毛细管电泳法

毛细管电泳法类型 —— 非胶毛细管电泳
指介质中以有机溶剂占主要部分，即表现为非水体
系的性质。能承受更高的操作电压产生的高电场， 有更高的分享效率，也可在不增大焦耳热的条件下
提高溶液中的离子浓度或增大毛细管的内径，从而
增大进样量。 优点：使用超大内径毛细管柱、快速分析、降低吸 附、提高分离选择性、有利于难溶于水及在水中不 稳定的化合物的分离、对中性物质的分离、对手性
.改变电渗最方便有用的方法 .可能会引起溶质组分电荷和结构的改变 .离子强度增加，电流和焦耳热增加 .低离子强度可能存在样品的吸附问题 .导电性与样品不同可能引起峰形畸变 .离子强度低，样品装载量小
缓冲溶 pH降低，电渗降低 液pH值 pH降低，电渗增加 离子强 度或缓 冲溶液 浓度 温度 有机改 性剂 离子强度增加， Zeta电位降低， 电渗降低
V=Vep+Veo=(μep + μeo ) ·E
毛细管电泳法仪器构造
毛细管电泳法仪器构造

毛细管柱是CE的核心部件，目前多为25~75μm之间， 材料为聚四氟乙烯、玻璃和弹性石英，以石英居多。 选择细内径毛细管柱有利于最大散热，但比表面积大， 会增加溶质的吸附作用。
高压电源：包括电源、电极和电极槽
温度改变1℃，黏度 .温度由仪器自动控制，常用方法 变化约2%--3% 改变Zeta电位和黏 度（降低电渗） .变化复杂，其影响宜通过实验测定 .可能改变选择性
毛细管电泳法基本原理
粒子在毛细管内电解质中的迁移速度等于电泳和电渗流（EOF） 两种速度的矢量和。正离子的运动方向和电渗流一致，故最先 流出；中性粒子的电泳流速度为“零”，故其迁移速度相当于 电渗流速度；负离子的运动方向和电渗流方向相反，但因电渗 流速度一般都大于电泳流速度，故它将在中性粒子之后流出， 从而因各种粒子迁移速度不同而实现分离。
定义：溶质在毛细管内的背景电解质溶液中以不同 速度迁移而形成一个个独立的溶质带的电泳 模式
特点：简单，是CE中应用最广泛的一种操作模式。
缺点：不能分离中性物质，因中性物质的淌度差为零。 性质：基于样品中各个组分间质荷比的差异 定性依据：不同组分的迁移时间不同 定量依据：电泳峰的峰面积或峰高
荷/质比越大 跑得越快！！
物质的分离
毛细管电泳法特点
与传统电泳技术相比：
分离效率高：解决了因提高电压带来的焦耳热问题
分离模式多：由电渗流和电泳流共同作用结果，故有多种分类 应用范围广：有机、无机小分子，多肽、蛋白质大分子
带电离子，中性分子
最小检出限低 分析成本低：毛细管本身成本低，溶剂和试剂消耗量少
样品用量少：仅为纳升级（10-9L）

介质的介电常数 与电场强度E无关 eo
注意：
影响因素：pH值（ pH越高，电渗流越大） 离子强度（离子强度越高，电渗流越小） 缓冲溶液添加剂（离子型表面活性剂、有机溶剂）
毛细管电泳法基本原理
方法 电场强 度 结果 正比于电渗 说明
.电场强度降低分离效率和分辨率的降低 .电场强度增加，焦耳热增加
毛细管电泳法类型 —— 毛细管凝胶电泳
毛细管中装入凝胶作支持物进行的电泳。因凝胶具 有多孔性，起类似分子筛的作用，使溶质按分子量 大小逐一分离。且凝胶黏度大，可减少溶质的扩散， 使被分离组分峰形尖锐，以达到最高柱效。 关键是毛细管凝胶柱的制备，常用聚丙烯酰胺。 主要用于核酸片断及蛋白分子量分析 缺点：制作麻烦，寿命短
优点： • 增加对弱极性物质分离的分离度 • 在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用 • 毛细管电泳中唯一能同时分离中性物质和离子型物 质的分离模式。 缺点： • 稳定性不佳，达到好的重复性比较困难
毛细管电泳法类型 —— 微乳液毛细管电动色谱
•实质：在毛细管区带电泳缓冲液加入水包油乳液高分
子离子。
优缺点
接近通用型 DAD可给出光谱信息 灵敏度高 样品常需衍生化 极端灵敏 样品常需衍生化 选择性好 用专门装置测电活性组分 通用型 用专门装置和毛细管处理 灵敏，可给出结构信息 接口复杂
检 测 系 统
荧光 激光诱导 荧光 安培
电导
质谱
10-15～10-16
10-16～10-17
10-7～10-8
10-8～10-9
在MS方面, 几乎各种不同类型质量分析器的质谱仪都可与CE联 用, 其中三重四极杆质谱(TQ-MS)和离子阱质谱( IT-MS)以其仪 器简单、分析速度快的特点应用最为广泛; 与之相比, 飞行时间 质谱(TOF-MS)和傅里叶变换离子回旋共振质谱FT-ICR-MS)适用 于分析更大的分子, 并且具有更高的质量分辨率和准确度, 进一 步提高了CE-MS的分析能力。
毛细管电泳法基本原理
CE所用的石英毛细管柱，在pH 3情况下，其内 表面带负电，和溶液接触时形成了一双电层。 电渗：在高电压作用下，双电层中的水合阳离子 引起流体整体地朝负极方向移动的现象。
毛细管电泳法基本原理
v ( / ) E eo 或 ( / ) eo v 电渗速度 eo eo 电渗迁移率 双电层的Zeta电位
毛细管电泳法类型
毛细管区带电泳（CZE)
毛细管凝胶电泳（CGE） 毛细管等电聚焦（CIEF）
毛细管等速电泳（CITP）
毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC） 微乳液毛细管电动色谱（MEEKC）
毛细管电色谱（CEC）
亲和毛细管电泳（ACE） 非胶毛细管电泳（NGCE）
Hale Waihona Puke 毛细管电泳法类型 —— 毛细管区带电泳
毛细管电泳法基本原理
电泳：在电解质溶液中，带电粒子在电场作用下， 以不同的速度 向其所带电荷相反方向迁移的现象。
q Vep=μep ·E= ·E 6πη r
Vep为离子电泳迁移速度 μep为电泳淌度 E为电场强度 q为离子电荷量 η为介质粘度 r为离子半径。 半径小、电荷高的组分 具有大的迁移率，而半 径大、电荷低的组分具 有小的迁移率。
CE-MS构造
电喷雾电离（ESI）接口技术于1984年在MS中提出，溶液在高 场中毛细管端以1-10ul/min的流速喷射进入MS检测器。接着， whitehouse等人[8]的LC-ESI-MS接口问世。但是，对于LC-MS 的接口都不能直接由CE-MS加以利用，主要原因有两个：一是 CE流量小、流速慢（大多为10~100nl/min）,不能满足各种接口 对流速的要求（2~10ul/min）；二是由于毛细管端不存在缓冲液 中，所以必须解决CE操作中的电接触问题，保证提供分离电流 回路。不过基于whitehouse等人的LC-MS接口理论，smith等[9] 将CE分离毛细管的出口端作喷射源，首先实现了CE-ESI-MS的 在线偶合。电喷雾（ESI）接口作为最早出现的在线联用接口技 术，使得被分析物带上多电荷后采用质谱仪可以检测相对分子质 量达几万甚至十几万的生物大分子。由于ESI自身的优势以及 CE-ESI-MS接口技术的日益趋于成熟, 使CE-ESI-MS已成为CEMS联用技术中占主导地位的方法。CE-ESI-MS接口主要分为鞘 液接口和无鞘液接口两种。
组分分离原 理 适用范围
迁移速率不同
分配系数不同
生物大分子
相反
毛细管电泳法特点
CE的优点可概括为三高二少：高灵敏度，常用紫外检 测器的检测限可达10-1~10-15mol，激光诱导荧光检测器 则达10-19~10-21mol；高分辨率，其每米理论塔板数为 几十万，高者可达几百万乃至千万，而HPLC一般为几 千到几万；高速度，最快可在60s内完成，有250s内分 离10种蛋白质、1.7min分离19种阳离子及3min内分离
仪器简单：只需一个高压电源、一个检测器、一截毛细管 环境友好：分离介质多为水相，且产生废液量少，环境影响小。
毛细管电泳法特点
与高效液相色谱相比的特点：
对比点 流体流动形 式 作用力 柱效
毛细管电泳法 平流，峰展宽小 电渗流和电泳流
高效液相色谱 层流，峰尾宽大 压力流
高，不存在传质阻力， 低，存在涡流扩散、 分子扩散很小 传质阻力、分子扩散
毛细管电泳法类型 —— 毛细管等速电泳
•较早采用的模式，目前应用不多。 •选用淌度比样品中任何待测组分的淌度都高的电解 质作为先导电解质，用淌度比样品中任何待测组分的 淌度都低的电解质作为尾随电解质，夹在先导电角质 和尾随电解质之间的样品组分根据各自的有效淌度不 同而分离，达到平衡时，各组分区带上电场强度的自 调节作用使各组分区带具有相同的迁移速率。 •常用于分离离子型物质。
毛细管电泳法类型 —— 毛细管等电聚焦
基本原理：基于两性电介 质在分离介质中的迁移造 成的pH梯度，使物质根据 它们不同的等电点达到分 离的目的。具有一定等电 点的物质顺着这一梯度迁 移到相当于其等电点的那 个位置，并在此停下，产 生非常窄的聚焦带，并使 不同等电点的蛋白聚焦在 不同位置上。
优点：极高的分辨率，可以分离等电点差异<0.01pH单位的两种蛋白质。
•微乳液是由正构烷烃、表面活性剂、辅助表面活性剂、 缓冲液通过超声处理而组成的稳定透明液体，纳米级，
分散在缓冲液中作为假固定相。
•在MEEKC分离过程中，被分析物的疏水性不同，同微 乳液滴的亲和作用也不同。其脂溶性越强，和微乳液滴 的亲和作用就越强，迁移时间也越长。 •可用于分离多环芳烃、固醇类化合物、脂溶性维生素、 糖类，蛋白类以及药物、手性分离和中性化合物
毛细管电泳法类型 —— 毛细管电色谱
是将HPLC中众多的固定相微粒填充到毛细管中，以 样品与固定相之间的相互作用为分离机制，以电渗流 为流动相驱动力的色谱过程，虽柱效有所下降，但增 加了选择性。 有发展前景的方法。
毛细管电泳法类型 —— 亲和毛细管电泳
亲和毛细管电泳是指 在电泳过程中具有生 物专一性亲和力的两 种分子（受体和其配 体）间，发生了特异 性相互作用，形成了 受体—配体复合物， 从而与其它物质分离， 该方法特别适用于生 物活性分子如蛋白质、 抗生素、核酸等的分 析以及药物中的手性 选择。