丹参酮_A对脑缺血再灌注损伤大鼠_省略_和MMP_9表达及细胞凋亡的影响_李浩

化学染色； 阴性对照片用 PBS 液代替一抗。磷酸化 p38MAPK 阳性反应为细胞浆呈现棕黄色粒状或点 状免疫标 记，MMP-9 阳 性 反 应 为 细 胞 浆 棕 黄 色 淡 染。于每个鼠脑分别取磷酸化 p38MAPK 和 MMP-9 切片，每张切片分别随机选取左侧大脑半球额顶部 皮质 5 个不重复高倍镜视野（ × 400） ，计数每个视 野阳性细胞数，算出平均数即为每张切片阳性细胞 数。
中风与神经疾病杂志 2013 年 3 月 第 30 卷 第 3 期
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文章编号： 1003-2754（ 2013） 03-0229-05
丹参酮 IIA 对脑缺血再灌注损伤大鼠磷酸化 p38MAPK 和 MMP- 9 表达及细胞凋亡的影响
李 浩， 张多斌， 吴 岚， 冯华坤
摘 要： 目的 探讨丹参酮ⅡA（ Tanshinone，Tan ⅡA） 对缺血再灌注（ IR） 损伤大鼠细胞凋亡和血脑屏障通
ⅡA 减少脑缺血再灌注后细胞凋亡，抑制 MMP-9 表达降低血脑屏障通透性，可能与抑制 p38MAPK 信号通路有关。
关键词： 缺血再灌注； 磷酸化 p38MAPK； MMP-9； 凋亡； 血脑屏障； 丹参酮ⅡA
中图分类号： R743． 3
文献标识码： A
Effects of Tanshinone ⅡA on expressions of phosphorylated p38MAPK and MMP-9 and neural cell apoptosis following cerebral ischemic reperfusion injury in rats LI Hao，ZHANG Duo-bin，WU Lan，et al． （ Department of Neurology，The Affiliated Hospital of Guilin Medical College，Guilin 541002，China）
Abstract： Objective To study effects of Tanshinone ⅡA （ TanⅡA） on neural cell apoptosis and the permeability of the blood-brain barrier following cerebral ischemia reperfusion （ IR） injury rats，and explore the releationship between theirs and p38 mitogen-activated protein kinase pathway． Methods 60 SD rats were randomly divided into four groups， which were sham operated group，IR group，low dose TanⅡA treated group and high dose Tan ⅡA treated group． The focal middle cerebral artery occlusion （ MCAO） model was made in rats with suture-occluded method． Low dose and high dose groups were pretreated with low and high does TanⅡA，for 3d，before MCAO． After 120min MCAO following 24h reperfusion，We investigated the expressions of phosphorylated p38MAPK and MMP-9 in using immunohistochemistry technique in the frontal and parietal cortex． Neural cell apoptosis was investigated with TUNEL． The contents of Evens blue （ EB） was also investigated． Results （ 1） Compared with sham operated group，phosphorylated p38MAPK and MMP-9 increased in IR group； Compared with IR group，high and low dose Tan ⅡA treated groups dose-dependently decreased expression of phosphorylated p38MAPK and MMP-9 （ P ＜ 0． 05） ； （ 2） Compared with sham operated group，cell apoptosis was distinctly increased in IR group； Compared with IR group，Compared with that of I / R group，low and high Tan ⅡA treated group dosedependently reduced neural cell apoptosis （ all P ＜ 0． 05） ． （ 3） Compared with sham operated group，the contents of EB increased at 24h of reperfusion． Compared with I / R group，low and high Tan ⅡA treated group dose-dependently reduced the contents of EB （ all P ＜ 0． 05） ． Conclusion Tan ⅡA may attenuate neural cell apoptosis and reducing the expression of MMP-9 to protects blood-brain barrier by inhibiting p38 mitogen-activated protein kinase pathway．
Key words： Ischemia-reperfusion； Phosphorylated p38MAPK； MMP-9； Apoptosis； Blood-brain barrier Tanshinone ⅡA
研究 表 明，脑 缺 血 再 灌 注 损 伤 发 生 后，细 胞 内 p38 MAPK 信号通路激活，参与了脑缺血神经元死 亡过程的调控［1］。脑组织中基质金属蛋白酶 9（ matrixme talloproteinase，MMP-9） 与缺血后血脑屏障损 伤密切相关［2］。丹参酮ⅡA（ Tanshinone ⅡA，TanⅡ A） 为丹参酮中含量最高的活性成分，我们前期研究 发现，TanⅡA 对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作
透性的影响及与 p38MAPK 通路的关系。方法 60 只大鼠随机分为假手术组（ Sham 组） 、缺血再灌注组（ IR 组） 、
Tan ⅡA 低剂量治疗组、Tan ⅡA 高剂量治疗组，线栓法建立局灶性脑缺血再灌注模型灌胃给予高、低剂量 Tan ⅡA 3d，每日 1 次。各组于脑缺血 120min 再灌注 24h，采用免疫组化法观察大鼠额
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J Apoplexy and Nervous Diseases，March 2013，Vol 30，No． 3
用，其 机 制 与 抑 制 炎 症 和 凋 亡 基 因 蛋 白 表 达 有 关［3 ～ 7］，但是否对神经细胞凋亡和血脑屏障有影响？ 本实验通过建立大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，研 究 Tan Ⅱ A 对 大 鼠 脑 缺 血 再 灌 注 损 伤 磷 酸 化 p38MAPK 和 MMP-9 表达的影响及对细胞凋亡的作 用，进一步探讨其保护作用的可能分子生物学机制。
顶部皮质磷酸化 p38MAPK 和 MMP-9 表达； TUNEL 法检测神经细胞凋亡，检测伊文斯蓝（ EB） 含量变化。结果
（ 1） 与 Sham 组相比，IR 组磷酸化 p38MAPK 和 MMP-9 明显升高（ P ＜ 0． 05） ； 与 IR 组比较，Tan ⅡA 高、低剂量治疗
组磷酸化 p38MAPK 和 MMP-9 表达均降低，且高 Tan ⅡA 组明显低于低 Tan ⅡA 组（ P 均 ＜ 0． 05） ； （ 2） 与 Sham 组
相比，IR 组凋亡细胞明显增加； 与 IR 组比较，Tan ⅡA 高、低剂量治疗组凋亡细胞均减少，且高 Tan ⅡA 组明显低于
低 Tan ⅡA 组（ P 均 ＜ 0． 05） 。（ 3） 与 Sham 组比较，IR 组脑组织 EB 含量明显升高； 与 IR 组比较，Tan ⅡA 高、低剂
量治疗组脑组织 EB 含量明显降低（ P ＜ 0． 05） ，且高 Tan ⅡA 组明显低于低 Tan ⅡA 组（ P 均 ＜ 0． 05） 。结论 Tan
1 材料与方法 1． 1 材料 1． 1． 1 实验动物与分组 雄性 SD 大鼠，清洁 级，质量 300 ± 20g，桂林医学院 SPF 级动物实验中 心提供。随机分成 Sham 组、IR 组、TanⅡA 高、低剂 量治疗组，每组 15 只。 1． 1． 2 药品和试剂 TanⅡA（ 陕西昂盛生物 医药科技有限公司提供，纯度 98% ） ； 2，3，5-三苯基 氯化四 氮 唑 （ TTC） （ Sigma 公 司） ； 兔 抗 MMP-9 抗 体，兔抗 p38 多克隆抗体、SABC 免疫组化试剂盒、T UNEL 试剂盒和 DAB 显色试剂盒均由武汉博士德 生物工程有限公司提供。 1． 2 方法 1． 2． 1 给药途径与药量 TanⅡA 低剂量治疗 组（ 15mg / kg） 和高剂量治疗组（ 30mg / kg） 均于术前 连续灌胃给药 3d，每天 1 次； 假手术组和缺血再灌 注组给予等量的生理盐水灌胃。3d 给药后 1h 建立 局灶性脑缺血 120min 再灌注 24h 动物模型。 1． 2． 2 动物模型的建立及评分 参照 Longa 等［8］的方 法 制 备 大 鼠 局 灶 性 脑 缺 血 再 灌 注 模 型。 采用颈外动脉插入线栓法，各组均进行左侧大脑中 动 脉 栓 塞，线 栓 采 用 石 蜡 线 栓。 线 栓 直 径 约 0． 27mm，插入深度约 18mm，此时线栓头位于大脑 中动脉起始部。缺血 90min 时，抽提线栓实现再灌 注。神经功能缺陷评分： 按照 Longa 等［8］评分标准， 各组分别在再灌注 24h 进行评分。0 分： 正常，无神 经学征象； 1 分： 动物不能完全神展右前肢； 2 分： 动 物右侧肢体 瘫 痪，行 走 时 向 右 侧 转 圈，出 现 追 尾 现 象； 3 分： 动物行走向右侧跌倒，或动物不能站立或 动物打滚； 4 分： 无自发活动，有意识障碍。神经功 能缺陷评分在 1 ～ 3 分为模型成功。0 分和 4 分为 模型不成功予剔除，在后续实验中补充剔除出组的 动物，保证每组动物数。 1． 2． 3 免疫组化检测 缺血再灌注后 24h，各 组随机取 5 只大鼠，生理盐水和多聚甲醛进行心脏 灌流固定，断头取脑。在左侧大脑半球距离嗅球尖 端 7 ～ 11mm 之间冠状切取约 5mm 厚脑组织块，固 定、脱水、包埋成腊块，连续切片，厚 5μm。用 SABC 法进行磷酸化 p38MAPK 和 MMP-9 蛋白的免疫组织