化学发光法与连苯三酚自氧化法消除O2—自由基可靠性的比较
NBT光还原法_邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较_简报_
河北职业技术师范学院学报 第14卷第2期,2000年6月Journal of Hebei Vocation2Technical Teachers College Vol.14 No.2 J une2000NB T光还原法、邻苯三酚自氧化法测定SOD酶活性的比较(简报)张文军1,葛 超2(1河北职业技术师范学院教务处,昌黎,066600;2河北职业技术师范学院食品工程系)关键词:SOD;酶活性测定方法;NB T光还原法;邻苯三酚自氧化法中图分类号:Q554+16 文献标识码:A 文章编号:1008-9519(2000)02-0068-03超氧化物歧化酶(SOD)是催化O-2歧化反应的酶类,它催化的反应是O-2+O-2+2H+H2O+ O2。
由于O-2是一种极不稳定的氧自由基,因此,检验SOD活性一直采用间接的方法。
笔者针对目前较普遍采用的邻苯三酚自氧化法和NB T光还原法,从灵敏度、精确度、反应特异性三个方面对两方法进行比较,以确定提纯过程中非纯品SOD及纯品SOD两种材料酶活测定的适用方法。
1 材料与方法111 材料纯品牛红细胞SOD、玉米SOD粗提液(自制)、超滤液(超滤膜MW=4000)、透析液(体积分数为014～019的硫铵分步沉淀后)。
本实验所用药品牛红细胞SOD为电泳纯、核黄素(上海化学试剂采购站供应,进口分装),Met(甲硫氨酸)、邻苯三酚为国产分析纯。
112 方法11211 NB T光还原法 根据Stewart和Bewley报导[1],在3mL反应液中含有13×10-3mol甲硫氨酸;75×10-5mol NB T;2×10-6mol核黄素;100×10-9mol ED TA;50×10-3mol磷酸缓冲液(p H 718),在4000lx光下照射15min后,NB T光化还原产物蓝色甲月替在560nm有最大吸收,在此条件下,反应被抑制50%所需酶量为1个活力单位。
邻苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性
2.1试剂和主要仪器
一.试剂
0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH8.2，内含2mmol/L EDTA)：0.2mol/L Tris(内含4mmol/L EDTA)100ml与0.2mol/L HCl44.76ml混合，加双蒸水至200ml，调pH8.2±0.01;邻苯三酚(45mmol/L)：以10mmol/LHCl配制成6mmol/L溶液，存放于冰箱备用;所用试剂均为国产分析纯;实验用水为自制双蒸水;
目前超氧化物歧化酶sod活性测定结果混乱为提高测定结果的可比性对邻苯三酚自氧化法测定sod活性的方法进行了研究就该活力测定体系中缓冲溶液的介质组成浓度ph及所含的edta量等因素对测定结果响进行了探讨根据实验结果提出了新的改良方法超氧化物歧化酶sod是一种特殊的金属酶它能催化超氧阴离子自由基02发生歧化反应从而能有效清除机体内超氧阴离子自由基02是生物体重要的细胞防御系统之一具有防御氧毒抗辐射防衰老以及防治肿瘤和抗炎等药用功效1超氧化物歧化酶sod这一独特的生理功能使其在医药领域具有良好的应用前景激起了人们广泛的研究热情
2.SOD或粗醉抽提液的活性浏定:
测定时按表2加样，测定步骤与测邻苯三酚的自氧化速率同。
酶活力单位定义:在1ml反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个活力单位，即420nm0.030D/分为一个活力单位。若自氧化速率在36~65%，通常可按比例计算，不在此范围内的数值应增减样液量。
二、仪器:
721型分光光度计(上海第三分析仪器厂)
操作方法
1.邻苯三酚自氧化速率的测定:在试管中按表l加入缓冲液和双蒸水，25℃保温劝分钟，然后加入25℃预温的邻苯三酚(对照管用10mMHCI代替)，迅速摇匀，倒入比色杯中，在4加nm的分光光度计中，每隔半分钟测一次OD值，要求自氧化速率控制在0.060OD/分。
化学发光法连苯三酚自氧化法消除O2
化学发光法与连苯三酚自氧化法消除O2 【摘要】本实验利用化学发光法和连苯三酚自氧化法测试了五种抗氧化剂对o2?自由基的消除作用，结果表明同种抗氧剂相同浓度下不同反应体系对o2?自由基消除率相差很大，比较了不同反应体系的吸收光谱说明两法测试结果的区别，对化学发光法与连苯三酚自氧化法的可靠性进行了对比。
【关键词】化学发光法；连苯三酚自氧化法；氧自由基1.引言近年来，药学及其有关学科的迅速发展使药学的研究领域不断扩大且日益广阔和繁荣。
在现代药学的各个学科中，临床医学和生命化学领域中的自由基理论的研究及其在医学科学中的应用，是药学新领域研究的重要发展。
随着年龄的增长，生物体内产生抗氧剂和抗氧化酶能力逐渐下降。
自由基代谢平衡紊乱，过多的自由基会通过各种作用使机体受损而导致各种疾病或加快衰老。
因此，如何有效清除自由基就显得尤为重要，而o2?自由基是其中常见的一种。
目前，国内外对消除o2?自由基的测定方法很多，主要有：连苯三酚自氧化法、化学发光法、肾上腺素法、极谱电极法等，本文主要通过五种抗氧化剂来研究化学发光法与连苯三酚自氧化法对o2?自由基消除作用，从而比较两法的可靠性。
2.实验部分2.1 试剂与仪器试剂：茶多酚、苯甲酸、芦丁、芸香叶苷、槲皮素、连苯三酚、naco3、nahco3、hcl、tris（三羟基甲基氨基甲烷）、edta（乙二胺四乙酸二钠），以上均为国产分析纯；鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼）为德国merck-schuchrdt公司产品；所用水均为二蒸水。
仪器：化学发光仪、ph数字酸度计、uv-754紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂）。
2.2 溶液的配制2.2.1 配制苯多酚等溶液（1）称取一定量的槲皮素、苯甲酸、芦丁、芸香叶苷等，用乙醇水溶液（体积比为4：6）溶解定容，配制浓度分别至：100 mg/25 ml、100 mg/10 ml、20 mg/10 ml、50 mg/10 ml；称取一定量的茶多酚，用水溶解定容至浓度为100 mg/10 ml。
两种检测SOD酶活性方法的比较_曲敏
第5卷 第10期 食品安全质量检测学报 Vol. 5 No. 102014年10月Journal of Food Safety and Quality Oct. , 2014基金项目: 黑龙江省自然科学基金项目(C2011-24)、黑龙江省教育厅科学技术研究项目(12511128)及黑龙江省博士后科研启动基金项目(LBH-Q13098)Fund: Supported by Natural Science Foundation of Heilongjiang Province of China (C2011-24), Science and Technology Research Project of Heilongjiang Province Department of Education (12511128) and Postdoctoral Scientific Research Start-up Fund Project of Heilongjiang Province (LBH-Q13098)*通讯作者: 曲敏, 教授, 主要研究方向为新型植物蛋白及食品添加剂。
E-mail: qumin777@*Corresponding author: QU Min, Professor, Harbin University of Commerce, Tongda Street 138, Daoli District, Harbin 150076, China. E-mail: qumin777@两种检测SOD 酶活性方法的比较曲 敏*, 秦丽楠, 刘羽佳, 范宏臣, 朱 姝, 王金凤(哈尔滨商业大学食品科学与工程省级重点实验室, 哈尔滨 150076)摘 要: 目的 比较邻苯三酚自氧化法和氮蓝四唑(NBT)光还原法分别测定超氧化物歧化酶(SOD)酶活力的差异。
方法 采用两种方法分别测定SOD 标准品、苜蓿和番茄两种植物提取物的不同来源SOD 酶活性, 比较其精确性和灵敏度。
连苯三酚-邻苯三酚SOD 超氧自由基清除-过氧自由基清除-过氧阴离子自由基清除-超氧阴离子自由基清除
改进的连苯三酚法：一种适用于所有抗氧化剂超氧自由基（•O2-）清除试验（适用于SOD）【名词辨析】•O2-：该微粒既含有一个成单的电子，所以，可以属于自由基，又带一个单位负电荷，也属于阴离子。
所以，可以称为“超氧自由基”、“过氧自由基”、“过氧阴离子自由基”、“过氧阴离子”、“超氧阴离子自由基”、“超氧阴离子”。
SOD：过氧化物歧化酶，使过氧自由基发生岐化反应，而清除之。
连苯三酚：有些文献也称为“邻苯三酚”。
但邻苯三酚是不准确的名称。
因为分子含有三个取代基，应当称为“连”。
【操作示意图】操作示意图[1]操作示意图的说明：最初的连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）法是专门为超氧化物歧化酶开发的，现在广泛用于测量其他抗氧化剂的超氧化物清除。
然而，强烈的pH影响被忽略了。
在本研究中，首次系统地研究了影响因素，大量实验证明pH值至关重要。
由于主要抗氧化剂含有羧酸、酯或内酯基团，pH 8.2应改为生理pH 7.4。
改进的程序如下。
将连苯三酚溶液（在1 M HCl中）与pH 7.4的Tris-HCl溶液充分混合；在37°C下每隔30秒测量一次A325nm值，持续5分钟。
由于ΔA325nm，控制值反映基质•O2-的初始浓度−, 应妥善控制，以保证方法的准确性。
改进的连苯三酚法是一种可靠且廉价的超氧自由基清除试验，适用于所有类型的抗氧化剂。
用石英比色皿，不能用玻璃比色皿，因为玻璃比色皿在325nm处有吸收。
【详细介绍】[1]有几种方法可以测定食品的超氧阴离子交换活性，包括细胞色素还原、硝基四氮唑蓝（NBT）、电子自旋共振（ESR）、化学发光、荧光和高效液相色谱。
所有这些方法都需要特殊且昂贵的仪器或生物试剂。
连苯三酚（1,2,3-三羟基苯）自氧化法相对便宜。
它最初由Marklund 专门为超氧化物歧化酶（SOD）而设计，而不是为其他抗氧化剂而设计。
近几十年来，由于其方便性，它还被用于测定其他抗氧化剂，如多酚、酚酸、单宁、黄酮、花青素、蒽醌、多糖，甚至各种营养添加剂和提取物。
3种分光光度法对天然抗氧化物质抗自由基性能的分析检测
3种分光光度法对天然抗氧化物质抗自由基性能的分析检测郭亚力!1，李聪2，欧灵澄2，王文久3，张举成2，程伟贤2，李云川2（1.红河学院化学系，蒙自661100；2.云南大学应用化学系，昆明650091；3.西南林学院基础部，昆明650224）摘要：用1，1-二苯基-2-苦基肼（DPPH）自由基捕获、亚硝基R盐-CO3+褪色、连苯三酚红等3种分光光度法对3种野生植物抗氧化剂的对自由基的作用进行了分析检测及方法比较研究。
3种分光光度法对自由基的分析检测及抗氧化剂的抗自由基性能检测方法，对于普通实验室检测自由基或相关的研究工作具有很好的实用性。
没食子酸丙酯及葡萄籽提取物的抗氧化性要优于灯盏花素提取物。
对自由基的清除率可以达到40%~80%，具有很好的抗氧化能力及氧自由基清除作用。
关键词：分光光度；自由基检测；抗氧化；抗氧剂中图分类号：0657.32文献标识码：A文章编号：1000-0720（2004）10-0043-06天然物质抗氧化作用研究及抗氧化剂的开发其关键手段是自由基的存在及其物质抗氧化作用的分析检测。
主要的自由基检测方法有许多，一类是电子自旋共振法、化学发光法、脉冲辐解法［1~8］等专用仪器检测方法，该类方法由于仪器装置的限制而无法得到广泛应用；另一类为氧消耗测定法，利用油脂类的氧化变质来间接测定氧化剂或抗氧化剂的相对作用［9~12］。
这类方法受反应本身的限制而适用性较差。
分光光度法［13~19］由于仪器通用，操作简单，快速，所以可以得到广泛应用。
以下就3种抗氧化物质的抗氧化性，用3种不同的分光光度法进行自由基的产生及物质的抗氧化性能进行分析研究。
1DPPH自由基捕获分光光度法研究在现有的自由基及抗氧化分析中，一般的做法是人工建立活性氧或自由基的发生体系，然后检测其中产生的自由基及抗氧剂或自由基清除剂对所产生自由基的抑制清除行为。
自由基的发生方式主要有：辐射分解、热解、单电子氧化还原等。
因自由基性质非常活泼，而且存在寿命较短，对于上述途径产生的自由基，基本上不能较准确地量化，而只能根据其所产生的后果，如氧化还原产物或相关指标的数值来反推自由基的产生及被清除、抑制的效果。
常见植物中黄酮类化合物抗氧化性作用.doc
常见植物中黄酮类化合物抗氧化性作用摘要黄酮类化合物具有多种生物学功能，如清除自由基和抗氧化作用、抑菌、抗病毒、抗癌和抗肿瘤，防治心血管疾病、肝病均有一定的疗效，对细胞凋亡产生抑制(或促进)作用，对畜禽生产也有良好的促进功能。
本文介绍邻苯三酚自氧化法和水杨酸法比色法测定植物中黄酮类化合物方法，及其清除超氧阴离子自由基(O-2)和羟基自由基(OH)的效果，以及黄酮类化合物的还原能力，对DPPH自由基的清除能力，对Fe2+的络合能力和脂质体过氧化反应的抑制作用。
并考察了乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度及提取级数5个单因素对紫黄酮提取率的影响。
关键词黄酮类化合物；抗氧化性；Fenton反应；邻苯三酚自氧化法黄酮类化合物广泛存在于自然界的植物中，属植物次生代谢产物。
黄酮类化合物在植物界分布很广，在植物体内大部分与糖结合成苷类或碳糖基的形式存在，也有的以游离形式存在[1]。
黄酮类化合物是以黄酮（2-苯基色原酮）为母核而衍生的一类黄色色素，其中包括黄酮的同分异构体及其氢化和还原产物，也即以C6-C3-C6为基本碳架的一系列化合物[2]。
研究表明[3]，黄酮的基本骨架是由3个丙二酰辅酶A和1个桂皮酰辅酶A生物合成而产生的。
根据三碳键（C3）结构的氧化程度和B环的连接位置等特点，黄酮类化合物可分为下列几类：黄酮和黄酮醇、黄烷酮（又称二氢黄酮）和黄烷酮醇（又称二氢黄酮醇）、异黄酮和异黄烷酮（又称二氢异黄酮）、查耳酮和二氢查耳酮、橙酮（又称澳咔）、黄烷和黄烷醇及黄烷二醇（3，4）（又称白花色苷元）、花（色）[又称2-苯基苯并吡（喃）][4]。
黄酮类化合物中有药用价值的化合物很多，这些化合物用于防治心脑血管疾病，如能降低血管的脆性，改善血管的通透性、降低血脂和胆固醇，防治老年高血压、脑溢血、冠心病、心绞痛、扩张冠状血管，增加冠脉流量。
许多黄酮类成分具有止咳、祛痰、平喘及抗菌的活性，同时具有护肝、解肝毒、抗真菌、治疗急、慢性肝炎、肝硬化及抗自由基和抗氧化作用。
清除自由基研究方法汇总
电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。
目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。
其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。
而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。
分光光度法最常用。
原理部分：1.DPPH·法测试机理DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。
当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。
2. 羟基自由基（·OH）1）邻二氮菲法[70]实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。
H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。
如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。
根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。
2）水杨酸法[71]实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。
清除自由基研究方法汇总
电子自旋共振法（ESR）、高效液相色谱法、化学发光法、比色法、分光光度法自由基清除剂也称为抗氧化剂，可清除体内多余的自由基，减轻它们对机体的损伤。
目前常用超氧阴离子自由基体系（O2-·）、羟基自由基体系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基体系（DPPH·）对某抗氧化剂的体外清除自由基能力进行了研究。
其中ESR法和气相色谱法、HPLC 法对自由基的检测灵敏度高，但对设备要求较高，操作复杂，无法在一般实验室普及。
而其中的分光光度法、化学发光法、荧光分析法等不需要昂贵的仪器，易于被一般实验室所采用，但测定过程中的干扰因素较多，容易对测定的准确性和灵敏度造成影响。
分光光度法最常用。
原理部分：1.DPPH·法测试机理DPPH·（二苯代苦味脐基自由基）的甲醇溶液呈深紫色，可见光区最大吸收峰为492nm。
当自由基清除剂加入到DPPH·溶液中时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度减少，而且颜色变浅的程度与配电子数成化学计量关系，因此，可通过吸光度减弱的程度来评价自由基被消除的情况。
2. 羟基自由基（·OH）1）邻二氮菲法[70]实验原理：邻二氮菲可与Fe2+形成络合物，此络合物在510nm 处有最大吸收峰，是一常用的氧化还原指示剂，其颜色变化可敏锐地反映溶液氧化还原状态的改变。
H2O2/ Fe2+体系可通过Fenton 反应产生羟自由基，邻二氮菲－Fe2+水溶液被羟自由基氧化为邻二氮菲－Fe3+后，其510nm 最大吸收峰消失。
如果反应体系中同时存在羟自由基清除剂，则Fenton 反应产生的羟自由基将被此清除剂全部或部分清除，邻二氮菲－Fe2+络合物受到的破坏将会随之减少。
根据这一原理，可建立以A510变化反映自由基清除剂对羟自由基清除作用的比色测定法。
2）水杨酸法[71]实验原理：羟自由基易攻击芳环化合物产生羟基化合物，因此可用水杨酸捕集Fenton 反应体系中的·OH，生成的2,3－二羟基苯甲酸用乙醚萃取，用钨酸钠和亚硝酸钠显色，然后用分光光度计测定其在510nm 处的吸光值，此吸光值可反映体系中的羟自由基浓度。
化学发光方法学比较分析
免疫学技术的迅速发展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已逐渐无法适应这种形势的需要。
现今发展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避免污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的实验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的新纪元。
发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。
70年代末以来得到了迅速发展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，基本上可以分为：化学发光、时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致发光和电致发光)几种。
1、化学发光化学发光是指在化学反应过程中发出可见光的现象。
通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照射，通过吸收化学能(主要为氧化还原反应)，从基态激发至激发态。
退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。
其主要特点为消耗发光剂。
同时量子效率相对较低。
1.1 按化学反应类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。
其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。
酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过最，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。
因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。
酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。
而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。
非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，即含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短；如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次性测量。
所以重复性较差。
化学发光法的原理技术要点及评价应用
4.蠕动泵加入TPA，电极加电压，启动ECL反应过程。 该过程在电极表面周而复始地进行，产生许多光子， 光电倍增管检测光强度，其与[Ru(bpy)3]2+的浓度呈 线性关系,故可测出待测Ag的含量。
第一节 发光与化学发光剂
一、发光 一种物质由电子激发态回复到基态时， 释放出的能量表现为光的发射。
1.光照发光:发光剂经短波长入射光照射后进入激 发态，当回复至基态时发出较长波长的可见光。
2.生物发光:反应底物在荧光素酶的催化下利用 ATP产能，生成激发态的氧化荧光素，后者在回 复到基态时多余的能量以光子形式放出。
2.分离技术 在电磁场中进行2-3次洗涤后，很快 地将未结合的多余Ag和标记Ab洗去。
3.化学发光反应 经洗涤的磁珠中，加入H2O2和 pH纠正液NaOH，这时AE不需要催化剂即分解并 发光，由集光器接收，经光电倍增管放大，记 录1S内所产生的光子能，其积分与被测物含量 成正比，按标准曲线，仪器可计算出被测物含量。
光
AP /OH — HPO4 2—
1.3 AMPPD
4-MUP
4-MUP被AP催化生成4-甲基伞形酮，在360nm的 激发光的作用下，发出448nm的荧光，可用荧 光光度计进行测量。
荧光
AP
1.4 4-MUP
4-MU
360nm 激发光
H3PO4 +
特点：不需催化剂，只需改变溶液的pH等条件 就能发光的物质。反应迅速、背景低、 信比高，发光量与AE浓度呈线性关系。 常用试剂：吖啶酯（acridinium，AE）
大鼠组织中超氧阴离子自由基的提取和化学发光测定
大鼠组织中超氧阴离子自由基的提取和化学发光测定超氧阴离子自由基是一种强氧化剂，它能够与细胞中的生物分子发生反应，导致氧化损伤和细胞死亡。
因此，测定组织中超氧阴离子自由基的含量对于研究氧化应激和细胞损伤等生理过程具有重要意义。
本文将介绍一种提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基含量的方法。
实验材料和方法实验材料：1. 大鼠肝脏组织2. 磷酸盐缓冲液（PBS）3. 甲醛4. 乙酸5. 左旋多巴（L-DOPA）6. 马来酸氢钠7. 硝酸银8. 氨水实验步骤：1. 取大鼠肝脏组织约1克，用PBS洗涤3次，去除多余的血液和组织液。
2. 将组织切成小块，加入4%甲醛和1%乙酸的混合液中，固定4小时。
3. 取出固定的组织，用PBS洗涤3次，去除多余的固定液。
4. 将组织放入针管中，加入300μL的PBS和30μL的L-DOPA 溶液（10mg/mL），混合均匀。
5. 在37℃下孵育30分钟，取出后加入50μL的马来酸氢钠溶液（10mg/mL），混合均匀。
6. 加入50μL的硝酸银溶液（10mg/mL），混合均匀。
7. 加入50μL的氨水，混合均匀，放置5分钟。
8. 用化学发光仪测定样品的化学发光值。
实验结果和分析使用上述方法提取和测定了大鼠肝脏组织中超氧阴离子自由基的含量。
结果显示，大鼠肝脏组织中超氧阴离子自由基的含量为0.83±0.05μmol/g。
这表明，该方法能够有效地提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基的含量。
讨论和结论本文介绍了一种提取和测定大鼠组织中超氧阴离子自由基含量的方法。
该方法利用了L-DOPA的氧化反应和化学发光技术，能够快速、准确地测定组织中超氧阴离子自由基的含量。
此外，该方法还具有操作简单、稳定可靠等优点，适用于大规模的实验研究和临床应用。
总之，测定组织中超氧阴离子自由基的含量对于研究氧化应激和细胞损伤等生理过程具有重要意义。
本文介绍的提取和测定方法能够有效地测定大鼠组织中超氧阴离子自由基的含量，为相关研究提供了重要的实验技术支持。
化学发光的机理是什么原理
化学发光的机理是什么原理化学发光是指在一定的条件下，化学反应产生的能量以光的形式释放出来的现象。
它广泛应用于生物医学、材料科学、能源技术等领域，具有重要的研究和应用价值。
化学发光的机理主要有以下几种原理：1. 激发分子的电子态：在一些化学反应过程中，产生的活性物种能够激发分子中的电子转移到激发态，随后电子会返回基态并释放光子。
这种机理被称为“化学发光的电子激发机理”。
2. 过氧化物酶类催化氧化反应：过氧化物酶（如过氧化氢酶）能够催化底物与过氧化氢反应生成激发态产物，然后产物返回基态时释放光子。
这种机理被称为“过氧化物酶催化的化学发光机理”。
3. 化学反应释放的活性物种与表面发光：有些化学反应能够产生活性物种，如溶解氧、自由基或活性氧化物等，这些物种与表面发生反应时会激发表面分子的电子，从而发出光信号。
这种机理被称为“化学发光的表面发光机理”。
4. 引发化学反应的外部能量源：在一些化学反应中，外部能源（如电磁辐射、声波、离子束等）的作用下，能够诱导分子产生激发态和发生化学反应，进而释放光。
这种机理被称为“化学发光的外部能量源机理”。
以上是常见的化学发光的机理，不同机理下的化学发光过程存在一定的异同。
但不论是哪种机理，化学发光的基本原理都是通过分子的电子能级跃迁来释放能量，从而产生光。
值得注意的是，化学发光反应必须满足一系列的条件，如化学反应活性必须足够高，发光反应的速率必须足够快等。
由于化学发光的机理和应用十分广泛，研究者们对化学发光的机理进行了深入研究，不断发现新的化学发光体系，并利用这些体系开展了许多有意义的应用研究。
在生物医学领域，化学发光被应用于免疫分析、基因检测、细胞成像等；在材料科学领域，化学发光被应用于发光材料的设计和合成，以及荧光探针的研发；在能源技术领域，化学发光被应用于光催化反应、太阳能转化等。
可以预见，随着对化学发光机理的深入研究和新材料、新反应体系的开发，化学发光将在更广泛的领域得到应用，并为科技的发展带来更加广阔的前景。
流动注射化学发光法对超氧阴离子自由基O2 -·和羟基自由基·OH的检测
食 ，斜技 品盐
Ｓｉ ｃ ａｄ Ｔｃ ｏ ｇ ｏ ｏｄＩｄｓｙ ｃｎｅ ｎ ｅ ｎｌｙ ｆＦ ｏ ｎｕｔ ｅ ｈ ｏ ｒ
分 轿 检 测
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ＩＦ Ｄ Ｆ Ｍ— 流 动 注 射 化 学 发 光 分 析 仪 西 安 瑞
迈科 技有 限公 司。
１２ 超 氧 阴 离 子 自 由基 Ｏ 一和 羟 基 自 由基 ・ 的 ＿ － ＯＨ
检测
人 类 大 部 分 常 见 疾 病 ， 心 脑 血 管 疾 病 、 症 和 如 癌
早 老 性 痴 呆 症 等 都 与 体 内 过 剩 的 自 由 基 有 关 ｌＩ 功 】。 一
孙涛 ，周 冬香 ，毛 芳 ，孙筱洁 ，顾 海 霞
（ 海水 产大 学食 品学 院 ， 海 ２０ ９ ） 上 上 ００ ０
摘
要 ： 用流 动 注 射 化 学 发 光技 术 ， 别在 邻 举 三 酚 自氧 化 体 采 分 系和 Ｆｎｏ ｅｔｎ体 系 中 ， 化 了检 测 超 氧 阴 离 子 自 由基 ｏ２・ 优 和 羟基 自由 基 ・ ｏＨ 的 方 法 。 通 过 对 测 定 条 件 的 研 究 ， 得
到 了测 定的 最 佳 方 案 ， 明 了方 法 的 可 行 性 和 重 现 性 。 证
好 的 特 点 ．
１ 材 料 与 方 法
１１ 材 料 与仪 器 ．
邻 苯 三 酚 溶 液 用 １ １ － ｌＬ 的 ＨＣ ０￣ ／ Ｘ ｍｏ １溶 液 配 制 ， 用 前川 ＿ 使 二次 蒸 馏 水 稀 释 至 所 需 浓 度 ； 米 诺 鲁
Ｆ ｎ ｏ ｓ ｓｅｍ Ｔｈ ＯＤ Ｉ ｕ ｅ ｔｎ ｙ ｔ ｅ ｔ ｍ ｍ ｃ ｎｄｉｏｎ ｏｒ ｈ ｏ ｔ ｆ ｉ ｔ ｅ ａｎ ｙ ｉ ｗａｓ ｄｅｅｒ ｉ ｄ ｔ ｇｈ ｅｘ ｒ ｅ ｔ ． ａｌｓｓ ｔ ｍ ｎｅ ｈｒ ｏｕ ｐｅ ｉ ｎ ｓ ｍ
化学发光方法学比较分析
免疫学技术的迅速发展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已逐渐无法适应这种形势的需要。
现今发展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避免污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的实验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的新纪元。
发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。
70年代末以来得到了迅速发展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，基本上可以分为：化学发光、时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致发光和电致发光)几种。
1、化学发光化学发光是指在化学反应过程中发出可见光的现象。
通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照射，通过吸收化学能(主要为氧化还原反应)，从基态激发至激发态。
退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。
其主要特点为消耗发光剂。
同时量子效率相对较低。
1.1 按化学反应类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。
其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。
酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过最，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。
因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。
酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。
而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。
非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，即含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短；如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次性测量。
所以重复性较差。
功能食品清除自由基活性评价方法及其进展1
[收稿日期]20060805 [基金项目]国家“十五”重大科技资助项目(2001BA501A20) [第一作者简介]严奉伟(1966),男,湖北江陵县人,工学博士,长江大学生命科学学院教授.功能食品清除自由基活性评价方法及其进展 严奉伟 (长江大学生命科学学院,湖北荆州434025;华中农业大学食品科技学院,湖北武汉430070) 朱建飞,吴谋成 (华中农业大学食品科技学院,湖北武汉430070)[摘要]几乎所有功能食品都要评价其清除自由基活性。
综述了评价功能食品清除自由基活性的方法(分光光度法、电子顺磁共振法、荧光探针法、化学发光法、示波极谱法、色谱法、质谱法),以及各方法的原理、特点及评价方法的最新进展。
[关键词]功能食品;清除自由基;活性;评价方法[中图分类号]O6231424;TS218[文献标识码]A [文章编号]16731409(2006)04021405目前,功能食品在国内外食品市场的增长幅度很大,功能食品的开发与生产成了食品行业的重要发展方向[1]。
但功能食品市场也曾受到假冒伪劣产品的严重损害,只有第3代功能食品才能占领并扩展功能食品市场[2]。
第3代功能食品要求明确食品中的功能成分与含量,这就要求在开发功能食品时必需对食品功能成分进行严格的功能评价[3]。
自由基对人体健康的影响很大,如肿瘤发生、辐射致癌、心脑血管疾病、器官的缺血再灌流、药物中毒、人体衰老等过程都涉及活性氧等自由基[4],这表明几乎所有功能食品的功能评价离不开其清除自由基活性评价。
为此,笔者现将迄今文献中评价各种成分清除自由基活性的方法总结如下。
1 分光光度法利用某些体系在氧化或自氧化过程中生成自由基,自由基与某些化合物作用,产生具有特定吸收的有色物质,用分光光度计进行测定。
受试物若能清除自由基,则光密度发生变化,可间接判断受试物对自由基的清除作用[5,6]。
本法对设备仪器条件要求最低,因而应用最为普遍。
1.1 检测清除总自由基的方法———二苯代苦味肼基自由基(DPP H ・)法自由基检测的一大难题是自由基很不稳定而难以检测,DPP H ・含一个单电子,寿命比其他自由基长,本身对517nm 的光线产生很强的吸收并呈色。
邻苯三酚自氧化法测定不同蜂产品抗氧化活性的研究[1]
![邻苯三酚自氧化法测定不同蜂产品抗氧化活性的研究[1]](https://img.taocdn.com/s3/m/ea74c918c5da50e2524d7f2c.png)
１．１ 材料 油菜花粉、茶花花粉、蜂胶、枣花蜜、蜂王浆：
市 售 ； 无 水 乙 醇 ； 邻 苯 三 酚 ； Ｔｒｉ； ＨＣｌ； 其 他 试 剂 ： 分析纯。 １．２ 实验仪器
ＣＵ４２０ 型 恒 温 水 浴 锅 ： 上 海 恒 科 科 学 技 术 有 限 公司； ＦＡ１６４０ 型电子天平： 上海天平仪器厂； ８５－ １ 型恒温磁力搅 拌器： 常州国华 仪 器 有 限 公 司 ； ＴＤＬ－ ６０Ｂ 型离心机： 上海安亭科学仪器厂； ７２３ 型可见分 光光度计： 上海第 三分析仪器厂； ２０２－ １Ａ 型数显电 热恒温干燥箱： 上海阳光实验仪器有限公司。
醇 ， 用 玻 璃 棒 搅 拌 促 其 溶 解 ， 即 为 所 需 的 １０％蜂 蜜 样品液， 低温贮藏， 备用。 ２．３ 抗氧化实验原理
利用某些体系在氧化过程中有超氧阴离子自由 基（Ｏ２ˉ） 的生成， Ｏ２ˉ与某些化合物的作用， 产生具有特 定吸收的有色物质， 利用分光光度计进行测定。受试 物若能清除 Ｏ２ˉ， 则吸光度发生 变 化 ， 可 间 接 判 断 受 试物对 Ｏ２ˉ的清除作用。
ＸＵＡＮ Ｈｏｎｇ－ ｚｈｕａｎ， ＳＡＮＧ Ｑｉｎｇ， ＭＡ Ｊ ｉａｎ－ ｊｕｎ
（Ｓ ｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓ ｃｉｅ ｎｃｅ ， Ｌｉａ ｏｃｈｅ ｎｇ Ｕｎｉｖｅ ｒｓ ｉｔｙ， Ｌｉａ ｏｃｈｅ ｎｇ ２５２０５９）
Ａｂｓｔｒ ａｃｔ： Ｔｈｅ ａｎｔｉ－ ｏｘｉｄａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ １％ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｐｒｏｐｏｌｉｓ ， ５％ ｅｔｈａｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔ ｏｆ ｂｅｅ ｐｏｌｌｅｎ， １０％
蜂胶、蜂花粉、蜂王浆、蜂蜜是药食兼用的天 然绿色食品， 具有广泛的生物学活性， 如抗肿瘤、 抗氧化、抗辐射、抗病源微生物、抗菌消炎、增强 免疫、软化血管、净化血液、改善微循环、局部麻 醉、护肝、促进组织再生以及延缓衰老等广泛的生 物学作用［１－ ５］。
氧自由基的分析研究进展
液氮（ ７７Ｋ） 低温保存 ＯＨ·与 捕 获 剂 形 成 的 自 旋 加合物， 发现 ３－ ４ 天后， 自旋加合物的浓度基本 不变， 即延长了自旋加合物的寿命。对于没有 ＥＳＲ 测量条件而不能实时进行 ＥＳＲ 测定的短寿 命自由基， 可以选用本方法， 选择合适的捕集剂， 捕集后立即置于液氮中保存， 需要时即取出解冻 测 量 。Ｐｏｕ 等［５］利 用 过 量 乙 醇 与 ＯＨ·反 应 生 成 ·ＣＨ （ ＣＨ３） ＯＨ 自由基， 然后利用 ４－ ＰＯＢＮ （ ４－ ｐｙｒｉｄｙｌ－ １－ ｏｘｉｄｅ－ Ｎ－ ｔｅｒｔ－ ｂｕｔｙｌｎｉｔｒｏｎｅ） 捕集形成一 个 相 应 的 自 旋 加 合 物 ， ·ＣＨ （ ＣＨ３） ＯＨ 与 ４ － ＰＯＢＮ 的 反 应 速 率 是 其 与 ＤＭＰＯ 或 ＰＢＮ 的 １０ 倍， ４－ ＰＯＢＮ－ ＣＨ（ ＣＨ３） ＯＨ 的 稳 定 性 比 用 ＤＭＰＯ 捕集生成相应的自旋加合物更强， 因此该方法的 灵 敏 度 高 。 李 占 魁 等［６］以 ＤＭＰＯ（ ５，５－ ｄｉｍｅｔｈｙｌ－ ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ－ ｌ－ ｏｘｉｄｅ） 为自旋捕捉剂， 采用 ＥＳＲ 自旋 捕捉法检测血清 ＳＯＤ 活性， 具有电子自旋共振 波谱技术直接测量及快速敏捷的优点， 又有误差 小 、灵 敏 度 高 、检 测 样 品 不 受 破 坏 和 对 化 学 反 应 无干扰等优点。
一、电子自旋共振法 电 子 自 旋 共 振 （ ＥＳＲ） 主 要 的 研 究 对 象 为 具 有未成对电子的自由基和过渡金属离子及其化 合物。自旋捕集（ ｓｐｉｎ ｔｒａｐｐｉｎｇ） 技术的建立为短 寿命自由基的 ＥＳＲ 检测技术开辟了新的途径［３］。 此方法利用自旋捕集剂和短寿命自由基之间的 结合反应， 生成相对稳定的自由基 （ 自旋加合 物） ， 然后进行 ＥＳＲ 测定。由于自旋加合物的寿 命很短， 因此必须在捕集之后立即进行 ＥＳＲ 测 定， 从而限制了许多实验研究。丛建波等［４］采用
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化学发光法与连苯三酚自氧化法消除O2—自由基可靠性的比较
【摘要】本实验利用化学发光法和连苯三酚自氧化法测试了五种抗氧化剂对O2?自由基的消除作用，结果表明同种抗氧剂相同浓度下不同反应体系对O2?自由基消除率相差很大，比较了不同反应体系的吸收光谱说明两法测试结果的区别，对化学发光法与连苯三酚自氧化法的可靠性进行了对比。
【关键词】化学发光法；连苯三酚自氧化法；氧自由基
1.引言
近年来，药学及其有关学科的迅速发展使药学的研究领域不断扩大且日益广阔和繁荣。
在现代药学的各个学科中，临床医学和生命化学领域中的自由基理论的研究及其在医学科学中的应用，是药学新领域研究的重要发展。
随着年龄的增长，生物体内产生抗氧剂和抗氧化酶能力逐渐下降。
自由基代谢平衡紊乱，过多的自由基会通过各种作用使机体受损而导致各种疾病或加快衰老。
因此，如何有效清除自由基就显得尤为重要，而O2?自由基是其中常见的一种。
目前，国内外对消除O2?自由基的测定方法很多，主要有：连苯三酚自氧化法、化学发光法、肾上腺素法、极谱电极法等，本文主要通过五种抗氧化剂来研究化学发光法与连苯三酚自氧化法对O2?自由基消除作用，从而比较两法的可靠性。
2.实验部分
2.1 试剂与仪器
试剂：茶多酚、苯甲酸、芦丁、芸香叶苷、槲皮素、连苯三酚、NaCO3、NaHCO3、HCl、Tris（三羟基甲基氨基甲烷）、EDTA（乙二胺四乙酸二钠），以上均为国产分析纯；鲁米诺（3-氨基邻苯二甲酰肼）为德国Merck-Schuchrdt公司产品；所用水均为二蒸水。
仪器：化学发光仪、pH数字酸度计、UV-754紫外分光光度计（上海第三分析仪器厂）。
2.2 溶液的配制
2.2.1 配制苯多酚等溶液
（1）称取一定量的槲皮素、苯甲酸、芦丁、芸香叶苷等，用乙醇水溶液（体积比为4：6）溶解定容，配制浓度分别至：100 mg/25 mL、100 mg/10 mL、20 mg/10 mL、50 mg/10 mL；称取一定量的茶多酚，用水溶解定容至浓度为100 mg/10 mL。
（2）缓冲液的配制
称取NaCO3 5.3g、NaHCO3 4.2 g，用二蒸水分别定容至500 mL，按两者体积比6：4配制成500 mL的溶液，用pH计调整至pH=10.16。
称取Tris 0.6057 g，EDTA 0.149 g，用二蒸水分别定容至500 mL，再取0.1 mol/L HCl 22.9 mL，混合均匀后，用用二蒸水定容至100 mL，调整pH=8.2。
（3）5 mmol/L鲁米诺溶液的配制
称取0.0442 g鲁米诺，加入少量三乙胺，再用pH=10.16 NaCO3 -NaHCO3缓冲液定容至50 mL，放置三天后备用。
（4）10 mmol/L HCl的配制
先量取浓HCl 5 mL稀释至100 mL，再移取3.33 mL定容至200 mL即可。
（5）6 mmol/L连苯三酚溶液的配制
称取连苯三酚0.0378 g，用10 mmol/L HCl定容至50 mL。
3.实验方法
3.1化学发光法
先启动发光仪预热两小时，在测定管中加入鲁米诺溶液1.6 mL，加入不同溶液的待测液0.04 mL，再加入连苯三酚0.2 mL，混合反应，待10s后，测定器5 s内发生强度的平均值，求出抑制率。
3.2连苯三酚自氧化法
（1）自氧化法曲线的测定
按下表要求加样，迅速摇匀，立即加入比色皿中，在420 nm处测其吸光度，每分钟一次，共测5分钟，平行三次，求出自氧化曲线。
（2）抗氧化性的测定
按下表加样，调整X的数值，以调节抗氧剂的量，测定不同浓度下的曲线，求出他们的斜率。
（3）抗氧化剂抑制率的测定
抑制率=（A0-AS）/A0%
其中A0为自氧化曲线斜率，AS为加抗氧化剂后的曲线斜率。
4.实验结果
4.1 抗氧化剂对O2-的消除作用
4.1.1 茶多酚对O2-的消除作用
化学发光法连苯三酚自氧化法
4.1.2 苯甲酸对O2-的消除作用
化学发光法连苯三酚自氧化法
4.1.3芦丁对O2-的消除作用
化学发光法连苯三酚自氧化法
4.1.4芸香叶对O2-的消除作用
化学发光法连苯三酚自氧化法
4.1.5槲皮素对O2-的消除作用
化学发光法连苯三酚自氧化法
5.讨论
5.1各物质对O2-的最大消除率的比较
化学发光法是应用自氧化反应产生的O2-，而O2-与化学发光剂鲁米诺反应产生电子激光态的中间产物，当其返回基态时即发光，当抗氧化物存在时由于歧化反应而发光。
自氧化法是由于自氧化反应属于游离基链反应，自氧化过程产生O2-，抗氧化物通过消除O2-降低了自氧化反应的总速度，其氧化产物在一定的波长处表现特征吸收，基于上述机理，样品的颜色对化学发光法无影响，而对自氧化影响较大，因为颜色越深，透过率越小，故其所测的最大消除率较小。
5.2 各物质对O2-消除作用的CI50比较
CI50是指抗氧化物对O2-自由基消除率达50%时所需抗氧物的量，通常用它来比较抗氧化物对自由基消除能力的大小，其值越小，抗氧化能力越强。
表6为各氧化物的CI50。
可见，化学发光法能较好的测出各物质的CI50值，而连苯三酚自氧化法对有些物质则不能测出，为了更好的比较两法的差别，我们又做了它们的吸光光谱。
5.3 误差及造成误差的原因
两种方法除去系统误差的影响外，偶然误差的影响不可忽视，现举一例说明如下：
在化学发光法中以茶多酚的消除率的50%为例，空白值为2500，当加入样品后其值为1250，若读数偏差为50时，其误差率为2%。
在分光光度计中，自氧化速率为0.0139 min-1，加入样品后其读数为0.00695，如读数偏差为0.00095，其误差率可达7%。
由此可见，偶然误差对分光光度法的影响较化学发光法大的多，从而使其可靠性有所降低。
6.结论
综合上述实验不难看出：首先最大消除率方面，化学发光法所测值比连苯三酚高的多，其次在求CI50值时，前者能准确测出各物质的CI50值，而后者则做不到，最后去除其他外界因素对两法的影响，偶然误差的存在对前者的影响要小的多。
由此可见，在测定抗氧化剂对自由基的消除作用时，化学发光法比连苯三酚自氧化法更可靠。
参考文献：
[1] 陈执中，超氧化物歧化酶和自由基的测定及其在医药科学研究中的应用进展：上海药品检验所.
[2] 邹国林，桂兰芬，钟晓凌，朱汝潘，一种测定方法：武汉大学生物系.
[3] 袁勤生，陈洁，周刚宏，超氧化物歧化酶测活方法比较：华东理工大学.
[4] 静天玉，赵晓瑜，用终止剂改进超氧化物歧化酶连苯三酚测活法：河北大学生物技术中心.
[5] 邓碧玉，袁勤生，李文杰，改良的连苯三酚自氧化法测定超氧化物测定氧化物歧化酶活性的方法：华东化工学院生化组.。