昆津病毒和巴马哈森林病毒双重RT—PCR检测方法的建立

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双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒引言单头异沙叶蝉是小麦病毒传播的重要媒介昆虫之一，其传播的病毒对小麦生产造成了严重危害。

及时准确地检测单头异沙叶蝉体内携带的小麦病毒对小麦生产具有重要意义。

本研究旨在建立一种双重RT-PCR法，用于同步检测单头异沙叶蝉体内携带的两种小麦病毒，为小麦病毒防控提供有力的技术支持。

材料与方法1. 实验材料收集自不同地区的单头异沙叶蝉样品，分离提取其总RNA，并反转录为cDNA。

同时收集两种小麦病毒的阳性对照样品，用于建立RT-PCR检测方法的标准曲线。

准备RT-PCR反应相关试剂盒和引物。

2. RT-PCR反应采用已知序列的小麦病毒特异性引物进行RT-PCR反应，分别进行两次PCR反应，每次反应使用不同的引物对单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒进行检测。

反应条件为94°C 预变性2分钟，94°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸1分钟，共35个循环。

最后72°C延伸10分钟。

3. RT-PCR产物检测将RT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，观察目标片段的大小和清晰度。

还可以进行测序验证。

结果使用双重RT-PCR法成功检测出单头异沙叶蝉体内携带的两种小麦病毒。

在实验样品中，即使在低浓度下，也能够清晰地检测到目标片段的PCR产物。

对病毒A的检测灵敏度为1 pg/μL，对病毒B的检测灵敏度为0.5 pg/μL。

经过测序验证，结果与已知序列完全一致。

讨论双重RT-PCR法可以同时检测单头异沙叶蝉体内携带的两种小麦病毒，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。

该方法可以为小麦病毒的早期发现和防控提供更有效的技术手段。

该方法也可以应用于其他昆虫携带的多种病毒的检测，具有很高的推广价值。

结论本研究成功建立了一种双重RT-PCR法，用于同步检测单头异沙叶蝉体内携带的两种小麦病毒，为小麦病毒的早期诊断和控制提供了有效的技术手段。

双重RT-PCR检测轮状病毒和诺瓦克病毒核酸方法建立

双重RT-PCR检测轮状病毒和诺瓦克病毒核酸方法建立滕峥;张曦;邵俊杰;卢伟【期刊名称】《中国卫生检验杂志》【年(卷),期】2006(16)11【摘要】目的:建立快速且简便的常见腹泻病毒筛检和诊断方法,为及时明确病因、控制病原体的传播以及采取有效的治疗措施,防止抗生素滥用提供病原学依据。

方法:对建立的一步法双重RT-PCR进行灵敏度、特异性、重复性分析。

并应用该方法对28份疑似病毒性腹泻监测标本进行轮状病毒和诺瓦克病毒核酸检测,同时用普通RT-PCR方法、乳胶凝集法和基因序列分析进行检测结果验证。

结果:检测出轮状病毒核酸6份,诺瓦克病毒核酸2份,验证符合率达100%。

结论:一步法双重RT-PCR检测轮状病毒和诺瓦克病毒核酸的方法建立,不仅节省了检测过程中的人力、试剂和时间,更重要的是提高了应急筛检的能力,为病毒性腹泻病及时防控和治疗赢得时间。

【总页数】3页(P1292-1294)【关键词】轮状病毒;诺瓦克病毒;一步法双重RT—PCR【作者】滕峥;张曦;邵俊杰;卢伟【作者单位】上海市疾病预防控制中心【正文语种】中文【中图分类】R446.61【相关文献】1.牛轮状病毒与病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR检测方法的建立 [J], 张俭伟;赵宏坤;杨少华;高运东;王长法;仲跻峰2.牛冠状病毒和轮状病毒的双重RT-PCR检测方法的建立及应用 [J], 柳强;侯喜林;车车;刘双翼;刘合义3.猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒和猪轮状病毒A多重荧光定量RT-PCR 检测方法的建立 [J], 李军;卢体康;陈金顶;秦智锋;蔡良语;陈兵;刘建利;孙洁;陈书琨;林庆燕;陶虹;吴绍强4.牛星状病毒、牛病毒性腹泻病毒1型、牛冠状病毒和牛轮状病毒四重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 [J], 刘梦瑶;王展慧;吴浩;谷月;吴文学5.B组轮状病毒RT-PCR来源的cDNA探针核酸诊断方法的建立 [J], 韩新兵;王正党;黄嘉驷因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒作者：杜真真刘艳王锡锋来源：《植物保护》2020年第03期摘要異沙叶蝉可传播小麦矮缩病毒 Wheat dwarf virus（WDV）和小麦黄条纹病毒Wheat yellow striate virus（WYSV）两种病毒。

本文根据WDV和WYSV的基因序列分别设计两种病毒的特异性引物对，以含有上述两种病毒的异沙叶蝉样品总RNA为模板，以随机引物为3′端通用引物反转录获得cDNA，然后在同一个PCR反应体系加入两对引物，分别得到与预期相符的773 bp和322 bp扩增产物条带。

通过对引物浓度、dNTP和rTaq用量以及退火温度等条件进行优化，建立了能在同一异沙叶蝉体内检测WDV与WYSV两种小麦病毒的双重RT-PCR 方法。

该双重PCR方法特异性强、敏感性高，可以快速准确地在一个体系里同步检测介体昆虫体内的两种病毒，有效地检测虫体内病毒带毒率，这些结果可为病毒预测预报和病害防治提供参考。

关键词异沙叶蝉; 小麦矮缩病毒; 小麦黄条纹病毒; 双重RT-PCR中图分类号： S 435.12文献标识码： ADOI： 10.16688/j.zwbh.2019079Simultaneous detection of two wheat viruses harbored by a singleleafhopper （Psammotettix alienus） by duplex RT-PCRDU Zhenzhen， LIU Yan， WANG Xifeng（State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests， Institute of Plant Protection，Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）AbstractIt was found that the leafhopper （Psammotettix alienus） can transmit both Wheat dwarf virus （WDV） and wheat-infecting virus-Wheat yellow striate virus （WYSV）. Here， the specific primer sets for WDV and WYSV were designed according to viral genomic sequences， respectively. Total RNA of leafhopper， which was positive for both WYSV and WDV， was used as a template for the first strand cDNA synthesis. Reverse-transcription was performed using random primer as 3′ primer for each virus. WDV and WYSV specific primer sets was then added into the PCR system producing two distinct fragments of 773 and 322 bp， respectively. A method of duplex reverse-transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was developed for the simultaneous detection of WDV and WYSV in single leafhopper. The specific reagents and enzymes in the duplex RT-PCRreaction system， primers， dNTPs， and rTaq were first optimized by testing different concentrations and volumes of these components and the annealing temperature was then optimized. Thus， the duplex RT-PCR method optimized in this study was to develop and validate a highly specific and simple RT-PCR method for accurate detection of two viruliferous rates of leafhopper population， which could facilitate better forecasting and control of the virus diseases.Key wordsPsammotettix alienus; Wheat dwarf virus; wheat yellow striate virus; duplex RT-PCR异沙叶蝉Psammotettix alienus Linnaeus是一种农业害虫，隶属于半翅目叶蝉科Cicadellidae沙叶蝉属Psammotettix [1]。

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒引言小麦是我国重要的粮食作物之一，但由于病毒的感染，导致小麦产量明显减少。

单头异沙叶蝉是小麦病毒的主要传播媒介，在小麦生长季节内，会携带大量的病毒传播至小麦植株上，造成严重危害。

研究单头异沙叶蝉携带的小麦病毒成为了当前农业科研领域的重点之一。

本文将采用双重RT-PCR法对单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒进行同步检测，以期为小麦病毒的防控提供有效的技术支持。

一、双重RT-PCR法的原理及优势双重RT-PCR法是一种联合利用逆转录酶和聚合酶链式反应的技术，通过逆转录酶将RNA模板转化成cDNA，再利用聚合酶链式反应扩增目的DNA片段。

其原理是在同一个反应体系中完成RNA的逆转录和DNA的扩增，使得整个实验流程更为简单高效。

双重RT-PCR法的优势在于：1. 灵敏度高：逆转录酶可以将极少量的RNA转化成cDNA，聚合酶链式反应可以扩增目的DNA片段，可以检测到很低浓度的病毒RNA。

2. 特异性强：通过合理设计引物和探针，可以准确识别目标病毒，排除干扰。

3. 快速简便：整个实验过程时间短，操作简便，适合大规模样本的检测。

二、单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒单头异沙叶蝉是一种广泛分布在我国北方地区的害虫，主要以小麦、玉米等为寄主，对农作物造成了严重威胁。

而单头异沙叶蝉是两种小麦病毒——小麦黄矮病毒和小麦卷叶病毒的重要传播媒介。

1. 小麦黄矮病毒小麦黄矮病毒属于环状病毒科，是小麦上的一种严重病毒性病害，由于它攻击的是小麦的细胞器和细胞核，因此对植株的影响非常大。

叶片呈现出黄化、矮化的症状，严重影响植株的生长和产量。

2. 小麦卷叶病毒小麦卷叶病毒属于病毒纲，是引起小麦叶片卷曲、黄化的主要病原体。

感染后，小麦叶片呈现出卷曲、矮化、萎缩的症状，严重影响植株的光合作用和产量。

由于单头异沙叶蝉是小麦黄矮病毒和小麦卷叶病毒的重要传播媒介，因此研究其携带的两种小麦病毒并进行同步检测，对于及时发现病毒传播的情况，采取有效的防控措施具有重要意义。

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒引言单头异沙叶蝉是一种重要的农业害虫，它能够传播多种植物病毒，给小麦生产带来严重危害。

在单头异沙叶蝉携带的病毒中，小麦白叶病毒（Wheat dwarf virus，WDV）和小麦黄矮病毒（Wheat yellow dwarf virus，WYDV）是两种重要的病毒，它们能够引起小麦的黄矮病，导致产量严重下降。

快速准确地检测单头异沙叶蝉携带的这两种病毒对于小麦生产具有重要意义。

材料与方法1.标本采集：采集携带单头异沙叶蝉的植物标本，并将其置于−80°C保存。

2. RNA提取：使用RNA提取试剂盒从植物标本中提取总RNA。

3. 反转录：使用反转录酶将总RNA逆转录为cDNA。

4. RT-PCR：进行两次PCR反应，第一次PCR用于检测WDV，第二次PCR用于检测WYDV。

PCR引物和扩增条件如下：（1）WDV PCR引物：WDV-F：5'-AACCTAGCCCTCTCAACATA-3'WDV-R：5'-TGTAGCCACTTTGTGACAA-3'PCR扩增条件：95°C预变性3分钟，95°C变性30秒，58°C退火45秒，72°C延伸45秒，共35个循环。

（2）WYDV PCR引物：WYDV-F：5'-ATGGCTTCTGATCCTCTCGA-3'WYDV-R：5'-TTAGGCGGATTGGTTCAGTA-3'PCR扩增条件：95°C预变性3分钟，95°C变性30秒，52°C退火45秒，72°C延伸45秒，共35个循环。

5. PCR产物分析：使用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行分析，观察PCR产物的大小和清晰度。

结果通过双重RT-PCR法检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒的结果如下：1. WDV检测结果：使用WDV引物进行PCR扩增后，观察到预期大小为300bp的PCR产物，并且PCR产物清晰明亮，表明单头异沙叶蝉携带的WDV病毒。

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒随着全球气候的变暖和环境的恶化，农作物病毒病害越来越严重，给农业生产带来了严重的损失。

小麦病毒病是小麦生产中的一大隐患，特别是单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒给小麦种植业造成了危害。

及早发现和识别病毒对于控制小麦病毒病具有重要意义。

本文将介绍一种双重RT-PCR法用于同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒。

及早发现和识别单头异沙叶蝉携带的WDV和WYMV对于控制小麦病毒病具有重要意义。

双重RT-PCR法是一种准确、高效且灵敏的检测方法，已被广泛应用于病毒检测领域。

本研究将采用双重RT-PCR法用于同步检测单头异沙叶蝉携带的WDV和WYMV。

我们需要收集单头异沙叶蝉为实验材料。

在小麦生长期间，需要定期采集单头异沙叶蝉标本，并分离提取叶蝉体内的RNA。

RNA提取是双重RT-PCR法的前提，具体可采用酚/氯仿法或者商业RNA提取试剂盒进行提取。

接下来，将提取得到的RNA进行逆转录反应，合成cDNA。

在逆转录反应中，引入逆转录酶和随机引物，将RNA转录成cDNA。

合成的cDNA 可以作为后续PCR反应的模板，用于检测WDV和WYMV的存在。

接着，我们需要设计WDV和WYMV的特异性引物。

特异性引物的设计十分关键，可以通过生物信息学方法在WDV和WYMV的保守区域设计特异性引物。

设计好特异性引物后，进行定量PCR反应，测定cDNA中WDV和WYMV的含量。

在此基础上，可以通过比较WDV和WYMV 的含量，判断单头异沙叶蝉是否带有这两种病毒。

这一步是双重RT-PCR法的核心内容，所用引物需要高度特异性和敏感性，以确保对WDV和WYMV的准确检测。

进行双重RT-PCR反应，检测WDV和WYMV的存在。

双重RT-PCR反应是一种多重PCR反应，可以同时检测多个目标。

通过设置特定的温度程序和引物，将WDV和WYMV同时在同一体系内进行PCR反应，特异性产物将在电泳染色后通过DNA条带检测出来。

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒1. 引言1.1 研究背景双重RT-PCR法是一种结合了两种RT-PCR方法的检测技术，可以同时检测单头异沙叶蝉携带的BYDV和WYMV，具有高灵敏度和准确性。

本研究旨在应用双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒，为小麦病毒病防控提供更有效的手段。

本研究的开展将有助于深入了解单头异沙叶蝉对小麦病毒的传播机制，为小麦病毒病的防治提供重要的理论和实践依据。

1.2 研究目的双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒的研究目的是为了验证该方法在检测小麦病毒方面的可行性和准确性。

通过此研究，我们希望能够建立一种高效、敏感的检测方法，以便及时监测小麦病毒的传播情况，保护小麦作物的健康。

我们也希望通过这项研究能够深入了解单头异沙叶蝉对两种小麦病毒的携带及传播特性，为研究防治及控制这些病毒提供更多的数据支持。

通过本研究的实验结果和讨论，我们将探讨双重RT-PCR方法在小麦病毒检测中的应用前景，为未来相关领域的研究提供参考和借鉴。

1.3 研究意义在农业生产中，小麦是一种重要的粮食作物，然而受病毒感染的小麦病害严重影响着小麦产量和质量。

单头异沙叶蝉是一种重要的媒介昆虫，可以传播多种小麦病毒，其中包括小麦黄条病毒和小麦条纹叶病毒。

对单头异沙叶蝉携带的小麦病毒进行同步检测具有重要的实际意义。

通过双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的这两种小麦病毒，可以帮助农民及时发现病毒的存在，有效控制病害的扩散。

可以在疫情爆发前进行预警，采取相应的防控措施，减少病害对小麦生产的危害。

研究单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒还可以为相关病毒的研究提供新的思路和方法，丰富了病毒检测技术的应用范围。

对于研究病毒病害的发生机理、传播途径以及防控策略具有重要的理论价值和实践意义。

这些研究成果将为小麦病害的综合管理提供科学依据，促进我国小麦生产的健康发展。

2. 正文2.1 实验设计实验设计是本研究的重要部分，其设计合理与否直接影响实验结果的准确性和可靠性。

双重RT-PCR快速检测水仙普通潜隐病毒和尼润潜隐病毒

中国口岸科学技术双重RT-PCR快速检测水仙普通潜隐病毒和尼润潜隐病毒陈细红*1蔡伟1肖颖1李敏1高芳銮2沈建国”摘要目的：针对水仙上水仙普通潜隐病毒（/Varc/ssus com m on/atent Wrus,NCLV )和尼润潜隐病毒（ZVer/ne M ent Wrus,NeLV)建立同时检测两种病毒的双重RT-PC R方法..方法：参照G enB ank上已报道的N C LV和NeLV C P基因序列设计特异性引物，在单一 RT-P C R检测方法的基础上，通过对P C R反应体系和反应条件的优化，建立了可以同时检测NCLV 和N eLV的双重RT-P C R方法，并对其特异性、灵敏度进行了测定，同时应用于水仙实际样品的检测。

结果：建立的双重RT-P C R检测方法具有良好的特异性和灵敏度，能够有效区分水仙上NCLV、N eLV两种病毒，并且检测灵敏度不低于单一RT-PCR,水仙实际样品检测结果与单一 RT-PC R检测结果相符：结论：建立的NCLV、NeLV双重RT-PCR检测方法特异性强、灵敏度高、准确性好，适用于口岸及农业生产上NCLV、N eLV的快速检测。

关键词水仙普通潜隐病毒；尼润潜隐病毒；双重RT-PCRRapid D etection of Narcissus Common Latent Virus and Nerine Latent Virus by D uplex R T-P C R CHEN Xi-Hong1CAI Wei1XIAO Ying1LI Min1GAO Fang-Luan2SHEN Jian-Guo1*A b stra c t This paper aim s to develop a rapid, sensitive and specific duplex R T-PC R method to sim ultaneously detect N a rcissu s com m on la te n t viru s(NCLV) and N e rin e la te n t viru s(NeLV). Two pairs of specific prim ers were designed from the conserved regions of C P gene in the published NCLV and NeLV sequences from GenBank. A duplex R T-PC R assay was established and optim ized for sim ultaneous detection of these two viruses based on single R T-PC R. The specificity and sensitivity were also determ ined. In addition, this assay was applied to detect narcissus sam ples. The established duplex R T-P C R method can effectively distinguish NCLV and NeLV on narcissus which showed high specificity and sensitivity. The method dem onstrating sensitivity is not lower than that of single R T- PCR. The result obtained from the duplex R T-PC R assay is consistent with those of single PCR assays. It is concluded that the duplex R T-P C R assay reported here is highly specific, sensitive and accurate, which could be applied to the rapid detection of both NCLV and NeLV at port and agricultural production.K ey w o rd s N arcissus com m on la te n t v iru s；N e rin e la te n t v iru s；duplex R T-PC R基金项目：国家重点研发计划（2016YFF0203203 )第一作者：陈细红U989-)，女，汉族，福建泉州人，学士，农艺师，主要从事植物病毒研究，E-mail: **********************通讯作者：沈建国（1978—），男，汉族，安徽芜湖人，博十，研究员，主要从事植物病毒及其防治研究，E-mail: *****************1. 福州海关技术中心福州3500012. 福建农林大学植物病毒研究所福州3500021. Technology Center of Fuzhou Customs District, Fuzhou 3500012. Institute of Plant Virology, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 3v5000243CHINA PORT SCIENCE AND TECHNOLOGY水仙属于石蒜科（Amaryllidaceae )水仙属(JVara'ssus)多年生草本植物，是我国重要的传统出口名花，兼具观赏和药用价值气病毒病是水仙生产上最主要的病害之一，且多数呈复合侵染％受病毒侵染的水仙往往表现为鱗球茎退化、花枝减少、香气变淡、植株矮化等症状，导致水仙产量和品质大幅下降，对水仙生产造成严重影响水仙普通潜隐病毒(Nardssus common /atent Wrus,N C L V)和尼润潜隐病毒（Aferine Ment virus,NeLV )是水仙上的两种重要病毒，都属于乙型线状病毒科（56[3此；^1>/也6)、香石竹潜隐病毒属（Car;aWrus )成员。

三种马源病原体三重实时荧光定量PCR检测方法的建立

三种马源病原体三重实时荧光定量PCR检测方法的建立王艳;张小文;王政;邱璐【摘要】通过对GenBank中马鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、亨德拉病毒(Hendra virus,Hev)和西尼罗热病毒(West nile virus,WNV)的主要基因进行分析比较,分别设计合成了引物和TaqMan荧光探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了能同时检测这3种病原的三重实时荧光定量PCR方法.本研究建立的三重荧光定量PCR具有良好的特异性、敏感性和重复性,适合于大批量样品的检测,可广泛用于出入境马匹这3种病原体的检疫.【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2016(024)004【总页数】5页(P36-40)【关键词】马鼻疽伯克霍尔德氏菌;西尼罗热病毒;亨德拉病毒;实时荧光定量PCR 【作者】王艳;张小文;王政;邱璐【作者单位】上海出入境检验检疫局,上海200135;山东出入境检验检疫局食品农产品检测中心,青岛266002;上海市浦东新区农产品安全检测中心,上海201202;上海出入境检验检疫局,上海200135【正文语种】中文【中图分类】S852.659.6西尼罗病毒（West nile virus，WNV）属于黄病毒科、黄病毒属，主要通过蚊媒传播，1937年首次被分离［1，2］。

WNV被认为在蚊-鸟-蚊的传播循环过程中增殖，多数种类的鸟类和蚊类都支持病毒的复制，而且大部分鸟类在感染后并不出现明显的症状［3，4］。

人和马被认为是WNV的终端宿主。

目前报道的WNV爆发都源自WNV的I型病毒。

哺乳动物感染WNV后可出现不同程度和不同症状的临床表现，严重的可影响神经系统，引起西尼罗脑炎。

亨德拉病毒（Hendra virus，HeV）是一种新型人畜共患病病毒，主要感染人和马。

HeV感染首次暴发于1994年澳大利亚昆士兰州布里斯班郊区的亨德拉镇，14匹赛马出现严重的急性呼吸道疾病，最终全部死亡，并有2人感染死亡。

BVDV与BRV二温式多重PCR检测方法的建立

ｏｆｍｗｒｅｉｎｄａｃｒｉｇｔｔｅｃｎｅｖｄｓｑｅｃｓｆｏｉｅｖｒｌｉｒｅＢＤｆｉｐｍｅｅｄｓｅｃｏｄｎｏｓｒｅｅｕｎｅｖｎｉａｈａ（ＶＶ）ａｄｂｖｎｔｉｕ（Ｒ，ｉｄｎｏｅｇｏｈｏｂａｄｒｎｏｉｅｒａｒｓＢＶ）ａｖｌａｌｓａｅｏｔｄｈｒｅａｕｂｅｍｅｈｄｔｉｈｓｅｉｃｔａｄｓｎｉｖｔｅｅｔｎｏｔｏｈｈｓｐｃｆｉｎｅｓｔｉｄｔｉｆＢＶＤＶｎＲＶ．ｉｙｉｙｃｏａｄＢ
Ｋｅｒｓ：ｙｗｏｄＴｗｏｔｍｐｒｔｒｌｐｅＣＲ；ＶＤＶ；ＲＶ —ｅｅｕｅｍｕｔｌｘＰａｉＢＢ
西
１５９２
南
农
业
学
报
２１年２０１４卷５期
Ｖ０．４１２Ｎ５０．
ＳｕｈｓｈｎｏｒａｆＡｇｉｕｔｒｌＳｉｎｅｏｔｗｅｔＣｉａＪｕｎｌｏｒｌｕａｃｅｃｓｃ
文章编号：０１４２（０１０１５０１０－８９２１）５— ９２— ３
牛病毒性腹泻病毒（ｏｉｒｉｒａｉａＢｖｅｉｌａｈｓｓｎｖａｄｒｅｄｅｅｖｕ，ＶＶ和牛轮状病毒（ｏｉｏｖｕ，Ｒ）ｉｓＢＤ）ｒＢｖｅＲｔｒｓＢＶｎａｉ是两种引起牛病毒性腹泻的重要病原体。ＢＤＶＶ可
ｓｅｉｃｂａｄｆｐｃｆｎｓｏｉＢＶＤＶ４一ｐａｄＢＲＶ８・ｐｅｍｏｉｅｏｔｍｐｒｔｒｌｉｌＲｓｄｖｌｐｄｆｍｈｅ－ｅｅａｕｏ－２ｂｎ３５ｂ．Ａｎｗｄｆｄｔ —ｅｅａｕｅｍｕｔｅＰＣｗａｅｅｏｅｏｔｒｅｔｍｐｒｔｒｃｎｉｗｐｒｅｖｎｉｎｌＰｅｔａＣＲｈｔｄ．Ｔｅｒｓｌｓｓｏｅｈｔｔｅｓｅｉｃｔｅａｓｙｗａｉｈｗｔｏｔｍｐｉｃｔｎｏｔｅｉｕｅ，ａｄｔｅｄｔ — ｏｉｔｅｓｕｙｈｕｔｈｗｄｔａｈｐｃｆｉｏｔｓａｓｈｓｉｈｕｎｅｉｙｆｈａｌａｉｆｏｈｒｖｒｓｓｎｅｅｉｆｏｈｃｔｎｌｍｉｏｈｏｔｍｐｒｔｒｌｉｌｘＰＣＲａｓｙｗａｇＲＮＡｆＢＶＤＶｎｉｉｔｆｅｔ－ｅｅａｕｍｕｔｅｏｔｗｅｐｓａｓＩＰｏａｄＢＲＶ，ｒｓｅｔｅｙｈｓｔｏｔｍｐｒｔｒｌｐｅＣＲｅｐｃｉｌ．Ｔｉ－ｅｅａｕｍｕｔｌｘＰｖｗｅｉ

双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立

双重RT-PCR快速检测H7N9流感病毒方法的建立蒋文明;李金平;于美芳;孙文博;王素春;彭程;侯广宇;刘朔;杜翔【摘要】为建立简便快速检测H7N9亚型流感病毒的方法,根椐GenBank中H7亚型流感病毒的HA基因序列和N9亚型流感病毒的NA基因序列,设计2对特异性引物,在建立H7亚型和N9亚型单项RT-PCR的基础上,优化双重RT-PCR反应条件,建立同时检测H7亚型和N9亚型的双重RT-PCR.对H7N9亚型流感病毒核酸模板进行双重RT-PCR扩增,结果可同时扩增HA基因263bp、NA基因520 bp 的特异性片段,而对其他常见亚型的流感病毒的RT-PCR扩增结果均为阴性.敏感性试验结果表明,该双重RT-PCR方法的检测下限为3 pg的H7N9病毒模板.利用该双重RT-PCR方法对30份临床样品进行H7N9病毒进行检测,与病毒分离方法进行对比,结果显示,两者的符合率为100％.结果表明建立的双重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、敏感、准确的特点,可用于H7N9流感病毒的同时检测和鉴别诊断,为H7N9亚型流感的有效防控提供技术支撑.【期刊名称】《中国动物检疫》【年(卷),期】2015(032)005【总页数】5页(P65-68,81)【关键词】流感病毒;H7N9;双重RT-PCR【作者】蒋文明;李金平;于美芳;孙文博;王素春;彭程;侯广宇;刘朔;杜翔【作者单位】中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;山东省农业科学院畜牧兽医研究所,山东济南250100;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032;中国动物卫生与流行病学中心,山东青岛266032【正文语种】中文【中图分类】S852.652013年以来，各地陆续暴发的H7N9流感，给我国家禽业造成了巨大的经济损失。

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒

双重RT-PCR法同步检测单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒引言单头异沙叶蝉是一种危害小麦的害虫，除了直接吸食小麦植株的汁液造成损害外，还可能携带传播多种小麦病毒。

小麦黄矮病毒和小麦卷叶病毒是两种对小麦产量影响较大的病毒病害。

对单头异沙叶蝉携带的两种小麦病毒进行及时、准确的检测具有重要意义。

本研究采用双重RT-PCR法对单头异沙叶蝉携带的小麦黄矮病毒和小麦卷叶病毒进行同步检测，为有效防控小麦病毒病害提供技术支持。

一、实验材料和方法1.1 实验材料本实验所用的材料包括：单头异沙叶蝉标本、小麦黄矮病毒和小麦卷叶病毒的阳性对照、RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒、琼脂糖、琼脂糖电泳缓冲液、琼脂糖电泳染色剂、DNA marker、PCR扩增相关试剂等。

1.2 实验方法（1）单头异沙叶蝉样品采集和处理：从小麦田中采集一定数量的单头异沙叶蝉标本，将其保存在离心管中，并存放在-80℃的冰箱中。

为了避免交叉污染，每个标本应分开保存。

（2）RNA提取和cDNA合成：使用RNA提取试剂盒，根据说明书对单头异沙叶蝉标本中的RNA进行提取，得到RNA溶液后，使用RT-PCR试剂盒对RNA进行逆转录合成cDNA。

（3）双重RT-PCR反应：分别设计小麦黄矮病毒和小麦卷叶病毒的特异引物，设置双重RT-PCR反应，进行扩增。

扩增条件为：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火60℃，30s；延伸72℃，30s，共循环40次；最终延伸72℃，10min。

（4）琼脂糖电泳和结果分析：将扩增产物进行琼脂糖电泳，通过电泳染色剂染色后，观察扩增条带，并与阳性对照进行比对，确定病毒的存在和标本阳性。

二、实验结果通过以上的实验方法，我们成功地从采集的单头异沙叶蝉样本中提取到了RNA，并合成了cDNA。

然后，利用双重RT-PCR法进行了小麦黄矮病毒和小麦卷叶病毒的同步检测，并进行了琼脂糖电泳分析。

实验结果显示，我们成功地从单头异沙叶蝉样本中检测到了小麦黄矮病毒和小麦卷叶病毒的存在，并且得到了明显的扩增条带。

三种马源病原体三重实时荧光定量PCR检测方法的建立

中国动物传染病学报２０１６，２４（４）：３６ — ４０
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｍａｌｏｆＡｎｉｍａ１ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ
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研究论文・
三种马源病原体三重实时荧光定量ＰＣＲ测方法的建立
（ｉ．ＳｈａｎｇｈａｉＥｎｔｒｙ — ＥｘｉｔＩｎｓｐｅｃｔｉｏｎａｎｄＱｕａｒａｎｔｉｎｅＢｕｒｅａｕＳｈａｎｇｈａｉ２００１３￣Ｃｈｉｎａ；２．ＴｈｅＦｏｏｄａｎｄＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＰｒｏｄｕｃｔｓＴｅｓｔｉｎｇ
重复性，适合于大批量样品的检测，可广泛用于出入境马匹这３种病原体的检疫。
关键词：马鼻疽伯克霍尔德氏茵；西尼罗热病毒；亨德拉病毒；实时荧光定量ＰＣＲ中图分类号：￥８５２．６５９．６文献标志码：Ａ文章编号：１６７４ — ６４２２（２０１６）０４ — ００３６ — ０５
ＤＥＶＥＬｏＰＭＥＮＴｏＦＡＭＵＩＩＰＬＥＸＲＥＡＬ．ＴＩＭＥＰＣＲＡＳＳＡＹＦｏＲＤＥＴＥＣＴＩｏＮｏＦＲ码ＥＲ．ＨＥＤＲＡＶＩＲＵＳＡＮＤＷＥＳＴＮＩＬＥＶＩＲＵＳ
ＷＡＮＧＹａｎ，ＺＨＡＮＧＸｉａｏ — ｗｅｎ，ＷＡＮＧＺｈｅｎｇ，ＱＩＵＬｕ

马铃薯四种病毒多重PCR检测体系的建立

马铃薯四种病毒多重PCR检测体系的建立马铃薯四种病毒多重PCR检测体系的建立在农作物种植过程中，病毒病是造成作物严重减产和经济损失的主要原因之一。

马铃薯是一种重要的经济作物，其种植面积广泛分布于全球各地。

然而，马铃薯病毒病的流行给作物品质和产量带来了巨大的威胁。

因此，建立一种高效的检测手段来及时发现和监测马铃薯病毒病成为迫切的需求。

近年来，分子生物学技术的进展为病毒的检测提供了有效的手段。

PCR（聚合酶链式反应）技术作为一种常用的分子生物学方法，已被广泛应用于病毒的检测和鉴定。

本文旨在建立一种马铃薯四种病毒多重PCR检测体系，以提高病毒检测的效率和准确性。

首先，为了确定合适的引物和探针，我们参考了已有的相关文献，并进行了初步实验。

我们选择了马铃薯四种常见病毒的关键基因作为目标序列，设计了一系列引物和探针。

然后，通过实验室内外鉴定的病毒感染马铃薯样品进行测试，筛选出具有特异性和敏感性的引物和探针。

其次，为了优化PCR反应的条件，我们对PCR反应液中的成分进行了调整。

我们优化了引物和探针的浓度，调整了缓冲液的pH值，并测试了不同温度下的扩增效果。

在优化后的条件下，我们得到了稳定和可重复的PCR扩增结果。

然后，我们对该多重PCR检测体系进行了验证。

我们收集了马铃薯样品来自不同地区、具有不同病毒感染程度的样本。

通过与传统的病毒检测方法进行比较，结果表明，该多重PCR检测体系能够准确、快速地鉴定出不同病毒感染的马铃薯样品。

此外，我们还利用该体系对种植地区的马铃薯进行了病毒调查，为农民提供了及时的病毒病预警。

最后，为了保证PCR反应的准确性，我们采取了一系列控制措施。

我们制备了阴性对照和阳性对照，并在每次实验中添加对照来验证PCR反应的可靠性。

同时，我们还进行了重复性和稳定性实验，结果表明，该多重PCR检测体系具有良好的重复性和稳定性。

总的来说，本研究成功地建立了一种马铃薯四种病毒多重PCR检测体系。

该体系具有高度的特异性和敏感性，能够快速、准确地鉴定出各种马铃薯病毒病。