安㊀宁３ꎬ郭㊀林３(１.北京大学深圳医院内科ꎬ深圳５１８０００ꎻ２.大连理工大学医学部ꎬ大连１１６０８１ꎻ３.大连大学附属中山医院膝关节与骨肿瘤科ꎬ大连１１６００１)摘要:文章以丝素蛋白(ＳＦ)㊁明胶(Ｇｅｌ)㊁壳聚糖(ＣＳ)和羟基磷灰石(Ｈａｐ)为基础材料ꎬ通过真空冷冻干燥和化学交联制备了５组ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架(Ｈａｐ￣１％㊁Ｈａｐ￣２％㊁Ｈａｐ￣３％㊁Ｈａｐ￣４％㊁Ｈａｐ￣５％)ꎮ通过扫描电子显微镜㊁Ｘ射线衍射仪(ＸＲＤ)㊁孔隙率㊁吸水膨胀率㊁生物降解率及力学性能研究ꎬ筛选出理化性能优越适合全层软骨缺损再生重建的复合支架ꎮ随后将其与骨关节炎患者分离提取的软骨细胞共培养ꎬ通过细胞黏附率测定㊁细胞活死染色和ＣＣＫ￣８细胞活性增殖实验等方法评估多孔支架的生物性能ꎬ探索其用于修复全层软骨缺损的可行性ꎮ结果显示ꎬ基于明胶㊁壳聚糖㊁丝素蛋白和纳米羟基磷灰石制备的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ多孔复合支架不仅可以模拟天然骨软骨的细胞外基质(ＥＣＭ)ꎬ而且具有良好的生物相容性ꎬ能够为营养物质的转运和细胞黏附㊁增殖和立体生长提供良好的网状骨架ꎬ为全层软骨缺损的治疗提供新的选择ꎮ关键词:组织工程ꎻ支架ꎻ全层软骨缺损ꎻ丝素蛋白ꎻ壳聚糖ꎻ明胶ꎻ羟基磷灰石中图分类号:ＴＳ１０２.１ꎻＱ８１３㊀㊀㊀㊀文献标志码:Ａ㊀㊀㊀㊀文章编号:１００１７００３(２０２３)１１０００１０９引用页码:１１１１０１ＤＯＩ:１０.３９６９/ｊ.ｉｓｓｎ.１００１￣７００３.２０２３.１１.００１收稿日期:２０２３０１２８ꎻ修回日期:２０２３１０１１作者简介:谷明西(１９９２)ꎬ男ꎬ医学硕士ꎬ主要从事骨关节炎和组织工程方面的研究ꎮ通信作者:郭林ꎬ教授ꎬｇｋｙｓｇｌ＠１２６.ｃｏｍꎮ㊀㊀关节软骨主要由嵌有软骨细胞的细胞外基质(ＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＭａｔｒｉｘꎬＥＣＭ)组成ꎬ具有承载和缓冲作用ꎬ覆盖和保护骨骼免受数倍于身体质量的承重力的影响[１]ꎮ与大多数其他组织不同ꎬ软骨组织结构特殊ꎬ由于缺乏血管化和神经支配ꎬ软骨细胞少㊁增殖能力低ꎬ导致软骨损伤后的自我修复能力差ꎬ当损伤从软骨表层延伸到软骨下骨时ꎬ即发生全层软骨缺损(Ｆｕｌｌ￣ＴｈｉｃｋｎｅｓｓＣａｒｔｉｌａｇｅＤｅｆｅｃｔꎬＦＴＡＣ)[２]ꎮ组织工程(ＴｉｓｓｕｅＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＴＥ)是一种结合了工程学和细胞生物学的跨学科方法ꎬ旨在恢复㊁改善和维持组织功能[３]ꎬ已成为软骨组织再生和重建最常用的方法之一ꎮ种子细胞㊁支架材料及生长因子是制约软骨组织工程的三个关键性制约因素ꎬ其中作为组织形成模板的支架材料在ＴＥ中起着最重要的作用[４]ꎮ丝素蛋白(ＳｉｌｋＦｉｂｒｏｉｎꎬＳＦ)是一种具有出色机械性能㊁生物降解性㊁生物相容性和生物可吸收性的天然蛋白质[５]ꎮ壳聚糖(ＣｈｉｔｏｓａｎꎬＣＳ)是唯一带正电荷的天然多糖ꎬ与ＥＣＭ中发现的葡糖胺聚糖(ＧｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎꎬＧＡＧｓ)相似ꎬ不仅能够与带负电的ＧＡＧ发生静电相互作用ꎬ而且还能促进软骨特异性蛋白表达[６]ꎮ明胶(ＧｅｌａｔｉｎꎬＧｅｌ)是胶原蛋白的水解产物ꎬ具有高度的亲水性和出色的生物相容性ꎬ这有助于支架中的营养输送和细胞黏附[７]ꎮ羟基磷灰石(ＨｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅꎬＨａｐ)是天然骨骼的矿物质成分ꎬ具有骨传导特性㊁骨诱导特性㊁骨结合能力和原位降解缓慢等优势ꎬ已成功应用于临床骨修复[８]ꎮ然而由单一成分制成的支架在水和生理条件下的稳定性差ꎬ因此ꎬ可以将两种或多种聚合物混合以获得新材料[９￣１０]ꎮ本研究为了构建理想的组织工程支架ꎬ充分恢复关节软骨的原始成分㊁结构㊁力学和生物功能ꎬ以明胶㊁壳聚糖㊁丝素蛋白和羟基磷灰石为基础材料ꎬ通过真空冷冻干燥和化学交联开发一种能够满足骨软骨ＥＣＭ和成骨成软骨双向分化要求的三维多孔支架ꎬ探索其用于修复软骨缺损的可行性ꎮ１㊀方㊀法１.１㊀材㊀料蚕茧(西北养蚕工业基地)ꎻ甲苯胺蓝染色液㊁透析袋(北京索莱宝科技有限公司)ꎻ脱乙酰度ȡ９５％的壳聚糖㊁明胶㊁溴化锂㊁Ｎ￣羟基琥珀酰亚胺㊁碳酰二亚酸盐(上海麦克林生化科技有限公司)ꎻＤＭＥＭ/Ｆ１２培养基(海克隆Ｈｙｃｌｏｎｅ生物科技１Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ公司)ꎻ澳洲胎牛血清(美国赛默飞公司Ｇｉｂｃｏ胎牛血清)ꎻＣＣＫ￣８细胞增殖试剂盒㊁活死细胞染色试剂盒(Ａｂｂｋｉｎｅ亚科因生物技术有限公司)ꎻ碳酸氢钠(国药集团药业有限公司)ꎬＩＩ型胶原酶(百普赛斯Ｂｉｏｓｈａｐ生物科技公司)１.２㊀主要实验溶液的配制１.２.１㊀壳聚糖溶液称取３ｇ壳聚糖(脱乙酰度ȡ９５％)粉末溶解于１００ｍＬ１％醋酸溶液中ꎬ磁力搅拌４ｈ直至完全溶解ꎬ然后过滤溶液以除去杂质ꎮ１.２.２㊀明胶溶液称取３ｇ生物明胶溶解于５０ħ１００ｍＬ超纯水中ꎬ水浴加热并持续搅拌至完全溶解ꎮ１.２.３㊀丝素蛋白溶液１)脱胶:挑选优质干净的蚕茧ꎬ将切好的茧块加入沸腾的０.５％Ｎａ２ＣＯ３溶液中ꎬ煮沸６０ｍｉｎꎬ然后用蒸馏水浸泡洗涤１０ｍｉｎꎬ重复２~３次后烘干ꎮ２)溶解:按照１︰６的比例将脱胶蚕丝在６０ħ条件下溶解于９.３ｍｏｌ/ＬＬｉＢｒ溶液中ꎮ３)过滤离心:冷却至室温ꎬ使用不锈钢过滤网过滤去除较大颗粒杂质ꎬ以９０００ｒ/ｍｉｎ速度离心１０ｍｉｎꎮ４)透析:将离心后的丝素蛋白溶液转移至截留相对分子质量１２０００ʃ２０００的透析袋中ꎬ超纯水持续透析３ｄꎬ直至透析袋内水位不再变化ꎮ５)浓缩:将含丝素蛋白溶液的透析袋放入质量分数１０％的聚乙二醇溶液中进行浓缩１２ｈꎬ保存于４ħ冰箱中备用ꎮ１.３㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的制备将质量分数为３％的ＳＦ溶液㊁ＣＳ溶液㊁Ｇｅｌ溶液分别以１︰１︰１体积比混合均匀ꎬ调整Ｈａｐ的量ꎬ根据Ｈａｐ在混合溶液质量分数的不同ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ复合溶液分为５组(Ｈａｐ￣１％㊁Ｈａｐ￣２％㊁Ｈａｐ￣３％㊁Ｈａｐ￣４％㊁Ｈａｐ￣５％)ꎬ磁力搅拌６０ｍｉｎ混合均匀ꎬ然后以每孔１ｍＬ转移至４８孔板内ꎮ在－２０ħ预冻过夜ꎬ放入－８０ħ冰箱中继续冷冻２４ｈꎬ然后真空冷冻干燥４８ｈꎬ经第一次塑形得到规则㊁圆柱状的冷冻干燥支架ꎮ冷冻干燥后每孔中加入２ｍＬ交联剂ꎬ交联剂各成分分别为碳化二亚胺盐５０ｍｍｏｌ/Ｌ和Ｎ￣羟基琥珀酰亚胺２５ｍｍｏｌ/Ｌꎮ在４ħ条件下充分交联过夜ꎬ然后用７５％乙醇和去离子水清洗数次ꎬ加入７５％乙醇溶液浸泡２４ｈꎬ１ｍｏｌ/ＬＮａＯＨ溶液浸泡中和６ｈꎬ去离子水洗净ꎮ再次放于－２０ħ冷冻过夜ꎬ－８０ħ冷冻２４ｈ后行真空干燥４８ｈꎬ进行第二次塑形ꎮ干燥完成后ꎬ将支架收集密封ꎬ置于４ħ冰箱ꎬ保存备用ꎮ１.４㊀物理性能表征１.４.１㊀大体外观将不同类型的３Ｄ支架从４８孔板中取出进行拍照观察ꎮ１.４.２㊀扫描电镜观察使用手术刀片将每个支架样品切成合适厚度ꎬ常规涂覆金膜后ꎬ通过Ｒｅｇｕｌｕｓ８１００扫描电子显微镜(日本日立公司)对支架的内部结构和形貌进行分析ꎻ采用ＩｍａｇｅＪ图像可视化软件对样品进行孔径分析ꎬ平均孔径是通过测量在样品中心部分至少随机选择的２０个孔的最大和最小直径来获得ꎮ１.４.３㊀Ｘ射线衍射(ＸＲＤ)分析将支架研磨成粉末ꎬ使用Ｄ８ａｄｖａｎｃｅ全自动Ｘ射线衍射仪(美国布鲁克海文仪器公司)对粉末样品进行表征ꎬＸ射线衍射仪在３５ｋＶ和１０ｍＡ的条件下用Ｃｕｋα辐射(λ＝１.５４２)记录样品的衍射图ꎬ扫描２θ角范围为５ʎ~６０ʎꎬ扫描速率为５ʎ/ｍｉｎꎮ１.４.４㊀溶胀率用常规重量法测定各组支架的吸水溶胀率ꎮ将冷冻干燥后的支架后称重记为Ｍ１ꎬ然后浸泡于ＰＢＳ缓冲液(ｐＨ７.４)中２４ｈ后ꎬ取出样品ꎬ用纱布吸去支架表面多余的水分ꎬ称重记为Ｍ２ꎮ每组实验进行３次ꎮ吸水溶胀率Ｓ计算如下式所示:Ｓ/％＝Ｍ２－Ｍ１Ｍ１ˑ１００(１)１.４.５㊀孔隙率采用比重瓶法测定各组复合支架的孔隙率ꎮ用手术刀片将各支架切成统一大小的样品ꎬ以无水乙醇为液体介质ꎬ称量充满无水乙醇的比重瓶ꎬ质量记为Ｍ１ꎬ将干重Ｍ０的支架浸入无水乙醇中ꎬ真空脱泡３０ｍｉｎꎬ直至支架完全被无水乙醇所饱和ꎬ加入乙醇直至比重瓶充满相同刻度ꎬ再次称重ꎬ记为Ｍ２ꎮ取出充盈乙醇的样品ꎬ称量剩余的液体与比重瓶质量ꎬ记为Ｍ３ꎮ支架孔隙率ε计算如下式所示:ε/％＝Ｍ２－Ｍ３－Ｍ０Ｍ１－Ｍ３ˑ１００(２)１.４.６㊀生物降解率支架的体外酶降解实验根据支架在含酶的磷酸盐缓冲液中孵育后的残留量百分比来评价支架的降解行为ꎮ真空干燥后的支架质量记录为Ｍ１ꎬ然后用含１０ｍｇ/ｍＬ溶菌酶的ＰＢＳ缓冲液(ｐＨ７.４)３７ħ浸泡４周ꎮ在规定的时间间隔(７㊁１４㊁２１㊁２８ｄ)取出样品ꎬ真空干燥２４ｈꎬ称重记为Ｍｔꎮ生物降解率δ计算如下式所示:δ/％＝Ｍ１－ＭｔＭ１ˑ１００(３)１.４.７㊀机械性能使用ＥＴＭ系列通用万能试验机(深圳万测试验设备有限公司)进行压缩机械测试ꎮ在每次测试之前测量样品大小ꎬ支架样品为直径约１０ｍｍ㊁高１５~１８ｍｍ的圆柱体ꎬ水平头速度设定为２ｍｍ/ｍｉｎꎬ当压缩位移达到１０ｍｍ时停止加压ꎮ然后绘制应力应变曲线以评估支架的机械性ꎬ应力应变曲２第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估线初始线性阶段的斜率为弹性模量ꎬ每组３个平行样ꎮ１.５㊀生物性能表征１.５.１㊀软骨细胞的提取和鉴定本研究经大连大学附属中山医院伦理委员会批准(伦理审查批件２０２１０７３１)ꎬ并获得所有研究对象的知情同意ꎮ纳入２０２１年１１月因骨关节炎行全膝关节置换术的患者１例(年龄５２岁ꎬ职业木工)ꎮ收集膝关节置换术中切除的股骨髁软骨ꎬ无菌条件下转移至在超净工作台ꎬ使用含无菌ＰＢＳ缓冲液连续漂洗２~３次ꎬ分离出光滑透亮的透明软骨组织薄片ꎬ切成２ｍｍ大小的组织块ꎬ之后使用５倍体积的０.２％Ⅱ型胶原酶消化过夜(３７ħ和５％ＣＯ２恒温培养箱)ꎮ消化结束后使用１００μｍ细胞滤器过滤ꎬ然后终止消化ꎬ将获得的细胞悬液在室温下以１５００ｒ/ｍｉｎ的速度离心５ｍｉｎꎬ收集细胞沉淀ꎬ重悬后接种到Ｔ２５ｃｍ２培养瓶ꎬ在３７ħ和５％ＣＯ２的细胞孵箱中培养ꎬ２４ｈ后更换一次培养液以去除未贴壁的细胞ꎮ此后每３ｄ换液一次ꎬ建立原代培养ꎬ当贴壁细胞达到９０％汇合时ꎬ用无菌ＰＢＳ缓冲液洗涤后使用胰蛋白酶(含ＥＤＴＡ)进行消化处理并将细胞以１︰２的传代比例重新接种以进行传代培养ꎬ直到细胞达到第２代ꎬ使用甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行鉴定ꎮ１.５.２㊀支架接种前的处理将支架样品切成直径１０ｍｍ㊁厚度１~２ｍｍ的薄片ꎬ在紫外光下用７５％酒精消毒过夜ꎬ然后用无菌ＰＢＳ缓冲液彻底冲洗３次ꎮ在细胞培养之前ꎬ通过在３７ħ的培养箱中浸入ＤＭＥＭ中２ｈ将支架预润湿ꎮ１.５.３㊀黏附率取传代培养至第２代的软骨细胞悬液ꎬ将含有１０５个/ｍＬ细胞(Ａ０)的细胞悬液１００μＬ接种在预先润湿的支架上ꎬ然后添加培养基至３００μＬꎬ并在接种２㊁４㊁６ｈ后测量黏附率ꎮ从孔中取出支架ꎬ用细胞计数板(Ａ１)计数细胞数ꎬ去除所有培养基溶液后ꎬ消化并计算黏附在孔壁上的细胞(Ａ２)ꎮ细胞黏附率θ计算如下式所示:θ/％＝Ａ０－Ａ１－Ａ２Ａ０ˑ１００(４)每组进行３次实验ꎬ得到平均黏附率ꎮ１.５.４㊀增殖率使用ＣＣＫ￣８法检测支架上软骨细胞的增殖ꎬ将软骨细胞接种在支架上(每个支架１０４个细胞)ꎬ４８孔板每孔添加培养基至３００μＬꎮ每３天更换一次培养基ꎬ经过１㊁４㊁７㊁１０ｄ培养后ꎬ３０μＬＣＣＫ￣８的反应溶液加入到每个孔中ꎬ并在３７ħ温育４ｈꎮ然后将１００μＬ含有ＣＣＫ￣８反应液的培养基转移到９６孔细胞培养板中ꎬ使用Ｂｉｏｔｅｋ８００ＴＳ酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)在４５０ｎｍ处读取吸光度ꎬ绘制生长曲线ꎬ所有实验一式三份进行ꎮ１.５.５㊀活死细胞染色细胞接种３ｄ后使用Ｌｉｖｅ/Ｄｅａｄ试剂盒进行染色ꎬ观察细胞在支架样品上的分布ꎮ该试剂盒分别用碘化丙啶和ＣａｌｃｅｉｎＡＭ对死细胞㊁活细胞进行染色ꎬ并在细胞培养箱中孵育３０ｍｉｎ后ꎬ使用ＴＸＭ￣５００Ｃ荧光显微镜(上海天省光学仪器有限公司)观察ꎮ１.６㊀统计分析多组样本间的比较使用ＳＰＳＳ２０.０软件进行ＡＮＯＶＡ单因素方差分析ꎬ然后进行Ｔｕｋｅｙｓ检验ꎬ以确定组间测量数据的差异ꎮ独立样本数据的比较使用ｔ检验ꎬ重复测量数据使用球形检验ꎬ认为ｐ<０.０５具有统计学意义ꎮ置信度记号标为:∗表示ｐ<０.０５ꎬ∗∗表示ｐ<０.０１ꎬ∗∗∗表示ｐ<０.００１)ꎮ２㊀结果和分析２.１㊀物理性能２.１.１㊀大体外观５组ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架均为直径１０ｍｍ左右的白色圆柱体ꎬ随着支架内Ｈａｐ质量分数的增加ꎬ支架底部可见少量沉积的羟基磷灰石ꎬ质量分数越高沉积越多ꎬ如图１所示ꎮ图１㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架大体外观Ｆｉｇ.１㊀ＧｅｎｅｒａｌａｐｐｅａｒａｎｃｅｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.２㊀扫描电镜观察各组支架扫描电镜图像如图２所示ꎮ由图２可见ꎬＨａｐ￣１％支架㊁Ｈａｐ￣２％支架㊁Ｈａｐ￣３％支架㊁Ｈａｐ￣４％支架具有多孔结构ꎬＨａｐ￣１％支架的平均孔径最大ꎬ为(２２５.１４ʃ５３.６３)μｍꎻＨａｐ￣２％支架㊁Ｈａｐ￣３％支架㊁Ｈａｐ￣４％支架的孔径分别为(２１２８９ʃ６２.２２)μｍ㊁(１７１.３０ʃ３１.８７)μｍ㊁(１６９.７３ʃ２６１９)μｍꎻＨａｐ￣５％支架的平均孔径最小ꎬ为(１３６.１１ʃ２０４６)μｍꎮ当支架内Ｈａｐ的质量分数在１％~４％变化时ꎬ支架能保持高度多孔的网络结构和良好的孔间联通性ꎬ随着Ｈａｐ在支架中质量分数的增加ꎬ多孔材料的孔径有所减小ꎬ支架的联通性下降ꎻ当Ｈａｐ的质量分数达到５％及以上时ꎬ可以明显看到过量的羟基磷灰石沉积在多孔支架的孔壁上ꎬ逐渐堵塞支架的孔道ꎮ合适的微观结构和孔径ꎬ能够提供迁移细胞㊁运输营养物质和代谢物㊁信号分子和细胞废物[１１￣１２]ꎮ３Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ图２㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架电镜图像Ｆｉｇ.２㊀ＥｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｇｒａｐｈｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.３㊀ＸＲＤ晶型分析通过ＸＲＤ对ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的晶型结构进行了分析ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的ＸＲＤ图谱如图３所示ꎮ由图３可见ꎬ２θ在２５.７ʎ㊁３２.２ʎ㊁３３.０ʎ㊁３４.３ʎ㊁４０.３ʎ㊁４６.６ʎ和４９.６ʎ附近能观察到羟基磷灰石的特征峰ꎮ对比低质量分数和高质量分数Ｈａｐ的复合支架材料的ＸＲＤ图谱ꎬ还可以观察到羟基磷灰石少量水解和新的磷酸钙化合物生成ꎮ这是因为冰乙酸溶解壳聚糖为溶液提供了酸性环境ꎬ微酸条件下部分羟基磷灰石发生水解ꎬ从而形成新的磷酸钙化合物(２θ＝２８.４ʎ和２９１ʎ)ꎬ有研究指出磷酸钙化合物的存在不会干扰支架的生物活性或生物相容性[１０ꎬ１３]ꎮ图３㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架ＸＲＤ图谱Ｆｉｇ.３㊀ＸＲＤａｔｌａｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.４㊀元素分析电镜扫描和ＸＲＤ晶型分析证实ꎬ在多孔复合材料表面沉积层中存在结晶簇聚集体ꎬ如图２(ｆ)所示ꎮ为了确保添加的Ｈａｐ颗粒确实存在于复合材料中ꎬ本研究对ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架进行了元素分析ꎮＸ射线能谱分析仪(ＥｎｅｒｇｙＤｉｓｐｅｒｓｉｖｅＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＸ￣ｒａｙｓꎬＥＤＡＸ)元素检测的结果表明ꎬ结晶簇的主要元素是Ｃａ和Ｐꎬ如图４所示ꎮ检测到的结晶簇聚集体内的Ｃａ/Ｐ比值约为１.７４ꎬ其值与化学计量羟基磷灰石中的Ｃａ/Ｐ比值１.６７接近[１４￣１５]ꎬ据文献报道稳定的Ｈａｐ相对应的Ｃａ/Ｐ比值在１.３~１.８[１６]ꎬ表明Ｈａｐ在支架基质内能够稳定存在ꎮ图４㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架元素分析Ｆｉｇ.４㊀ＥｌｅｍｅｎｔａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ４第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估２.１.５㊀吸水溶胀率支架的保水性能对组织工程有重要意义ꎬ吸水溶胀率影响细胞的迁移㊁增殖和分化ꎬ也影响营养物质的运输和机械性能[１７]ꎮＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的吸水溶胀率如图５所示ꎬ５组支架吸水溶胀率之间的差异有统计学意义(ｐ<０.０５)ꎮＨａｐ￣１％支架和Ｈａｐ￣２％支架的吸水溶胀率最高ꎬ分别为１４６６％ʃ１７９％和１２８６％ʃ１１４％ꎻＨａｐ￣５％支架的吸水膨胀率最低ꎬ为７７１％ʃ８９％ꎮ随着ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ复合支架内羟基磷灰石质量分数的增加ꎬ支架的吸水溶胀率明显降低ꎬ即使是Ｈａｐ￣５％支架的平均溶胀率依然大于７００％ꎮ图５㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架溶胀率比较Ｆｉｇ.５㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｓｗｅｌｌｉｎｇｒａｔｅｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.６㊀孔隙率多孔复合支架的营养运输能力除了受材料本身亲水性能的影响外ꎬ还与支架的孔隙率㊁孔径大小及孔道联通性密切相关[１７￣１８]ꎮ因此孔隙率也是组织工程支架的重要特征之一ꎮＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ复合支架的孔隙率如图６所示ꎬ５组支架孔隙率之间的差异有统计学意义(ｐ<０.０５)ꎮＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐ支架的孔隙率最高ꎬ约为８７.２５％ʃ２.２８％ꎮＨａｐ￣２％的支架和Ｈａｐ￣３％的支架具有相似的孔隙率ꎬ分别为７６.５２％ʃ２.３１％和７２.２７％ʃ２.２８％ꎮＨａｐ￣５％支架的孔隙率最低ꎬ只有４９.４１％ʃ５.９２％ꎬ多孔支架的孔隙率随着支架内部Ｈａｐ质量分数的增加而明显降低ꎮ分析认为ꎬ这是随着复合支架内羟基磷灰石质量分数的增加ꎬ过量的羟磷灰石会沉积在多孔支架的孔壁内ꎬ堵塞孔径ꎬ使多孔支架结构通道的联通性降低ꎬ从而导致支架的孔隙率下降ꎮ孔隙率大于７０％的多孔支架被认为是细胞生存的良好空间和维持细胞生长的营养运输通道[１８]ꎬ高度多孔的结构可以提供足够的营养和气体交换ꎬ以及足够的空间供细胞增殖和附着[１９￣２０]ꎮ掺杂低质量分数Ｈａｐ的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ的多孔支架ꎬ不仅可以提供高度多孔的结构ꎬ为细胞的黏附㊁迁移和生长提供了很大的表面积ꎬ还能兼顾保持Ｈａｐ的生物活性和促成骨作用ꎬ也许更适合骨软骨缺损的修复ꎮ图６㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架孔隙率比较Ｆｉｇ.６㊀ＣｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.１.７㊀生物降解率本研究使用溶菌酶对ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架进行了体外降解实验ꎬ如图７所示ꎬ５组支架生物降解率之间的差异有统计学意义(ｐ<０.０５)ꎮＨａｐ￣１％支架降解率最高４１.８％ʃ２.４７％ꎬＨａｐ￣５％支架的降解率最低２４.８９％ʃ１.１６％ꎬ支架生物降解率随着羟基磷灰石质量分数的增加而降低ꎮ这一结果与软骨下骨层多孔支架孔隙率结果一致ꎬ这可能是因为低质量分数Ｈａｐ的复合支架具有较高的孔隙率ꎬ多孔结构提供了较大的比表面积ꎬ导致溶菌酶更容易渗透进支架内部与壳聚糖㊁明胶等有机材料发生反应ꎻ另一个可能的原因是羟基磷灰石是天然骨骼的矿物质成分ꎬ本身具有优良的结合能力和原位降解缓慢等优势[１４￣１５]ꎬ因此适当添加Ｈａｐ可以改善多孔复合支架降解速度快的缺点ꎬ从而使多孔支架的生物降解速度与组织的再生重建相匹配ꎮ图７㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的生物降解率(ｐ<０.０５)Ｆｉｇ.７㊀ＢｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ(ｐ<０.０５)２.１.８㊀机械性能机械强度也是评估软骨修复生物材料性能的最关键因素之一ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的应力应变曲线如图８所示ꎮ这５Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ次实验通过比较多孔支架的弹性模量(线性应力应变部分的斜率)和２０％形变量的抗压强度评价多孔支架的力学性能ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐ支架的抗压强度最低(１４.４４ｋＰａ)ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣５％Ｈａｐ支架的抗压强度最高(４０.２８ｋＰａ)ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架抗压强度随Ｈａｐ的质量分数增加而增大ꎬ高质量分数的Ｈａｐ的有助于提高支架的抗压强度ꎮ然而ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ支架的弹性模量变化与抗压强度变化并不完全一致ꎬ此次实验结果显示ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐ支架的弹性模量最低ꎬＨａｐ质量分数在２％~５％的多孔支架拥有相似的弹性模量ꎬ并不随Ｈａｐ质量分数的增加而发生明显改变ꎮ支架的机械性能影响细胞的增殖和分化ꎬ在较硬结构上生长的细胞比在较软基质上的细胞增殖更快ꎬ迁移更慢[２０]ꎮ因此用于软骨修复的支架需要足够坚固㊁有弹性和坚韧ꎬ以容纳种子细胞或从宿主组织迁移的细胞ꎬ同时具有足够的容量以抵抗反复的动态冲击而不会倒塌或压碎[２１￣２２]ꎮ图８㊀ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ多孔支架的应力应变曲线Ｆｉｇ.８㊀Ｓｔｒｅｓｓ￣ｓｔｒａｉｎｃｕｒｖｅｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓ２.２㊀生物性能理想组织工程支架需要具备多种能力ꎬ如高度水合的三维结构和高含水量㊁合适的孔径和孔隙率㊁材料交换能力㊁良好的生物降解性和优越的机械性能ꎬ并能提供合适的微环境和高效的生物相容性和高强度[２２]ꎮ综合本研究的物理性能检测结果ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架更符合全层软骨缺损修复的要求ꎮ该支架具有(２１２.８９ʃ６２.２２)μｍ大小的孔径结构㊁７６.５２％ʃ２.３１％的孔隙率㊁良好的吸水溶胀率１２８６％ʃ１１４％及３７.０９％ʃ１.４１％生物降解速率与良好的机械性能ꎮ因此将ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架与骨关节炎患者的软骨细胞共培养ꎬ以进一步检测支架材料的生物性能ꎮ２.２.１㊀软骨细胞的培养和鉴定原代软骨细胞形态大多为梭形和多角形ꎬ细胞在贴壁２ｄ后开始较好地附着在细胞培养瓶表面并开始增殖ꎬ并在７~９ｄ后达到９０％的汇合状态ꎮ传代细胞表现出相似的形态ꎬ绝大数细胞表现为多角形ꎬ表面多树突状突起ꎬ随着培养时间增加ꎬ树突状突起伸展为细长触丝ꎬ如图９所示ꎮ使用甲苯胺蓝对提取的原代细胞进行染色ꎬ细胞核被染成紫蓝色ꎬ胞核偏向一侧ꎬ未见肥大样细胞ꎬ符合软骨细胞的特征ꎬ如图９(ｃ)所示ꎮ图９㊀软骨细胞的培养及鉴定Ｆｉｇ.９㊀Ｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ２.２.２㊀黏附率理想的生物支架可以改善细胞黏附㊁细胞分化和与周围天然组织的整合[１０]ꎮ本研究比较了ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架在接种细胞２㊁４㊁６ｈ后的黏附率ꎬ如图１０所示ꎮ由图１０可见ꎬ软骨细胞能与支架良好黏附ꎬ细胞种板后６ｈ内可成功黏附于支架网状纤维上ꎬ表明ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架很好地保持材料优良的生物活性ꎮ图１０㊀细胞黏附率Ｆｉｇ.１０㊀Ｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｒａｔｅ２.２.３㊀增殖率本研究使用ＣＣＫ￣８法检测软骨细胞在ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ支架的增殖表达ꎬ如图１１所示ꎮ由图１１可见ꎬ单纯软骨细胞组增殖曲线呈Ｓ形ꎬ而仿生支架共培养组软骨细胞在连续共培养１０ｄ后ꎬ生长增殖曲线仍然呈明显上升趋势ꎬ保持６第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估有良好的细胞活力ꎬ未观察到明显的接触抑制效应ꎮ这主要是因为软骨细胞在普通培养皿表面贴壁生长ꎬ细胞增殖存在明显的接触抑制效应ꎬ但是三维立体培养可以避免这种效应ꎮ结果表明ꎬ本研究制备的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐ多孔支架具有良好细胞相容性ꎬ能够为种子细胞提供良好的生长微环境ꎬ三维立体培养比二维平面扩展生长具有更大的增殖效率ꎮ图１１㊀细胞增殖率Ｆｉｇ.１１㊀Ｃｅｌｌｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｒａｔｅ２.２.４㊀活死染色为了直观地观察细胞在支架上的状态和活性ꎬ共培养一段时间后使用Ｌｉｖｅ/Ｄｅａｄ试剂盒进行染色ꎬ然后通过荧光显微镜观察(１０ˑ１０倍)ꎬ如图１２所示ꎬ绿色代表活细胞ꎬ而红色代表死细胞ꎮ由图１２可见ꎬＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ支架上的大部分细胞呈现绿色荧光ꎬ少见死细胞ꎬ支架上细胞表现出高存活率和低细胞毒性ꎬ表明本研究所制备的多孔支架具有良好的生物相容性ꎮ图１２㊀活/死细胞染色Ｆｉｇ.１２㊀Ｌｉｖｅ/ｄｅａｄｃｅｌｌｓｔａｉｎｉｎｇ３㊀结㊀论基于明胶㊁壳聚糖㊁丝素蛋白和纳米羟基磷灰石制备的ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐ三维多孔复合支架不仅可以模拟天然骨软骨的ＥＣＭꎬ而且具有良好的生物相容性ꎬ能够为营养物质的转运和细胞附着㊁增殖和立体生长提供良好的网状骨架ꎬ从而为全层软骨缺损的治疗提供新的选择ꎮ«丝绸»官网下载㊀中国知网下载参考文献:[１]ＤＡＯＵＦꎬＣＯＣＨＩＳＡꎬＬＥＩＧＨＥＢＭꎬｅｔａｌ.Ｃｕｒｒｅｎｔａｄｖａｎｃｅｓｉｎｔｈｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｏｆｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅ:Ａｌｉｔｅｒａｔｕｒｅｒｅｖｉｅｗｏｎｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｉｔｓｒｅｃｅｎｔｃｌｉｎｉｃａｌｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ[Ｊ].Ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０２１ꎬ１５(１):３１.[２]ＴＨＵＮＳＩＲＩＫꎬＰＩＴＪＡＭＩＴＳꎬＰＯＴＨＡＣＨＡＲＯＥＮＰꎬｅｔａｌ.Ｔｈｅ３Ｄ￣ｐｒｉｎｔｅｄｂｉｌａｙｅｒｓｂｉｏａｃｔｉｖｅ￣ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓｓｃａｆｆｏｌｄｆｏｒｆｕｌｌ￣ｔｈｉｃｋｎｅｓｓａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓｔｒｅａｔｍｅｎｔ[Ｊ].Ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０２０ꎬ１３(１５):１￣２６.[３]ＴＳＡＮＡＫＴＳＩＤＯＵＥꎬＫＡＭＭＯＮＡＯꎬＫＩＰＡＲＩＳＳＩＤＥＳＣ.Ｒｅｃｅｎｔｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓｉｎｈｙａｌｕｒｏｎｉｃａｃｉｄ￣ｂａｓｅｄｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｐｏｌｙｍｅｒｓꎬ２０２２ꎬ１４(４):８３９.[４]ＲＡＤＵＬＥＳＣＵＤＭꎬＮＥＡＣＳＵＩＡꎬＧＲＵＭＥＺＥＳＣＵＡＭꎬｅｔａｌ.Ｎｅｗｉｎｓｉｇｈｔｓｏｆｓｃａｆｆｏｌｄｓｂａｓｅｄｏｎｈｙｄｒｏｇｅｌｓｉｎｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].Ｐｏｌｙｍｅｒｓꎬ２０２２ꎬ１４(４):７９９.[５]ＳＵＮＷＺꎬＧＲＥＧＯＲＹＤＡꎬＴＯＭＥＨＭＡꎬｅｔａｌ.Ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎａｓａｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｆｏｒｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌＭｏｌｅｃｕｌａｒＳｃｉｅｎｃｅｓꎬ２０２１ꎬ２２(３):１￣２８.[６]ＬＩＹＳꎬＺＨＡＮＧＹＬꎬＷＥＩＹꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｂａｓｅｄｉｎｊｅｃｔａｂｌｅｈｙｄｒｏｇｅｌｓａｎｄｉｔｓａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｉｎ３Ｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＶｉｓｕａｌｉｚｅｄＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓꎬ２０１７(１２７):ｅ５６２５３.[７]ＬＩＪＱꎬＷＡＮＧＱＫꎬＧＵＹＢꎬｅｔａｌ.Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎꎬｃｈｉｔｏｓａｎꎬａｎｄｇｅｌａｔｉｎｆｏｒ３Ｄｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅａｎｄｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ[Ｊ].ＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅＭｏｎｉｔｏｒꎬ２０１７ꎬ２３:５３１１￣５３２０.[８]ＳＨＡＮＧＬＬꎬＭＡＢＪꎬＷＡＮＧＦＬꎬｅｔａｌ.Ｎａｎｏｔｅｘｔｕｒｅｄｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｂｉｏｍｉｍｅｔｉｃｂｉｌａｙｅｒｔｏｕｇｈｓｔｒｕｃｔｕｒｅｒｅｇｕｌａｔｅｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ/ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｏｒｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌｒｅｐａｉｒ[Ｊ].ＣｅｌｌＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎꎬ２０２０ꎬ５３(１１):ｅ１２９１７.[９]ＧＲＡＢＳＫＡ￣ＺＩＥＬＩＳＫＡＳꎬＳＩＯＮＫＯＷＳＫＡＡꎬＣＡＲＶＡＬＨＯÂꎬｅｔａｌ.Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓｗｉｔｈｐｏｔｅｎｔｉａｌｕｓｅｉｎｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ￣ｃｏｌｌａｇｅｎ/ｃｈｉｔｏｓａｎ/ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎｓｃａｆｆｏｌｄｓｃｒｏｓｓ￣ｌｉｎｋｅｄｂｙＥＤＣ/ＮＨＳ[Ｊ].Ｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０２１ꎬ１４(５):１￣２０.[１０]ＹＥＰꎬＹＵＢꎬＤＥＮＧＪꎬｅｔａｌ.Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｃｈｉｔｏｓａｎ/ｎａｎｏ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｉｎｔｈｅｒｅｐａｉｒｏｆｒａｂｂｉｔｒａｄｉａｌｂｏｎｅｄｅｆｅｃｔ[Ｊ].ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｎｄＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１７ꎬ１４(６):５５４７￣５５５３.[１１]ＸＩＡＯＨＬꎬＨＵＡＮＧＷＬꎬＸＩＯＮＧＫꎬｅｔａｌ.Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌｒｅｐａｉｒｕｓｉｎｇｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｉｔｈｇｒａｄｉｅｎｔｐｏｒｅｓｉｚｅｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｗｉｔｈｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎꎬ７Ｖｏｌ.６０㊀Ｎｏ.１１Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓｃｈｉｔｏｓａｎꎬａｎｄｎａｎｏ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌＮａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅꎬ２０１９ꎬ１４:２０１１￣２０２７.[１２]ＡＳＡＤＰＯＵＲＳꎬＫＡＲＧＯＺＡＲＳꎬＭＯＲＡＤＩＬꎬｅｔａｌ.Ｎａｔｕｒａｌｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｂａｓｅｄｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｆｒｏｍｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎꎬｇｅｌａｔｉｎａｎｄｃｈｉｔｏｓａｎｔｏｗａｒｄｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ[Ｊ].ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓꎬ２０２０ꎬ１５４:１２８５￣１２９４. [１３]ＡＢＰＥＩＫＡＲＺꎬＭＯＲＡＤＩＬꎬＪＡＶＤＡＮＩＭꎬｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｃｔｏｎｅ/ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｇｅｌａｔｉｎ/ａｓｃｏｒｂｉｃａｃｉｄｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓａｎｄｉｎｖｉｖｏｒｅｓｕｌｔｓｉｎａｒａｂｂｉｔｍｏｄｅｌｆｏｒｍｅｎｉｓｃｕｓｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｐａｉｒ[Ｊ].Ｃａｒｔｉｌａｇｅꎬ２０２１ꎻ１３(２):１５８３Ｓ￣１６０１Ｓ. [１４]ＱＩＸＮꎬＭＯＵＺＬꎬＺＨＡＮＧＪꎬｅｔａｌ.Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｃｈｉｔｏｓａｎ/ｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎ/ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄａｎｄｉｔｓｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｉｎｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｔｏｂｉ￣ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｃａｆｆｏｌｄｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭａｔｅｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｔＡꎬ２０１４ꎬ１０２(２):３６６￣３７２.[１５]ＲＡＴＮＡＹＡＫＥＪＴＢꎬＭＵＣＡＬＯＭꎬＤＩＡＳＧＪ.Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｓｆｏｒｂｏｎｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ:Ａｒｅｖｉｅｗｏｆｃｕｒｒｅｎｔｔｒｅｎｄｓ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｍｅｄｉｃａｌＭａｔｅｒｉａｌｓＲｅｓｅａｒｃｈＰａｒｔＢ:ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓꎬ２０１７ꎬ１０５(５):１２８５￣１２９９.[１６]ＤＨＩＶＹＡＳꎬＳＡＲＡＶＡＮＡＮＳꎬＳＡＳＴＲＹＴＰꎬｅｔａｌ.Ｎａｎｏｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ￣ｒｅｉｎｆｏｒｃｅｄｃｈｉｔｏｓａｎｃｏｍｐｏｓｉｔｅｈｙｄｒｏｇｅｌｆｏｒｂｏｎｅｔｉｓｓｕｅｒｅｐａｉｒｉｎｖｉｔｒｏａｎｄｉｎｖｉｖｏ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１５ꎬ１３:１￣１３.[１７]ＢＡＯＷＲꎬＬＩＭＬꎬＹＡＮＧＹＹꎬｅｔａｌ.Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔｓａｎｄｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｔｈｅｈｉｇｈｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｏｆｎａｔｕｒａｌｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＣｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ２０２０ꎬ８:１￣１８. [１８]ＰＵＰＰＩＤꎬＣＨＩＥＬＬＩＮＩＦꎬＰＩＲＡＳＡＭꎬｅｔａｌ.Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃｍａｔｅｒｉａｌｓｆｏｒｂｏｎｅａｎｄｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｐａｉｒ[Ｊ].ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＰｏｌｙｍｅｒＳｃｉｅｎｃｅꎬ２０１０ꎬ３５(４):４０３￣４４０.[１９]ＶＯＬＰＩＭꎬＰＡＲＡＤＩＳＯＡꎬＣＯＳＴＡＮＴＩＮＩＭꎬｅｔａｌ.Ｈｙｄｒｏｇｅｌ￣ｂａｓｅｄｆｉｂｅｒｂｉｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｆｏｒｓｋｅｌｅｔａｌｍｕｓｃｌｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＡＣＳＢｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓＳｃｉｅｎｃｅ＆Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２０２２ꎬ８(２):３７９￣４０５.[２０]ＣＯＳＴＡＮＴＩＮＩＭꎬＴＥＳＴＡＳꎬＦＯＲＮＥＴＴＩＥꎬｅｔａｌ.Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｍｕｓｃｌｅｎｅｔｗｏｒｋｓｉｎ３Ｄｇｅｌａｔｉｎｍｅｔｈａｃｒｙｌｏｙｌｈｙｄｒｏｇｅｌｓ:Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｍｅｃｈａｎｉｃａｌｓｔｉｆｆｎｅｓｓａｎｄｇｅｏｍｅｔｒｉｃａｌｃｏｎｆｉｎｅｍｅｎｔ[Ｊ].ＦｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ２０１７ꎬ５:１￣８.[２１]ＨＡＦＥＺＩＭꎬＫＨＯＲＡＳＡＮＩＳＮꎬＺＡＲＥＭꎬｅｔａｌ.Ａｄｖａｎｃｅｄｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ:Ｒｅｃｅｎｔｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｆｕｔｕｒｅｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ[Ｊ].Ｐｏｌｙｍｅｒｓꎬ２０２１ꎬ１３(２３):１￣３５.[２２]ＭＥＬＬＡＴＩＡꎬＦＡＮＣＭꎬＴＡＭＡＹＯＬＡꎬｅｔａｌ.Ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ３Ｄｃｅｌｌ￣ｌａｄｅｎｔｈｅｒｍｏｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｍｉｍｉｃｋｉｎｇｃｅｌｌｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｃａｒｔｉｌａｇｅｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ[Ｊ].ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬ２０１７ꎬ１１４(１):２１７￣２３１. [２３]ＬＩＬꎬＹＵＦꎬＺＨＥＮＧＬＭꎬｅｔａｌ.Ｎａｔｕｒａｌｈｙｄｒｏｇｅｌｓｆｏｒｃａｒｔｉｌａｇｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ:Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎꎬｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＯｒｔｈｏｐａｅｄｉｃＴｒａｎｓｌａｔｉｏｎꎬ２０１８ꎬ１７:２６￣４１.８第６０卷㊀第１１期丝素蛋白明胶壳聚糖羟基磷灰石多孔支架的制备及性能评估Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎ￣ｇｅｌａｔｉｎ￣ｃｈｉｔｏｓａｎ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓＧＵＭｉｎｇｘｉ１ＷＡＮＧＣｈａｎｇｃｈｅｎｇ２ＴＩＡＮＦｅｎｇｄｅ３ＨＡＯＲｕｉｈｕ３ＡＮＮｉｎｇ３ＧＵＯＬｉｎ３１.ＩｎｔｅｒｎａｌＭｅｄｉｃａｌＰｅｋｉｎｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＳｈｅｎｚｈｅｎＨｏｓｐｉｔａｌＳｈｅｎｚｈｅｎ５１８０００Ｃｈｉｎａ２.ＦａｃｕｌｔｙｏｆＭｅｄｉｃｉｎｅＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＤａｌｉａｎ１１６０８１Ｃｈｉｎａ３.ＯｒｔｈｏｐｅｄｉｃＫｎｅｅＪｏｉｎｔａｎｄＢｏｎｅＴｕｍｏｒｓＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＺｈｏｎｇｓｈａｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＤａｌｉａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＤａｌｉａｎ１１６００１ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＴｏｔａｌａｒｔｉｃｕｌａｒｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓａｒｅｕｓｕａｌｌｙａｃｃｏｍｐａｎｉｅｄｂｙｓｕｂｃｈｏｎｄｒａｌｂｏｎｅｄａｍａｇｅａｎｄｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｓａｎｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙｔｅｃｈｎｉｑｕｅｃｏｍｂｉｎｉｎｇｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄｃｅｌｌｂｉｏｌｏｇｙｐｒｏｖｉｄｅｓｎｅｗｉｄｅａｓａｎｄａｐｐｒｏａｃｈｅｓｆｏｒｔｈｅｒｅｐａｉｒｏｆｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓ.ＩｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙｗｅｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｅｗａｐｐｒｏａｃｈｆｏｒｔｈｅｒｅｐａｉｒｏｆｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓｂｙｕｓｉｎｇｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎＳＦｇｅｌａｔｉｎＧｅｌｃｈｉｔｏｓａｎＣＳａｎｄｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅＨａｐａｓｔｈｅｂａｓｅｍａｔｅｒｉａｌｓｔｏｍｅｅｔｔｈｅｎｅｅｄｓｏｆｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘＥＣＭａｎｄｏｓｔｅｏｇｅｎｉｃ￣ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃｂｉｐａｒｔｉｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ.ＦｉｖｅｇｒｏｕｐｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓＨａｐ￣１％Ｈａｐ￣２％Ｈａｐ￣３％Ｈａｐ￣４％ａｎｄＨａｐ￣５％ｗｉｔｈｏｕｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｇｒａｄｉｅｎｔｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｂｙｖａｃｕｕｍｆｒｅｅｚｅ￣ｄｒｙｉｎｇａｎｄｃｈｅｍｉｃａｌｃｒｏｓｓ￣ｌｉｎｋｉｎｇｂｙａｄｄｉｎｇｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｔｅｎｔｓｏｆｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｔｏｔｈｅｃｏ￣ｂｌｅｎｄｅｄｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆｓｉｌｋｐｒｏｔｅｉｎｃｈｉｔｏｓａｎａｎｄｇｅｌａｔｉｎ.Ｔｈｅ３ＤｐｏｒｏｕｓｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｉｔｈｓｕｐｅｒｉｏｒｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｗｅｒｅｓｃｒｅｅｎｅｄｂｙｓｃａｎｎｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｎｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙＸ￣ｒａｙｄｉｆｆｒａｃｔｏｍｅｔｒｙＸＲＤａｎｄｔｈｅｓｔｕｄｙｏｆｐｏｒｏｓｉｔｙｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｓｗｅｌｌｉｎｇｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ.Ｔｈｅｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｅｒｅｔｈｅｎｃｏ￣ｃｕｌｔｕｒｅｄｗｉｔｈｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ.Ｔｈｅｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆｔｈｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｓｗｅｒｅｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｒａｔｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｃｅｌｌｌｉｖｅ￣ｄｅａｄｓｔａｉｎｉｎｇａｎｄＣＣＫ￣８ｃｅｌｌａｃｔｉｖｉｔｙｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｓｓａｙｔｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｉｒｕｓｅｆｏｒｒｅｐａｉｒｉｎｇｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓ.ＡｌｌｆｉｖｅｇｒｏｕｐｓｏｆｓｃａｆｆｏｌｄｓｈａｄｐｏｒｏｕｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓａｎｄｔｈｅｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎｓｗｅｌｌｉｎｇａｎｄｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣ｎＨａｐｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｄｅｃｒｅａｓｅｄｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇＨａｐｃｏｎｔｅｎｔｉｎｔｈｅｓｃａｆｆｏｌｄｗｈｉｌｅｔｈｅｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｇｒａｄｕａｌｌｙｓｌｏｗｅｄｄｏｗｎｗｉｔｈｉｎｃｒｅａｓｉｎｇＨａｐｃｏｎｔｅｎｔ.ＴｈｅＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣１％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｈａｄｔｈｅｈｉｇｈｅｓｔｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｓｗｅｌｌｉｎｇｒａｔｅａｎｄｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆ１４６６％ʃ１７９％ａｎｄ８７.２５％ʃ２.２８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙｂｕｔｉｔｈａｄｔｈｅｆａｓｔｅｓｔａｎｄｌｅａｓｔｓｔａｂｌｅｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎａｎｄｐｏｏｒｍｅｃｈａｎｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ.ＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｈａｄａｐｏｒｅｓｉｚｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆ２１２.８９ʃ６２.２２μｍａｐｏｒｏｓｉｔｙｏｆ７６.５２％ʃ２.３１％ｇｏｏｄｗａｔｅｒａｂｓｏｒｐｔｉｏｎａｎｄｓｗｅｌｌｉｎｇｒａｔｅｏｆ１２８６％ʃ１１４％ａｎｄａｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｒａｔｅｏｆ３７.０９％ʃ１４１％.ＴｈｅｐｈｙｓｉｃｏｃｈｅｍｉｃａｌｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏｆＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｗｅｒｅｍｏｒｅｉｎｌｉｎｅｗｉｔｈｔｈｅｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓｏｆｆｕｌｌ￣ｌａｙｅｒｅｄｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｒｅｐａｉｒ.Ｄｕｒｉｎｇｉｔｓｃｏ￣ｃｕｌｔｕｒｅｗｉｔｈｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓｉｓｏｌａｔｅｄａｎｄｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓｐａｔｉｅｎｔｓｔｈｅＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｓｃａｆｆｏｌｄｓｈｏｗｅｄｂｅｔｔｅｒｂｉｏａｃｔｉｖｉｔｙｉ.ｅ.ｇｏｏｄｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓａｎｄｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆＣＣＫ￣８ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｓｓａｙａｎｄｌｉｖｅ/ｄｅａｄｃｅｌｌｄｏｕｂｌｅ￣ｓｔａｉｎｉｎｇａｓｓａｙｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｐｏｒｏｕｓｓｃａｆｆｏｌｄｈａｄｇｏｏｄｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｌｏｗｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ.ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅＳＦ￣ＣＳ￣Ｇｅｌ￣２％Ｈａｐｐｏｒｏｕｓｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓｃａｆｆｏｌｄｐｒｅｐａｒｅｄｂａｓｅｄｏｎｇｅｌａｔｉｎｃｈｉｔｏｓａｎｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎａｎｄｎａｎｏ￣ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅｃａｎｎｏｔｏｎｌｙｍｉｍｉｃｔｈｅＥＣＭｏｆｎａｔｕｒａｌｂｏｎｅｃａｒｔｉｌａｇｅｂｕｔａｌｓｏｈａｓｇｏｏｄｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙａｎｄｃａｎｐｒｏｖｉｄｅａｇｏｏｄｒｅｔｉｃｕｌａｒｓｋｅｌｅｔｏｎｆｏｒｎｕｔｒｉｅｎｔｔｒａｎｓｐｏｒｔａｎｄｃｅｌｌａｄｈｅｓｉｏｎｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄｓｔｅｒｅｏｇｅｎｅｓｉｓｐｒｏｖｉｄｉｎｇａｎｅｗｏｐｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓ.Ｋｅｙｗｏｒｄｓｔｉｓｓｕｅｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｓｃａｆｆｏｌｄｔｏｔａｌｃａｒｔｉｌａｇｅｄｅｆｅｃｔｓｉｌｋｆｉｂｒｏｉｎｃｈｉｔｏｓａｎｇｅｌａｔｉｎｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ９。

纳米羟基磷灰石_聚己内酯_壳聚糖复合多孔支架材料的制备与表征

第24卷第10期高分子材料科学与工程Vol.24,No.10　2008年10月POL YM ER MA TERIAL S SCIENCE AND EN GIN EERIN GOct.2008纳米羟基磷灰石/聚己内酯2壳聚糖复合多孔支架材料的制备与表征林宗琼,肖秀峰,佘厚德,黄励中,刘榕芳(福建师范大学化学与材料学院,福建福州350007)摘要:结合纳米羟基磷灰石(n 2HA )和聚合物的优点,采用溶液共混相分离制备出聚己内酯(PCL )2壳聚糖(CS )多孔支架材料,并采用离心注浆填充新方法对支架材料进行增强,制备复合多孔支架材料。

用扫描电子显微镜、红外光谱、元素分析、孔隙率和抗压强度对材料进行了表征。

结果表明复合材料具有良好的界面结合;孔隙率分析表明材料具有60%～80%的孔隙率,符合骨组织工程对支架材料的要求;力学性能测试表明材料的压缩强度得到大幅度提高。

关键词:羟基磷灰石;聚己内酯;壳聚糖;聚乙烯醇;多孔支架中图分类号:TB384 文献标识码:A 文章编号:100027555(2008)1020155204收稿日期:2007207204;修订日期:2007207223基金项目:福建省科技厅重点资助项目(2006I0015),福建师范大学本科生课外科技计划资助项目(B K L2006223)联系人:刘榕芳,主要从事生物材料研究,E 2mail :rfliu @ 骨组织工程是一种新的治疗骨缺损的方法[1],要求所用的支架材料不仅具有良好的生物相容性、生物活性,还要具有三维立体结构,即材料必须是多孔的。

作为支架材料的成分主要有羟基磷灰石(HA )[2]、聚己内酯(PCL )[3]、壳聚糖(CS )[4]等。

支架材料多孔的制备方法有:纤维粘接、溶液浇铸/粒子沥滤、气体发泡法、三维“印刷”法、相分离/冻干法等。

如张利[5]等采用溶液浇铸/粒子沥滤法制备n 2HA/CS 多孔支架材料,此法适用于薄膜,不能形成三维结构。

功能性纳米羟基磷灰石的制备、表征及性能研究

功能性纳米羟基磷灰石的制备、表征及性能研究一、本文概述纳米羟基磷灰石（Nano-Hydroxyapatite, n-HA）作为一种具有独特生物活性的无机材料，近年来在生物医学领域引起了广泛关注。

由于其与天然骨组织的无机成分相似，n-HA在骨缺损修复、牙科植入物和药物载体等方面具有潜在的应用价值。

本文旨在探讨功能性纳米羟基磷灰石的制备方法、表征手段以及性能研究，以期为其在生物医学领域的应用提供理论支持和实验依据。

在制备方法方面，本文将介绍几种常用的合成n-HA的方法，包括化学沉淀法、水热法、溶胶-凝胶法等，并分析各种方法的优缺点，为后续的实验研究提供参考。

在表征手段方面，本文将采用射线衍射（RD）、透射电子显微镜（TEM）、扫描电子显微镜（SEM）等手段对制备的n-HA进行形貌、结构和成分的分析，以确保其质量和纯度。

在性能研究方面，本文将重点研究n-HA的生物相容性、骨传导性、药物载体性能等，并通过体外和体内实验验证其在实际应用中的效果。

本文还将探讨如何通过调控n-HA的组成、结构和形貌等因素，进一步优化其性能，以满足不同生物医学领域的需求。

本文将围绕功能性纳米羟基磷灰石的制备、表征及性能研究展开系统的探讨，旨在为n-HA在生物医学领域的应用提供全面的理论支撑和实践指导。

二、文献综述纳米羟基磷灰石（nano-Hydroxyapatite，n-HA）是一种重要的生物活性材料，因其与天然骨组织中的无机成分相似，具有良好的生物相容性和骨传导性，在生物医学领域受到广泛关注。

近年来，随着纳米技术的快速发展，功能性纳米羟基磷灰石的制备、表征及性能研究已成为研究热点。

在制备方面，研究者们通过控制反应条件、引入添加剂或采用特殊设备等方法，成功制备出具有不同形貌、尺寸和性能的功能性纳米羟基磷灰石。

例如，采用水热法、溶胶-凝胶法、微乳液法等，可以制备出具有特定形貌（如纳米棒、纳米线、纳米球等）和尺寸的纳米羟基磷灰石。

纳米羟基磷灰石的制备和表征及其对重金属离子吸附行为的研究的开题报告

纳米羟基磷灰石的制备和表征及其对重金属离子吸附行为的研究的开题报告一、研究背景及意义重金属污染已成为当前环境问题的一个重要方面，其对生态和人类健康带来了巨大的风险。

因此，如何高效地去除重金属污染已成为一个热门研究领域。

其中，纳米材料由于其比表面积大、反应活性高等特点，成为从水体中吸附重金属的重要方法。

纳米羟基磷灰石是一种新兴的无机纳米材料，具有较好的生物相容性、可降解性和可溶性，因此在领域中具有广泛的应用前景。

同时，其在吸附某些重金属离子方面的性能也备受关注。

二、研究内容和目标本研究旨在制备纳米羟基磷灰石，并对其进行表征，研究其对重金属离子吸附行为，并探究吸附过程中可能涉及的化学机理。

具体的研究内容如下：1. 制备纳米羟基磷灰石：采用水热法合成纳米羟基磷灰石；2. 表征纳米羟基磷灰石：利用扫描电镜、透射电镜、X射线衍射、傅里叶变换红外光谱等多种手段对制备的纳米羟基磷灰石进行表征；3. 研究其对重金属离子吸附行为：以铜离子和镉离子为例，研究纳米羟基磷灰石对其吸附效果，并考察不同因素对吸附性能的影响；4. 探究吸附过程中可能涉及的化学机理：利用X射线光电子能谱、比表面积等手段，研究纳米羟基磷灰石与重金属离子之间的相互作用机制。

三、研究方法和重点1. 水热法制备纳米羟基磷灰石：在水热条件下控制反应体系，以离子的共同聚集为基础，形成结晶核并沉积出纳米颗粒。

2. 表征纳米羟基磷灰石：利用扫描电镜、透射电镜、X射线衍射、傅里叶变换红外光谱等多种手段对制备的纳米羟基磷灰石进行表征。

3. 研究其对重金属离子吸附行为：量化分析不同条件下纳米羟基磷灰石对铜离子和镉离子等的吸附能力及吸附机制。

4. 探究吸附过程中可能涉及的化学机理：利用X射线光电子能谱、比表面积等手段，研究纳米羟基磷灰石与重金属离子之间的相互作用机制。

重点研究内容为：制备纳米羟基磷灰石，研究其对重金属离子吸附行为，探究吸附过程中可能涉及的化学机理。

四、预期成果和意义本研究的预期成果包括：1. 成功制备出纳米羟基磷灰石，并进行表征，确定其粒径和形貌等基本性能。

纳米羟基磷灰石／聚酰胺多孔支架材料的制备及其结晶行为研究

（．１四川大学分析测试中心，米生物材料研究中心，纳四川成都６０６；１０４２四川大学化学学院，．四川成都６ｏ６）１ｏ４
摘要：以Ｎａ１Ｃ为致孔剂，用粒子沥滤一转移法采相
制备了纳米羟基磷灰石／酰胺６ｎＨＡ／Ｐ）聚（－Ａ６多孔支架材料，扫描电子显微镜（Ｅ用ＳＭ）Ｘ射线衍射，
１引言
组织工程是生物医学工程领域中一个快速发展的
架，其制备过程如下：１ＨＡ／Ａ６复合材料的乙醇将＂１一Ｐ浆料加人一定量的Ｎａ１Ｃ加热搅拌，然后将混合物转人
一
新方向。体外构建大面积缺损修复用工程组织或器官，需要应用外源的三维支架［。用于组织工程的支１］
（ＲＤ，ｘ）示兰扫描量热仪（Ｓ）对其进行表征。结ＤＣ等果表明，该方法制备的多孔支架孔径分布在５～用０
３０ｍ，隙率约为７，与孔之间的贯通性良好。０￣孔７孔用粒子沥滤一相转移法制备的支架中ＰＡ６的晶胞体积
使ＰＡ６更容易结晶，结晶总速率在制备支架前后均但
没有太大改变。
关键词：纳米羟基磷灰石；酰胺６多孔支架；子聚；粒
沥；相转移；滤晶型转变
中图分类号：Ｔ３Ｂ９文献标识码：Ａ文章编号：０１９３（０７０ —０７０１０－７１２０）１０４ — ３

纳米羟基磷灰石_聚合物多孔复合支架材料

*
eng ineer ing, combining the advantag es o f natura l and synthetic po ly mers, t he polycapro lactone ( PCL )
( CS) po ro us scaffold materia ls w ere pr epar ed by the solution blend and the phase separ atio n metho d, and the scaffo ld materials w ere enhanced by infilling with n H A po ly viny l alco ho l ( n H A P V A ) composite slur ry to pr epar e n H A PV A / P CL CS composite por ous scaffold t hr ough a nov el method centr ifugal slipcast ing technique. T he scaffold materials wer e character ized by scanning electro n micr oscope, Four ier tr ansfor m infrar ed spectro sco pe, elementa l analy sis, poro sity and co mpressive st rength. T he results show t hat PCL CS scaffold materials have the mutual t ransfixion po ro sity str ucture like a honeycomb. T he por osity of the materials can att ain 60% ~ 80% . W ith incr easing the content o f CS, the po rosity increases and the co mpressive strength decr eases. After filling wit h H A PV A composite slur ry , the poro sity of n HA P V A/ PCL CS co mpo site scaffold mater ials decreases, but st ill g reater than 60% , and its compression modulus can increase to 25. 71 M P a. Keywords: scaffo ld materials; hy dr ox yapatite; po ly capr olacto ne; chitosan; polyv iny l alcohol

牡蛎壳纳米羟基磷灰石的制备与表征

牡蛎壳纳米羟基磷灰石的制备与表征牡蛎壳纳米羟基磷灰石的制备与表征1. 引言牡蛎壳纳米羟基磷灰石是一种具有很高应用潜力的新型材料。

它的制备与表征对于研究者们进一步研究和应用该材料具有重要的意义。

本文将对牡蛎壳纳米羟基磷灰石的制备方法和表征技术进行综述，以帮助读者全面、深刻地理解这一领域的最新进展。

2. 制备方法2.1 牡蛎壳的提取与破碎牡蛎壳可以从养殖场或市场上获得，经过清洗和处理后，将牡蛎壳破碎成小颗粒。

这可以通过机械破碎、高能球磨等方法实现。

2.2 羟基磷灰石的制备牡蛎壳中富含磷酸钙和碳酸钙等成分，这些成分可以通过适当的酸碱处理来转化成羟基磷灰石。

常用的方法有酸法、碱法和水热法等。

其中，酸法是最常用的方法之一。

通过在酸性溶液中对破碎的牡蛎壳进行反应，可以得到纳米羟基磷灰石。

2.3 纳米化处理得到的羟基磷灰石颗粒可能偏大，无法满足一些应用需求。

纳米化处理是必要的。

常用的方法有热处理、超声处理和溶剂热法等。

这些方法可以有效地将羟基磷灰石颗粒尺寸控制在纳米级别。

3. 表征技术3.1 X射线衍射分析X射线衍射分析是一种常用的表征手段，可以用来确定材料的晶体结构和晶格参数。

对于牡蛎壳纳米羟基磷灰石的表征，可以利用X 射线衍射技术来分析其晶体结构和纳米尺寸。

3.2 扫描电子显微镜（SEM）扫描电子显微镜可以观察材料的表面形貌和微观结构。

对于牡蛎壳纳米羟基磷灰石的表征，可以利用SEM来观察其颗粒大小和形状，并确定其纳米尺寸。

3.3 红外光谱分析（FTIR）红外光谱分析可以探测材料中的化学键信息。

对于牡蛎壳纳米羟基磷灰石，通过FTIR可以确定其化学组成和结构。

4. 个人观点和理解在制备牡蛎壳纳米羟基磷灰石的过程中，我认为关键的步骤是牡蛎壳的破碎和纳米化处理。

破碎过程需要选择合适的方式，以获得颗粒尺寸适当的原料。

而纳米化处理则能够控制材料的颗粒尺寸，从而实现对其特性和性能的调控。

在表征技术方面，X射线衍射、扫描电子显微镜和红外光谱分析是非常常用和有效的手段。