pMSCV-PIG逆病毒载体使用说明
慢病毒生产及使用操作手册
慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6 h 更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。
以下内容由汉恒生物科技（上海）有限公司精心整理总结。
二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2, pMD2G,pHBLV TM系列质粒。
1、载体信息（见附录）2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10% FBS)。
贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。
3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。
用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
三、包装细胞293T细胞的培养（一） 293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。
为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。
在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。
1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1～2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混匀，移入离心管中。
3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入 3mL 37 ℃预热的 10％ DMEM，用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6～8 次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf 管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中计数。
计数板上共 4 大格，每大格 16 小格。
计数时，4 大格均计数，总数除以 4（得每大格细胞数），再乘以 10（10 倍稀释），即为实际 n万/mL 细胞浓度。
4、细胞离心，1000rpm，5min。
逆转录病毒试用装操作手册
汉恒逆转录病毒操作手册一、逆转录病毒的试用装分装与储存1.收到汉恒生物逆转录病毒产品后，请先对逆转录病毒产品进行分装处理，建议20-50μl/管。
如1-2天内使用，则留足够量病毒4℃保存，余下逆转录病毒置于-80℃长期保存。
2.病毒可以存放于-80℃ 6个月以上；但如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前重新测定病毒滴度。
3.反复冻融会降低逆转录病毒滴度：逆转录病毒滴度越低，冻融对滴度的影响越大，108IU/ml的逆转录病毒冻融2次滴度没有显著性差异，第3次冻融开始，每冻融一次滴度降低约10%；滴度107IU/ml滴度逆转录病毒，从第2次冻融开始，每次冻融病毒滴度下降10%-15%。
二、逆转录病毒试用装实验策略与关键知识点1.逆转录病毒感染策略：逆转录病毒本身的病毒滴度不高，感染细胞时病毒消耗量较大，试用装体积较小，建议使用96孔板进行MOI梯度感染测试。
逆转录病毒感染细胞后会反转录并插入基因组形成稳转，因此逆转录病毒感染一般采用感染少量细胞，然后将细胞放大化培养。
而不是直接大量感染。
注意：对于一些传代能力较差的原代细胞，比如BMSC等，建议采用腺病毒感染。
2.逆转录病毒感染关键知识点1）细胞准备：由于试用装体积有限，请使用96孔板准备细胞，逆转录病毒感染细胞前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。
逆转录病毒感染的时候细胞汇合率为40%～60%间为宜。
2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。
逆转录病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别，原则上最适MOI是感染效率较好的最低MOI。
MOI一般以3：10：30：100的比例递增进行梯度摸索，一般的细胞基础逆转录病毒感染MOI 可从3为开始，即设立4个常规的MOI摸索，即3，10，30，100。
3)助转剂polybrene的选择：实验证明，polybrene可提高逆转录病毒对大部分细胞的感染效率，但polybrene 有一定的细胞毒性，不同细胞对polybrene的敏感度不同，polybrene最常用的工作浓度为5～8μg/ml。
pFB-hrGFP逆病毒载体使用说明
pFB-hrGFPpFB-hrGFP 逆病毒载体基本信息：载体名称:pFB-hrGFP 质粒类型: 逆病毒载体 高拷贝/低拷贝: 低拷贝 克隆方法: 限制性内切酶，多克隆位点启动子:-- 载体大小:5838 bp 5'测序引物及序列:-- 3' 测序引物及序列:-- 载体标签:-- 载体抗性: 氨苄青霉素 筛选标记: 无 克隆菌株: DH5α 等 宿主细胞（系）: 常规细胞系（293、CV-1、CHO 等）备注:逆病毒载体pFB-hrGFP 组成型表达hrGFP 绿色荧光蛋白；hrGFP 细胞毒性低稳定性: 稳表达 组成型/诱导型: 组成型 病毒/非病毒: 逆转录病毒pFB-hrGFP 载体质粒图谱和多克隆位点信息：pFB-hrGFP载体简介：pFB-hrGFP载体限制性酶切位点pFB-hrGFP, 5838 bp version 013001Enzymes with 1-10 cleavage sites:#sites -- Bp position of recognition site --AatII 2 978, 5764Acc65I 3 647, 1846, 3364AccI 3 1967, 2057, 3724AflII 3 202, 1265, 2919AflIII 3 164, 2157, 3953AgeI 1 1840AhdI 6 687, 733, 1274, 3404, 3450 4841Alw44I 4 1054, 3769, 4267, 5513AlwNI 6 323, 398, 2084, 3040, 3115 4364ApaI 1 1238ApoI 3 87, 1128, 2063BanII 8 580, 593, 764, 1238, 2266 3297, 3310, 3481BbeI 4 615, 1656, 2234, 3332BbsI 3 2494, 2686, 5831BbvCI 2 453, 3170BciVI 5 656, 1986, 3373, 4162, 5689 BglI 1 4960BglII 1 1678BpmI 5 1799, 2135, 2681, 2867, 4931 Bpu10I 8 337, 412, 453, 1548, 2263 3054, 3129, 3170BsaAI 5 1816, 2000, 2156, 2693, 3705 BsaHI 7 615, 978, 1656, 2234, 3332 5382, 5764BsaI 10 694, 715, 782, 1414, 1802 2726, 3411, 3432, 3499, 4913 BsaWI 5 138, 1840, 4159, 4306, 5137 BseRI 6 718, 1068, 1561, 1600, 2426 3435BsgI 2 2213, 2774BsiEI 8 961, 1034, 1838, 2801, 3866 4290, 5213, 5362BsiHKAI 7 580, 1054, 3297, 3769, 4267 5428, 5513BsmBI 6 976, 1093, 1337, 1396, 1582Bsp120I 1 1238BspHI 4 2115, 4673, 5681, 5786BspLU11I 2 164, 3953BsrBI 5 1299, 2798, 2823, 3884, 5685 BsrDI 2 4900, 5082BsrGI 2 1541, 2532BssHII 2 563, 3280BssSI 5 2723, 2777, 4126, 5510, 5817 Bst1107I 1 3724BstAPI 5 322, 397, 3039, 3114, 3771 BstEII 1 1346Bsu36I 1 1276Cfr10I 5 1840, 2099, 2348, 2504, 4926 DraI 3 4710, 4729, 5421DraIII 1 1873DrdI 2 3642, 4055DsaI 4 151, 931, 2070, 2166EaeI 7 827, 961, 1368, 1389, 1668 2801, 5234EarI 5 1334, 1564, 2626, 3831, 5635 Ecl136II 2 580, 3297Eco52I 2 961, 2801Eco57I 3 2090, 4480, 5528Eco72I 2 2000, 2156EcoNI 2 1647, 2419EcoO109I 5 499, 1477, 1924, 3216, 5821 EcoRI 1 2063EcoRV 4 308, 383, 3025, 3100EheI 4 615, 1656, 2234, 3332FspI 2 2613, 5066HaeII 6 615, 1656, 2234, 3332, 3827 4197HgaI 6 889, 1166, 3659, 4055, 4633 5383HincII 2 2057, 5385HinfI 10 637, 1020, 1045, 1863, 2829 3354, 3853, 3928, 4324, 4841 KasI 4 615, 1656, 2234, 3332KpnI 3 647, 1846, 3364MscI 3 827, 1368, 1668MslI 6 159, 2068, 2617, 5094, 5253 5612MunI 2 11, 21NarI 4 615, 1656, 2234, 3332NcoI 2 2070, 2166NdeI 3 1664, 1672, 3775NgoMIV 1 2348NheI 5 6, 16, 26, 197, 2914 NotI 1 2800NspI 4 164, 2610, 3588, 3953PleI 9 637, 1020, 1045, 1863, 2829 3354, 3853, 4324, 4841PpuMI 4 499, 1477, 1924, 3216PshAI 1 1015Psp1406I 2 5071, 5444PstI 5 1178, 1360, 2105, 2510, 5087 PvuI 2 1034, 5213PvuII 7 286, 361, 2207, 2602, 2741 3003, 3078SacI 2 580, 3297SacII 1 151SalI 1 2057SapI 2 2626, 3830SbfI 1 2104ScaI 1 5324SchI 9 637, 1020, 1045, 1863, 2829 3354, 3853, 4324, 4841SexAI 1 1474SfcI 10 182, 1178, 1360, 2105, 2510 2599, 2899, 4218, 4409, 5087 SmaI 4 643, 1241, 2018, 3360SmlI 8 202, 1265, 2795, 2919, 4059 4321, 4598, 5466SpeI 1 897SrfI 1 1240SspI 1 5648StyI 8 496, 706, 1504, 2070, 2166 2229, 3213, 3423TatI 5 1541, 2451, 2532, 3759, 5324 TfiI 1 3928Tsp45I 7 1282, 1491, 2225, 3608, 3703 5103, 5314TspRI 10 1284, 1875, 3849, 4355, 4368 4639, 4788, 4893, 5240, 5267 Tth111I 4 633, 1473, 3350, 3697VspI 1 5017XbaI 3 464, 2036, 3181XcmI 1 2517XhoI 1 2795XhoII 10 1678, 2085, 2217, 2400, 4594 4605, 4691, 4703, 5471, 5488 XmaI 4 643, 1241, 2018, 3360XmnI 2 2644, 5441Enzymes that do NOT cut molecule:AccIII AscI BamHI BclI BlnI Bpu1102I BsaBI BsiWI BsmI BspMI BstBI BstXI ClaI Eco47III FseI HindIII HpaI MluI NruI NsiI PacI PmeI Ppu10I RsrII SanDI SfiI SgfI SgrAI SnaBI SphI StuI SwaI Van91IpFB-hrGFP载体序列。
汉恒生物-病毒载体操作安全手册
病毒载体操作安全手册引言根据W HO生物安全手册对感染性微生物的相对危害程度制订的危险度等级的划分标准。
病毒的危险度为 4 级，它对个体和群体的危险均高，通常能引起人或动物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。
所以我们需要制定一定的安全注意事项，包括设备的要求、操作人员的防护、操作的规范性以及废弃物的处理等，以避免潜在的危险。
一、病毒房设备要求我们知道细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。
目前超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。
细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。
病毒房的设备在普通细胞房的基础上要求更高，尤其是其无菌操作设备。
(一)无菌操作区1、无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。
理想的无菌操作室应划为三部分：1（1）更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。
（2）缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。
（3) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。
无菌操作间的空气消毒：紫外线灯。
2、二级生物安全柜：生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。
（二）孵育区本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。
孵育一般可在恒温培养箱内进行。
（三）制备区在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备，如条件有限，可以在操作区进行。
（四）储藏区主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。
逆转录病毒载体
逆转录病毒载体逆转录病毒的许多特点使其成为基因转移载体的最佳选择。
它可有效的整合入靶细胞基因组并稳定持久地表达所带的外源基因。
病毒基因组以转座的方式整合，其基因组不会发生重排，因此所携带的外源基因也不会改变。
逆转录病毒属RNA病毒，通过其本身逆转录酶的作用，形成双链DNA原病毒,然后整合于宿主细胞染色体中。
逆转录病毒是一类正链RNA病毒，其分为顺式功能基因和反式功能基因。
由于逆转录病毒包膜上有env 编码的糖蛋白能被许多哺乳动物细胞膜上特异性受体所识别，并能介导逆转录病毒的遗传物质高效地进入宿主细胞内；同时逆转录病毒结构基因gag、env 和pol的缺乏不影响其他部分的活性，因此可用外源性基因代替这部分病毒基因，外源性基因最大容量为8.0kb左右，可适用于大部分目的基因；并且病毒在自身表达的整合酶催化作用下可高效地整合入宿主细胞染色体中，这有利于外源基因在宿主细胞的永久表达。
构建载体时以DNA原病毒为基础，将野生型病毒的3类结构基因gag，pol和env删除，以供外源基因的插入，但是要保存病毒的包装序列（ψ）和双侧的长末端重复（LTR），LTR含有启动子、增强子、整合信号及poly A信号等多种元件。
插入的基因一般为两种或两种以上，如目的基因和标记基因。
因此和逆转录病毒结合的是DNA。
将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高浓度的病毒颗粒，人为感染着床前或着床后的胚胎，也可以直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染的目的，通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中去。
通过此方法，得到了转基因鸡和转基因牛。
这种逆转录病毒被用重组DNA技术修饰后作为基因载体在应用中优于微注射法之处为：无需要重排，可在整合点整合转移基因的单个拷贝；将胚胎置于高浓度病毒容器中，或者与被感染的细胞体外共同培养，或微注射鸡胚盘里，整合有逆转录病毒的DNA的胚胎率高。
缺点是：需要生产带有转基因的逆转录病毒；插入逆转录病毒的基因有一定的大小限度；所得转基因家畜的嵌合性很高，而需要广泛的杂交，以建立转基因系；转基因的表达问题尚未解决。
猪附红细胞体病实验室elisa法试剂盒检测血清抗体操作规程
猪附红细胞体病实验室elisa法试剂盒检测血清抗体操作规程猪附红细胞体病是一种常见的猪源性疾病，该病由猪附红细胞体病病毒（PRRSV）引起。
为了及时、准确地诊断和监测该病，我们可以采用ELISA法试剂盒来检测猪血清中的抗体水平。
下面是一份关于ELISA法试剂盒检测猪血清抗体的操作规程，希望能够为您提供指导意义:一、实验前的准备工作：1. 准备工作台，消毒所需仪器和试剂。
2. 恢复试剂：将试剂从-20℃的冷冻储存环境中取出，置于室温下恢复至室温。
3. 样品标签准备：使用清洁的试管或标签，准备标签，并在上面写上标本编号和日期。
4. 样品溶液准备：根据试剂盒说明书准确配制稀释液，并确保其清洁和无杂质。
5. 阴、阳性对照品准备：根据试剂盒说明书选择合适的阳性和阴性对照品，并准确配制稀释液。
二、操作步骤：1. 样品准备：将猪血清标本置于离心管中，离心10分钟（1000×g，4℃），收集上清液。
2. 样品稀释：将收集的上清液与稀释液按比例混合，均匀摇混，制备所需的稀释样品。
3. 阳性、阴性对照品处理：按照试剂盒说明书中的方法，将阳性和阴性对照品与稀释液按比例混合，制备所需的稀释样品。
4. 试剂处理：按照试剂盒说明书中的方法，向每个微孔中加入试剂，并按照要求的顺序摇晃或轻轻拍打微孔板，使试剂充分混合。
5. 样品加入：将稀释后的样品加入到微孔板中，每个孔约加入100 μl，确保每个孔都有样品。
6. 孔板封膜：使用盖膜密封微孔板，确保不留有气泡。
7. 孵育：将密封好的微孔板放入恒温孵育箱中，按照试剂盒说明书中的孵育时间和温度进行孵育。
8. 洗涤：将微孔板取出，倒掉上清液，用稀释液洗涤每个孔，重复3次，每次倒掉洗液。
9. 显色：将染色液加入到每个孔中，孵育一定时间后，观察颜色反应。
10. 停止反应：将停止液加入到每个孔中，停止反应。
11. 读板：使用ELISA阅读器读取每个孔的吸光度值，在波长为450nm处记录吸光度读数。
猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法
猪用生物制品及相关猪源原辅材料中非洲猪瘟病毒核酸检测方法1 适用范围1.1猪用及采纳猪源原辅材料制备的生物制品成品及半成品。
1.2猪源毒种。
1.3 猪源细胞及相关制品生产用细胞。
1.4其他猪源原辅材料〔如组织、血清、胰酶衍生物等〕。
2 取样和处理2.1 疫苗2.1.1 活疫苗取至少2瓶样品，按瓶签注明头份用适宜稀释液分别稀释成10头份/0.2ml，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.1.2 灭活疫苗取至少2瓶样品，等量混合后进行以下处理。
2.1.2.1 油佐剂灭活疫苗取36 ml混合疫苗，参加正戊醇4.0 ml，充分振荡混合1分钟，2～8℃冰箱静置不少于60分钟，直至油相和水相别离。
取水相进行核酸提取。
2.1.2.2 水性佐剂灭活疫苗2.1.2.2.1铝胶佐剂灭活疫苗取混合疫苗5.0 ml，摇匀，参加0.25 g解离剂CPG-odn〔人工合成的寡聚核苷酸〕，放入摇床〔200 r/min〕37℃解离1小时，5000 r/min离心10分钟，取上清液进行核酸提取。
2.1.2.2.2其他水性佐剂灭活疫苗直接取混合样品进行核酸提取。
2.2 其他生物制品和半成品冻干类制品，按活疫苗进行取样和处理；液体制品及半成品，取至少2份〔瓶〕样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.3 猪源毒种取至少2支毒种。
冻干毒种，按冻干前体积复溶后等量混合，取混合液进行核酸提取；非冻干毒种，等量混合后直接取混合液进行核酸提取。
2.4 猪源细胞除另有规定外，取至少2瓶细胞浓度不少于107.0个细胞/ml的细胞悬液进行核酸提取。
2.5 其他猪源原辅材料2.5.1 猪组织每种组织，分别取样和处理。
取不少于2.0 g组织，研磨后用5倍体积灭菌PBS悬浮，70℃灭活30分钟，4℃下以2022～3000 g离心10分钟，取上清液进行核酸提取。
2.5.2 猪血清每批血清取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
2.5.3 猪胰酶干粉状胰酶，取至少2份样品，依据使用情况分别配制成不低于 2.5%浓度的溶液，等量混合，取混合液进行核酸提取；液体胰酶，取至少2个最小包装的样品，等量混合，取混合液进行核酸提取。
猪细小病毒(PPV)说明书定性
猪细小病毒(PPV)酶联免疫分析（ELISA）试剂盒使用说明书本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定猪血清，血浆及相关液体样本中猪细小病毒(PPV)水平。
实验原理：本试剂盒采用双抗体夹心法测定血清或血浆中猪细小病毒(PPV)。
用纯化的猪细小病毒(PPV)抗体包被微孔板，制成固相抗体，可与样品中猪细小病毒(PPV)相结合，经洗涤除去未结合的抗原和其他成分后再与HRP标记的猪细小病毒(PPV)抗体结合，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。
TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。
用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），与CUTOFF值相比较，从而判定标本中猪细小病毒(PPV)的存在与否。
试剂盒组成：试剂盒组成48孔配置96孔配置保存说明书1份1份封板膜2片（48）2片（96）密封袋1个1个酶标包被板1×481×962-8℃保存阴性对照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存阳性对照0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存酶标试剂3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存样品稀释液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂A液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存显色剂B液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存终止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存浓缩洗涤液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶2-8℃保存样本处理及要求：1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。
猪圆环病毒 PCR 检测试剂盒 说明书
猪圆环病毒PCR检测试剂盒用途猪圆环病毒（PCV）的聚合酶链反应（PCR）试验用于检测猪血清和组织中的PCV，适用于PCV 的检测、诊断和流行病学调查。
原理提取病料DNA作为模板，高温使模板的一条双链DNA变性后形成两条单链，低温使引物与互补的模板形成双链，中温时，在TaqDNA聚合酶作用下，以dNTP为原料，以引物为复制的起点，沿模板合成一条新链。
每个循环包括：高温变性、低温退火、适温延伸三个过程。
每一次循环使扩增的DNA 片段拷贝数放大一倍。
经过35次循环，使扩增的DNA片段放大了数百万倍。
将扩增产物进行电泳，经染色后，在紫外灯照射下，肉眼可见到DNA片段的扩增带。
试剂1. 试剂盒组成名称10头份50头份0.2 mL薄壁PCR管 15个 60个PCV-1阳性对照350 µL 1 mLPCV-2阳性对照350 µL 1 mLA液：消化液 6 mL 30 mLB液：蛋白酶K 110 µL 600 µLC液：酚/氯仿/异戊醇混合液7 mL 34 mLD液：异丙醇 6 mL 30 mLE液：70％乙醇12 mL 60 mLF液：灭菌去离子水650 µL 2 mLJ液：PCR反应液200 µL 1 mLK液：Taq DNA聚合酶25 µL 120 µLL液：矿物油300 µL 1.2 mLM液：50倍TAE电泳缓冲液（50倍稀释后使用）20 mL 100 mLO液：上样缓冲液50 µL 250 µL染色液20 µL 50 µL2. 贮藏条件：塑料袋内红盖试剂（阳性对照、B、E、J、K液）-20 ℃冻存。
其他室温保存。
3. 试剂盒保存期：6个月需要自备的器材1．仪器：分析天平、水浴锅、台式高速离心机、真空干燥器、PCR扩增仪、电泳仪、电泳槽、紫外凝胶成像仪（或紫外分析仪）、液氮或-70 ℃冰箱、微波炉、组织研磨器、-20 ℃冰箱、可调移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。
pCL-Ampho逆病毒载体使用说明
pCL-Ampho 载体简介： 逆病毒包装载体 pCL-Ampho 的使用方法——逆病毒包装与转染方法 293T Growth Medium: 450 ml DMEM (JRH Biosciences) 50 ml FBS (JRH Sciences) 5 ml Glutamine (200 mM in saline, JRH Sciences) 2.5 ml Gentamycin(10 mg/ml in water, Sigma) HC11 Growth Medium: 5 ml L-Glutamine (200 mM in saline, JRH Sciences) 2.5 ml Bovine Insulin (1 mg/ml in 0.01 N HCL, Sigma) 2.5 ml Gentamycin (10 mg/ml in water, Sigma) 0.5 ml EGF (10 μg/ml in water, Gibco) 50 ml FBS (JRH Sciences) 440 ml RPMI (JRH Scieቤተ መጻሕፍቲ ባይዱces) Day 0: Split 293T cells for transfection: Wash cells off plate with 10 ml Hanks and put into 15 ml Falcon tube Add 1 ml 10X trypsin and mix by inversion for about 1-2 minutes Spin at 1000 rpm in clinical centrifuge for 1-2 minutes Resuspend cells in 10 ml growth medium Count cells Plate cells at 1X106 cells per 100 mm dish Day 2: Transfect 293T cells:
非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒(一步法)说明书和内包装标签(2022版)
非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（一步法）说明书和内包装标签（一）非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（一步法）说明书【兽药名称】通用名非洲猪瘟病毒荧光PCR检测试剂盒（一步法）商品名无英文名African Swine Fever Virus Real - time PCR Test Kit （One - step）汉语拼音Feizhouzhuwenbingdu Yingguang PCR Jiance Shijihe （Yibufa）【主要成分与含量】编号试剂盒组分装量用法ASFV01 -qf50缓冲液Bl5ml/瓶直接使用ASFV 02 - qf50缓冲液B25ml/瓶直接使用ASFV 03 - qf50PCR反应液900叱管直接使用ASFV 04 - qf50阳性对照1ml /管直接使用ASFV 05 - qf50阴性对照1ml /管直接使用【作用与用途】用于全血、血清、血浆、淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体和肌肉等样品中的非洲猪瘟病毒核酸的检测。
【用法与判定】1用法1.1样品处理1.1.1全血、血清、血浆直接进行下一步试验。
淋巴结、脾脏、肾脏、扁桃体、肌肉等组织样品取0.1〜0.2g,置研钵充分研磨，加入10倍体积约1〜2ml生理盐水，混匀；或置研磨管中，加入10倍体积约1〜2ml生理盐水及研磨珠，用组织研磨仪匀浆。
以5000转/分钟离心5分钟，留上清，即为组织匀浆液。
1.1.2取1.5ml离心管加入100川缓冲液B1,每管分别加入10可全血（EDTA抗凝剂）或20m组织匀浆液、血清、血浆样品、阳性对照和阴性对照混匀。
室温3分钟内涡旋混匀3〜5次。
1.1.3每管加入100W缓冲液B2,涡旋混匀，12000转/分钟离心1分钟，上清为待检核酸。
1.2扩增试剂准备取18WPCR反应液至PCR反应管；依次分别加入2囚阴性对照、样品和阳性对照待检核酸，盖紧管盖，每个反应管内反应体积为20N。
1.3将PCR反应管瞬时离心，置荧光PCR仪内，进行如下反应：1） 95℃预变性20秒；2）95c变性10秒，58c延伸20秒，共40个循环；设置58c收集FAM 荧光信号。
猪细小病毒基因工程亚单位疫苗免疫程序制定
猪细小病毒基因工程亚单位疫苗丁国伟，李甜甜，徐 萍，潘 晨，王设市，魏荣荣，荣雪路，范 娟(扬州优邦生物药品有限公司，江苏 扬州 225008)猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)属于细小病毒科细小病毒属，病毒粒子为二十面体等轴对称，有2～3个衣壳蛋白，32个壳粒，呈圆形，无囊膜，直径18～26 nm；病毒核酸为单股DNA，大小为5 kb。
PPV 具有血凝特性，可凝集豚鼠、小鼠、人、猴和鸡的红细胞。
PPV 只有一个血清型，目前已经有许多PPV 分离株，按照其致病性和组织嗜性可分为5个类型[1]，包括弱毒株、强毒株、皮炎型、肠炎型和呼吸道型。
其中，PPV 弱毒株(如PPV NADL-2株)为非致病性毒株，怀孕母猪感染后不能通过胎盘感染胎儿[2]。
PPV 强毒株(如PPV NADL-8株)可引起感染母猪发生病毒血症，并能穿过胎盘屏障，使胎儿致病或致死[2-4]。
PPV 皮炎型毒株(如 PPV Kresse 株)能引起皮炎，且使免疫不完全的胎儿致死，具有高致病性[5-6]。
猪细小病毒具有稳定的结构，能抗乙醚、氯仿等脂溶剂，对酸、碱抵抗力强，对高温不敏感，是一种极难消毒处理的病毒。
猪细小病毒病是由PPV 引起的一种母猪繁殖障碍(reproductive disorder)病，发病母猪常表现为怀孕母猪发生流产、死产、胚胎死亡和胎儿木乃伊化，而母猪本身并不表现临床症状，其他猪感染后也无明显的临床症状[7]。
本病一般呈地方性流行或散发，有时也呈大面积暴发，多见于猪群初次感染，即初产母猪临床症状明显。
自1966年发现第1例猪细小病毒病以来，截止到1995底，据不完全统计，世界上47个国家相继报道过此病，这些国家遍布世界，由此可以推测PPV 可能普遍存在于世界上各国家，只是发现早晚的问题。
1983年，我国首次在上海分离到PPV 后，相继在四川、黑龙江、天津、湖北等地也分离到该病毒。
本病常见于初产母猪，其流行具有以下几个特点：⑴混合感染。
非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒风途说明书
非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒说明书【兽药名称】通用名称：非洲猪瘟病毒荧光PCR核酸检测试剂盒汉语拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe英文名称：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit 商品名称：无【用法与判定】1 用法1.1待检样品釆集、保存及运输1.1.1样品釆集（1）活猪样品无菌采集抗凝血或血清5mL（2）病死猪剖检样品或屠宰场剖检样品无菌采集死猪的牌、肺、肾、扁桃体、淋巴结、肌肉等组织样品。
2〜8°C低温运至实验室用于检测。
（3）病猪污染的周边环境采集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品。
2〜8°C低温运至实验室用于检测。
1.1.2样品保存采集的样品在2〜8°C保存应不超过24小时，-70°C条件下保存，避免反复冻融。
1.1.3样品运输泡沫箱加冰袋后密封进行运输。
包装和运输应符合农业农村部《高致病性动物病原微生物菌（毒）种或者样品运输包装规范》和交通运输部门关于危险品运输管理的有关规定。
1.2样品处理1.2.1血液样品处理抗凝血样品置于离心管中，8000 r/min离心2分钟取上层血浆，编号待检。
非抗凝血样品置于离心管中，待凝固后，8000 r/min离心2分钟取200μL上层血清，编号待检。
1.2.2组织样品处理取适量脾脏、肝脏、淋巴结、扁桃体、肌肉等组织，置于研磨器或研磨管中研磨，再加适量生理盐水混匀，制成约10%的组织匀浆，8000 r/min离心2分钟，取200μL上清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。
1.2.3环境样品处理1.2.3.1粪便、饲料样品处理方法取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中研磨混匀，制成约10%的匀浆液.8000 r/min离心2分钟，取200μL上清于RNase/DNase-free无菌离心管中，编号备用。
逆病毒感染
逆转录病毒载体简介逆转录病毒载体介导DNA转染技术逆转录病毒载体属RNA病毒，但可在受染细胞内逆转录产生DNA互补链，此DNA单链可作为模板合成第二条DNA链，第二条DNA链可掺入细胞基因组DNA中。
此病毒可利用宿主细胞的酶自行转录与复制，RNA可合成蛋白，再包装病毒，RNA 从胞内释放，成为感染性病毒，该载体可经不同方式改变。
介导过程可使病毒单拷贝基因组稳定地进入细胞。
首先，逆转录病毒的繁殖必须要有适当的包装细胞系，以利于产生高滴度的病毒，同时还具有适当的结构。
如：ψ2（第一代包装细胞），PA317（第二代包装细胞），ψ1-CRIP、PG13、DA、CFA（第三代包装细胞），包装细胞可提供逆转录病毒gag、pol和env蛋白才能使带有包装信号及目的基因的病毒载体RNA进行包装，包装细胞只提供gag、pol和env蛋白而不产生具有复制能力的野生型病毒（RCR），而第一代包装细胞可产生RCR，安全性较差；第二代包装细胞，临床上已广泛应用，也未发现产生RCR，安全性好；第三代包装细胞更加安全，第三代包装细胞中主要区别是病毒结构基因中env不同。
逆转录病毒作为基因转移的载体有如下特点：(1) 逆转录病毒感染细胞的效率高，基因转移率在10%-100%；(2) 病毒基因转移能将外源基因整合到宿主细胞基因组中外源基因能稳定存在而不丢失；(3) 外源基因整合的拷贝数一般只有一个；(4) 逆转录病毒只选择感染分裂细胞；(5) 病毒可容纳外源基因的DNA长度为<8Kb。
逆转录病毒载体的结构：已切除了病毒的结构基因gag，大部分pol和env，包括两侧的LTR，被选择（标记）基因和目的基因插入的多聚位点所取代，同时还带有包装信号ψ。
可产生特异性逆转录病毒细胞系的建立逆转录病毒载体介导DNA转染技术(一) 逆转录病毒载体进入包装细胞系从细胞质粒中产生感染性病毒包括将质粒导入包装细胞系，可从稳定感染细胞中选择病毒产生细胞或用一个包装细胞系暂时产生的病毒感染另一种有不同包装的细胞系，从中选择病毒的产生细胞。
小反刍兽疫病毒(PPRV) 核酸扩增检测试剂盒说明书
小反刍兽疫病毒(PPRV)核酸扩增检测试剂盒说明书【名称】中文名：小反刍兽疫病毒(PPRV)核酸检测试剂盒英文名：Peste des Petits Ruminants Virus Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction(PCR)Diagnostic Kit汉语拼音:xiao fan chu shou yi bing du he suan jian ce shi ji he【目的】本试剂盒适用于检测动物肺、淋巴结、血清等标本中小反刍兽疫病毒(PPRV)mRNA，适用于小反刍兽疫病毒感染的辅助诊断。
其检测结果仅供参考。
【原理】本试剂盒用一对小反刍兽疫病毒特异性引物，Trizol提取RNA，经逆转录酶作用将RNA转录成cDNA，后者在Taq酶作用下，配以SD-Buffer(内含Mg2+、Tris-HCl等)、四种核苷酸单体（dNTPs）等成分，用RT-PCR体外扩增法对小反刍兽疫病毒RNA进行扩增，产物经凝胶电泳，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯观察，从而达到快速检测之目的。
【组成】名称数量规格PPRV RT MIX2管140μl/管逆转录酶系1管40μl/管PPRV-PCR反应管40管50μl/管PPRV阳性质控品1管50μl/管阴性质控品1管250μl/管DEPC水1管2000μl/管备注:Trizol等另行配备【标本采集】1.适用标本类型：动物肺、淋巴结、血清或其他组织等2.标本采集动物肺、淋巴结：无菌条件下取动物肺、淋巴结或其他组织等100mg左右，置入1.5ml洁净EP管，立即送检。
血清：用一次性无菌注射器抽取受检动物耳静脉或者前腔静脉静脉血2-5ml，静置斜放待血清析出，1,0000rpm离心3分钟，可取上清立即用于测试；或吸取上部血清(约200µl)转入无菌1.5ml Eppendoff管，保存待检。
【保存和运输】上述标本短期内可保存于-20℃，长期保存可置-70℃。
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pMSCV-PIGpMSCV-PIG 逆病毒载体基本信息：载体名称: pMSCV-PIG或 pMSCVPIG 、pMSCV PIG 质粒类型: 逆病毒载体；哺乳动物细胞载体 高拷贝/低拷贝: 高拷贝插入位点: 限制性内切酶，多克隆位点启动子:MSCV 载体大小:7658 bp 5' 测序引物及序列:pBABE 5': CTTTATCCAGCCCTCAC 3' 测序引物及序列:EGFP-N: CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG 载体标签:-- 载体抗性: 氨苄青霉素筛选标记: Puromycin 、EGFP克隆菌株:DH5alpha 宿主细胞（系）: 哺乳动物细胞备注:-- 稳定性: 稳表达组成型/诱导型: 组成型病毒/非病毒: 逆病毒pMSCV-PIG 载体质粒图谱和多克隆位点信息：pMSCV-PIG载体序列：ORIGIN1 TGAAAGACCC CACCTGTAGG TTTGGCAAGC TAGCTTAAGT AACGCCATTT TGCAAGGCAT61 GGAAAATACA TAACTGAGAA TAGAGAAGTT CAGATCAAGG TTAGGAACAG AGAGACAGCA 121 GAATATGGGC CAAACAGGAT ATCTGTGGTA AGCAGTTCCT GCCCCGGCTC AGGGCCAAGA 181 ACAGATGGTC CCCAGATGCG GTCCCGCCCT CAGCAGTTTC TAGAGAACCA TCAGATGTTT 241 CCAGGGTGCC CCAAGGACCT GAAATGACCC TGTGCCTTAT TTGAACTAAC CAATCAGTTC 301 GCTTCTCGCT TCTGTTCGCG CGCTTCTGCT CCCCGAGCTC AATAAAAGAG CCCACAACCC 361 CTCACTCGGC GCGCCAGTCC TCCGATAGAC TGCGTCGCCC GGGTACCCGT ATTCCCAATA 421 AAGCCTCTTG CTGTTTGCAT CCGAATCGTG GACTCGCTGA TCCTTGGGAG GGTCTCCTCA 481 GATTGATTGA CTGCCCACCT CGGGGGTCTT TCATTTGGAG GTTCCACCGA GATTTGGAGA 541 CCCCTGCCCA GGGACCACCG ACCCCCCCGC CGGGAGGTAA GCTGGCCAGC GGTCGTTTCG 601 TGTCTGTCTC TGTCTTTGTG CGTGTTTGTG CCGGCATCTA ATGTTTGCGC CTGCGTCTGT661 ACTAGTTAGC TAACTAGCTC TGTATCTGGC GGACCCGTGG TGGAACTGAC GAGTTCTGAA 721 CACCCGGCCG CAACCCTGGG AGACGTCCCA GGGACTTTGG GGGCCGTTTT TGTGGCCCGA 781 CCTGAGGAAG GGAGTCGATG TGGAATCCGA CCCCGTCAGG ATATGTGGTT CTGGTAGGAG 841 ACGAGAACCT AAAACAGTTC CCGCCTCCGT CTGAATTTTT GCTTTCGGTT TGGAACCGAA 901 GCCGCGCGTC TTGTCTGCTG CAGCGCTGCA GCATCGTTCT GTGTTGTCTC TGTCTGACTG 961 TGTTTCTGTA TTTGTCTGAA AATTAGGGCC AGACTGTTAC CACTCCCTTA AGTTTGACCT 1021 TAGGTCACTG GAAAGATGTC GAGCGGATCG CTCACAACCA GTCGGTAGAT GTCAAGAAGA 1081 GACGTTGGGT TACCTTCTGC TCTGCAGAAT GGCCAACCTT TAACGTCGGA TGGCCGCGAG 1141 ACGGCACCTT TAACCGAGAC CTCATCACCC AGGTTAAGAT CAAGGTCTTT TCACCTGGCC 1201 CGCATGGACA CCCAGACCAG GTCCCCTACA TCGTGACCTG GGAAGCCTTG GCTTTTGACC 1261 CCCCTCCCTG GGTCAAGCCC TTTGTACACC CTAAGCCTCC GCCTCCTCTT CCTCCATCCG 1321 CCCCGTCTCT CCCCCTTGAA CCTCCTCGTT CGACCCCGCC TCGATCCTCC CTTTATCCAG 1381 CCCTCACTCC TTCTCTAGGC GCCGGAATTA GATCTCTCGA GGTTAACGAA TTCTACCGGG 1441 TAGGGGAGGC GCTTTTCCCA AGGCAGTCTG GAGCATGCGC TTTAGCAGCC CCGCTGGGCA 1501 CTTGGCGCTA CACAAGTGGC CTCTGGCCTC GCACACATTC CACATCCACC GGTAGGCGCC 1561 AACCGGCTCC GTTCTTTGGT GGCCCCTTCG CGCCACCTTC TACTCCTCCC CTAGTCAGGA 1621 AGTTCCCCCC CGCCCCGCAG CTCGCGTCGT GCAGGACGTG ACAAATGGAA GTAGCACGTC 1681 TCACTAGTCT CGTGCAGATG GACAGCACCG CTGAGCAATG GAAGCGGGTA GGCCTTTGGG 1741 GCAGCGGCCA ATAGCAGCTT TGCTCCTTCG CTTTCTGGGC TCAGAGGCTG GGAAGGGGTG 1801 GGTCCGGGGG CGGGCTCAGG GGCGGGCTCA GGGGCGGGGC GGGCGCCCGA AGGTCCTCCG 1861 GAGGCCCGGC ATTCTGCACG CTTCAAAAGC GCACGTCTGC CGCGCTGTTC TCCTCTTCCT 1921 CATCTCCGGG CCTTTCGACC TGCAGCCCAA GCTTACCATG ACCGAGTACA AGCCCACGGT 1981 GCGCCTCGCC ACCCGCGACG ACGTCCCCAG GGCCGTACGC ACCCTCGCCG CCGCGTTCGC 2041 CGACTACCCC GCCACGCGCC ACACCGTCGA TCCGGACCGC CACATCGAGC GGGTCACCGA 2101 GCTGCAAGAA CTCTTCCTCA CGCGCGTCGG GCTCGACATC GGCAAGGTGT GGGTCGCGGA 2161 CGACGGCGCC GCGGTGGCGG TCTGGACCAC GCCGGAGAGC GTCGAAGCGG GGGCGGTGTT 2221 CGCCGAGATC GGCCCGCGCA TGGCCGAGTT GAGCGGTTCC CGGCTGGCCG CGCAGCAACA 2281 GATGGAAGGC CTCCTGGCGC CGCACCGGCC CAAGGAGCCC GCGTGGTTCC TGGCCACCGT 2341 CGGCGTCTCG CCCGACCACC AGGGCAAGGG TCTGGGCAGC GCCGTCGTGC TCCCCGGAGT 2401 GGAGGCGGCC GAGCGCGCCG GGGTGCCCGC CTTCCTGGAG ACCTCCGCGC CCCGCAACCT 2461 CCCCTTCTAC GAGCGGCTCG GCTTCACCGT CACCGCCGAC GTCGAGGTGC CCGAAGGACC2521 GCGCACCTGG TGCATGACCC GCAAGCCCGG TGCCTGACGC CCGCCCCACG ACCCGCAGCG 2581 CCCGACCGAA AGGAGCGCAC GACCCCATGC ATCCAATTCC GCCCCCCCCC CCTAACGTTA 2641 CTGGCCGAAG CCGCTTGGAA TAAGGCCGGT GTGCGTTTGT CTATATGTTA TTTTCCACCA 2701 TATTGCCGTC TTTTGGCAAT GTGAGGGCCC GGAAACCTGG CCCTGTCTTC TTGACGAGCA 2761 TTCCTAGGGG TCTTTCCCCT CTCGCCAAAG GAATGCAAGG TCTGTTGAAT GTCGTGAAGG 2821 AAGCAGTTCC TCTGGAAGCT TCTTGAAGAC AAACAACGTC TGTAGCGACC CTTTGCAGGC 2881 AGCGGAACCC CCCACCTGGC GACAGGTGCC TCTGCGGCCA AAAGCCACGT GTATAAGATA 2941 CACCTGCAAA GGCGGCACAA CCCCAGTGCC ACGTTGTGAG TTGGATAGTT GTGGAAAGAG 3001 TCAAATGGCT CTCCTCAAGC GTATTCAACA AGGGGCTGAA GGATGCCCAG AAGGTACCCC 3061 ATTGTATGGG ATCTGATCTG GGGCCTCGGT GCACATGCTT TACATGTGTT TAGTCGAGGT 3121 TAAAAAAACG TCTAGGCCCC CCGAACCACG GGGACGTGGT TTTCCTTTGA AAAACACGAT 3181 GATAATATGG CCACAACCAT GGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC 3241 ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC TGGCGAGGGC 3301 GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG 3361 CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC CTGACCTACG GCGTGCAGTG CTTCAGCCGC 3421 TACCCCGACC ACATGAAGCA GCACGACTTC TTCAAGTCCG CCATGCCCGA AGGCTACGTC 3481 CAGGAGCGCA CCATCTTCTT CAAGGACGAC GGCAACTACA AGACCCGCGC CGAGGTGAAG 3541 TTCGAGGGCG ACACCCTGGT GAACCGCATC GAGCTGAAGG GCATCGACTT CAAGGAGGAC 3601 GGCAACATCC TGGGGCACAA GCTGGAGTAC AACTACAACA GCCACAACGT CTATATCATG 3661 GCCGACAAGC AGAAGAACGG CATCAAGGCG AACTTCAAGA TCCGCCACAA CATCGAGGAC 3721 GGCAGCGTGC AGCTCGCCGA CCACTACCAG CAGAACACCC CCATCGGCGA CGGCCCCGTG 3781 CTGCTGCCCG ACAACCACTA CCTGAGCACC CAGTCCGCCC TGAGCAAAGA CCCCAACGAG 3841 AAGCGCGATC ACATGGTCCT GCTGGAGTTC GTGACCGCCG CCGGGATCAC TCTCGGCATG 3901 GACGAGCTGT 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