产气荚膜梭菌检验(食品微生物学检验)
《食品卫生-微生物学检验》--阳性对照标准菌株
《食品卫生微生物学检验》-----阳性对照标准菌株
中国工业微生物菌种保藏管理中心
《食品卫生微生物学检验》新版标准GB/T 4789-2010于2010年6月1日开始实施。
新版《食品卫生微生物学检验》国标在检测流程、检验方法及培养基使用等方面进行了较大改动。
标准中要求实验室应当有阳性对照标准菌株，以下是中国工业微生物菌种保藏管理中心整理的《食品卫生微生物学检验》标准中涉及的阳性对照标准菌株，以方便食品监督管理部门、检验检疫机构、卫生防疫部门、大专院校、科研院所和食品企业微生物实验室使用。
附件：食品微生物学检验(GB/T 4789)阳性对照用菌。
产气荚膜梭菌 国标检测方法
产气荚膜梭菌国标检测方法
《产气荚膜梭菌国标检测方法》
产气荚膜梭菌是一种在自然界中广泛分布的细菌，在土壤、水体和动植物表面等环境中都可能存在，同时也是人和动物的肠道正常菌群。
然而，产气荚膜梭菌也会引起食物中毒，对人体健康造成威胁。
因此，及时、准确地检测产气荚膜梭菌成为了食品安全监管的重要内容之一。
为了规范产气荚膜梭菌的国家标准检测方法，中国国家标准化管理委员会发布了《食品安全国家标准食品微生物检验鲜肉和肉制品、水产品及蛋品中产气荚膜梭菌检验》（GB 4789.9-2016）。
该标准规定了在食品中产气荚膜梭菌的检测方法及技术要求，其内容包括了样品制备、检测方法、结果判读和报告等方面。
在该标准中，样品制备包括了样品采集、致病菌分离培养和纯化等步骤；检测方法主要采用分子生物学技术和培养方法相结合的策略；结果判读则依据标准规定的指标和标准质控程序进行判定；报告部分则要求对检测结果进行详细的描述和解释。
此外，随着检测技术的不断更新和完善，国家标准化管理委员会也会不断修订和完善相关标准，以确保检测方法的准确性和适用性。
同时，食品生产企业也应当严格按照国家标准要求，对生产过程中的食品样品进行产气荚膜梭菌的检测，以保障食品的安全和质量。
总之，《产气荚膜梭菌国标检测方法》作为国家标准的一部分，对食品安全监管起着重要的作用，通过该标准的执行，可以有效避免食品中产气荚膜梭菌的污染，保障食品安全，保护消费者的健康。
食品卫生微生物学检验产气荚膜梭菌
观察接种点的变化。产气英膜梭菌产生卵磷脂酶，分
解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围形成乳白色
的混浊带。
医学ppt
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产气荚膜梭菌的检验
菌数计算 根据黑色菌落的计数和确证试验的结果，
计算每克（毫升）食品检样的含菌数。
例如：10-4稀释液的平板长有黑色菌落100个， 而供做确证试验的10个菌落中有7个被确证为
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产气荚膜梭菌纯培养的镜下形态 医电学镜ppt 下的产气荚膜梭菌（C.perfringens）5
产气荚膜梭菌的生物学性状
2.培养特性 生长活跃，代谢迅速。 血琼脂平板：双层溶血环（靶形溶血）
内环完全溶血 外环不完全溶血 含铁牛奶培养基： “汹涌发酵” （stormy fermentation）
2.食物中毒 食入被大量细菌污染的食物（肉类） 临床表现：剧烈腹绞痛、腹泻；可自愈
3.坏死性肠炎
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三、产气荚膜梭菌的流行病学
在世界各地出现，但血清型分布不同。 可以引起地区性流行，也有散发性报道。 中毒最常发生于儿童和老人。 多发生在夏、秋季。
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四、产气荚膜梭菌的检验
设备和材料
冰箱：0 ℃-4℃。 恒温培养箱：36℃士1℃ 恒温水浴锅：46℃士1℃ 显微镜：10×～100 × 均质器或灭菌乳钵
厌氧培养装置：常温催化除氧式或碱性焦性没石子酸除氧式
灭菌吸管：1mL（具0.01mL刻度），10mL（具0.1mL刻度） 灭菌试管：16mmX160mm 灭菌平皿：直径90mm 灭菌锥形瓶：500mL
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产气荚膜梭菌的检验
培养基和试剂
1.疱肉培养基：GB/T4789.28-2003中4.67 2.亚硫酸盐一多粘菌素一磺胺嘧啶琼脂(SPS) ：
产气荚膜梭菌检验标准操作程序
产气荚膜梭菌检验标准操作程序产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是一种产生有毒代谢产物的革兰氏阳性厌氧菌，常见于土壤、粪便和人体肠道中。
其毒素可引起严重的食物中毒和其他感染性疾病，因此对产气荚膜梭菌的监测和检验至关重要。
1.引言产气荚膜梭菌是一种广泛分布且致病力强的细菌，在食品安全和公共卫生领域具有重要意义。
为了确保食品的安全性和卫生标准，需要对食品、环境和临床标本中的产气荚膜梭菌进行检验。
本文将介绍产气荚膜梭菌检验的标准操作程序，并探讨其中的关键步骤和注意事项。
2.标本采集在进行产气荚膜梭菌检验之前，首先需要采集样本。
对于食品样品，可以直接将样品取样放入含有富集培养基的袋子中。
对于环境样品和临床样本，应当使用消毒的采样器具采集，并立即送至实验室进行处理。
3.富集培养采集到的样品需要进行富集培养，以增加产气荚膜梭菌的数量。
将样品转移到含有适当营养物质的培养基中，利用合适的条件（如温度、气氛）进行培养。
通常，产气荚膜梭菌在厌氧条件下生长较好，因此富集培养应当在无氧或低氧环境中进行。
4.筛选经过富集培养后，需要进行筛选，以确定样品中是否存在产气荚膜梭菌。
常用的方法包括置换培养、差异培养和生化试剂检验。
通过观察菌落形态、产气能力和代谢产物等指标，可以初步筛选出产气荚膜梭菌。
5.鉴定对于筛选出的潜在产气荚膜梭菌菌株，需要进行进一步的鉴定。
主要包括形态学观察、生理生化特性检验和分子生物学方法。
通过对其细胞形态、营养需求和基因序列等特征的分析，可以准确鉴定产气荚膜梭菌。
6.毒素检测产气荚膜梭菌引起食物中毒的主要机制是其产生的毒素。
因此，在检验过程中，还需要对样品中的毒素进行检测。
常用的方法包括毒素中和试验、免疫测定和PCR检测。
通过这些方法，可以确定样品中毒素的种类和含量。
7.结果分析最终，根据样品中产气荚膜梭菌的数量和毒素水平，对检验结果进行分析。
根据相关标准和法规，确定样品是否符合卫生安全要求。
产气荚膜梭菌检验
GB 4789.13－2012食品安全国家标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验★方法修订★检验方法一、流行病学产气荚膜梭菌是人类气性坏疽的主要病原菌。
1892年，美国病理学家W.H.韦尔奇等自尸体分出本菌，故又称魏氏梭菌。
本菌广泛存在于土壤、人和动物的肠道以及动物和人类的粪便中，会散发臭味。
常因深部创伤而感染。
有些菌株产生肠毒素，可引起食物中毒。
一、流行病学产气荚膜梭菌为厌氧芽胞杆菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。
可引起典型的食物中毒爆发。
临床特征是患者剧烈腹绞痛和腹泻。
摄食被本菌污染的食品后8～22 h开始发病。
一、流行病学在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×10７或更多），才能在肠道中生产毒素，病程通常在24小时内，但某些个体的不显著症状可能会持续1～2周，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。
一、流行病学据报道魏氏梭菌食物中毒在美国占细菌性食物中毒的30%左右。
美国疾病控制中心最新统计数据表明，每年美国由产气荚膜梭菌引起的食物中毒人数在250,000左右，其中大约只报告1200例，暴发约20起，其中约有十人死亡，每年造成的经济损失在1.2亿美元左右。
一、流行病学大量的暴发和少量的发病都与公共饮食有关。
例如：学校的自助食堂和护理病房，产气荚膜梭菌中毒最常发生于儿童和老人。
一、流行病学产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现。
该菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中，可以分离产气荚膜梭菌。
一、流行病学引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因为食品加热不彻底，芽胞在食品中大量繁殖所致。
一、流行病学此外，不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌大量繁殖并产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。
产气荚膜梭状芽孢杆菌检验-文档资料
2)培养特性
*不严格的厌氧 *普通营养琼脂上可生长，若加入葡萄糖、血液则生长更好。 *适宜生长温度为37—47℃。 *生长和繁殖速度极快，在适宜条件下8min/代。 *在45℃高温下可进行快速分离纯培养，每培养3—4h 传种1次，较易分离纯化。
Clostridium Perfringens Toxin
2、生物学特性
1)形态与染色
G+( 陈旧培养物阴性菌）无鞭毛可形成荚膜和芽 胞的大杆菌 大小：为(1－2)μm X(2－10)μm 。 芽孢：卵圆形位于菌体中央或近端，直径大于菌体的 直径，有的菌株难形成芽胞。 荚膜：在人和动物活体组织内，或在含血清的培养基 内生长时可形成荚膜。
Clostridium perfringens
/courses/bio141/labmanua/lab16/bloodcp.ht
/courses/bio141/labmanua/lab 16/bloodcp.html/.../ labmanua/lab16/bloodcp.html
Clostridium perfringens Growing on Blood Agar
amozeshonline/bacteriolog y/archives/2019/09/uuoeoeo euoeuuu.html/.../ 09/uuoeoeoeuoeuuu.html
1、概述
产气荚膜梭状芽孢杆菌 又称魏/卫氏梭菌 分布：自然界广泛存在(创伤感染）。 易污染食品：动物性食品原料 食品加热后未及时冷却，所含耐高温而 残余的产气荚膜梭菌芽孢会迅速发芽，大量 繁殖，菌数可达数 10 万 /g ，食用前又未加热， 则有可能引起产气荚膜梭菌食物中毒。 食品中产气荚膜梭菌检验的主要目标是 检验食品被该菌污染的程度，其重点项目是 活菌数测定及证实试验。
GB4789系列食品微生物学检验标准汇总
GB 4789.43-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验微生物源酶制剂抗菌活性的测定
41
GB 4789.44-2020
食品安全国家标准食品微生物学检验创伤弧菌检验
第二部分其他
42
GB/T 27405-2008
实验室质量控制规范食品微生物检测
43
GB/T 23784-2009
食品微生物指标制定和应用的原则
食品卫生微生物学检验冷食菜、豆制品检验
24
GB/T 4789.24-2003
食品卫生微生物学检验糖果、糕点、蜜饯检验
25
GB/T 4789.25-2003
食品卫生微生物学检验酒类检验
26
GB 4789.26-2013
食品安全国家标准食品微生物学检验商业无菌检验
27
GB/T 4789.27-2008
食品卫生微生物学检验鲜乳中抗生素残留检验
15
GB 4789.15-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验霉菌和酵母计数
16
GB 4789.16-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验常见产毒霉菌的形态学鉴定
17
GB/T 4789.17-2003
食品卫生微生物学检验肉与肉制品检验
18
GB 4789.18-2010
食品安全国家标准食品微生物学检验乳与乳制品检验
7
GB 4789.7-2013
食品安全国家标准食品微生物学检验副溶血性弧菌检验
8
GB 4789.8-2016
食品安全国家标准食品微生物学检验小肠结肠炎耶尔森氏菌检验
9
GB 4789.9-2014
食品安全国家标准食品微生物学检验空肠弯曲菌检验
产气荚膜梭菌及检验
产气荚膜梭菌及检验一、流行病学产气荚膜梭菌为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎最常见的病原之一。
可引起典型的食物中毒、爆发。
由产气荚膜梭菌引起的疾病为魏氏梭菌中毒。
患者临床特征是剧烈腹绞痛和腹泻。
摄食被本菌污染的食品后8�22小时开始发病。
在食品中该菌数量必须达到很高时（1.0×107或更多），才能在肠道中生产毒素，病程通常在24小时内，但某些个体的不显著症状可能会持续1�2周，已报导有少数病人因脱水和其它混合感染而导致死亡。
据美国人类卫生教育福利部报导魏氏梭菌引起的食物中毒，在美国占细菌性食物中毒的30%左右，另据美国疾病控制中心，估计每年因产气荚膜梭菌引起的食物中毒约近1万人，其中大约只报导1200例，暴发约20起，大量的暴发和少量的发病都与公共饮食有关。
例如：学校的自助食堂和护理病房，产气荚膜梭菌中毒最常发生于儿童和老人。
产气荚膜梭菌广泛分布于环境中，经常在人和许多家养及野生动物的肠道中发现该细菌的芽胞长期存在于土壤和沉淀物中，从牛肉、猪肉、羔羊、鸡、火鸡、焖肉、红烧蔬菜，炖肉和肉汁中分离的产气荚膜梭菌，引起食物中毒的食品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶也可因污染而引起中毒，原因是因为食品加热不彻底，使芽胞在食品中大量繁殖所致，此外不少熟食品，由于加温不够或后污染而在缓慢的冷却过程中，细菌繁殖体大量繁殖并形成芽胞产生肠毒素，其食品并不一定在色味上发现明显的变化，人们在误食了这样的熟肉或汤菜，就有可能发病。
产气荚膜梭菌易于形成芽胞，芽胞的热抵抗力很强，由患者粪便中分离的芽胞能耐受100℃,1�5小时的加热。
除了具有形成芽胞及耐热等特点之外，生化性状，毒素及酶的特异性等，同其它魏氏梭菌是一致的。
食品微生物学检验 产气荚膜梭菌原始记录
日期日期
动力—硝酸盐
℃
h
动力
产气荚膜梭菌无动力
硝酸盐
产气荚膜梭菌能将硝酸盐还原为亚硝酸盐
乳糖—明胶试验
℃h
产气荚膜梭菌能发酵乳糖，是明胶液化
经确证产气荚膜梭菌阳性菌落数B
结果T（CFU/g）
备注
n1为第一稀释度经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数，n2为第二稀释度经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数，0.1为稀释系数，d为稀释因子
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平板1
平板2
FTG培养（用于确证试验的菌落数C）℃h
确证试验
革兰氏染色镜检
产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌
牛奶发酵
℃h（水浴）
产气荚膜梭菌呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑
动力—硝酸盐
℃
h
动力
产气荚膜梭菌无动力
硝酸盐
产气荚膜梭菌能将硝酸盐还原为亚硝酸盐
乳糖—明胶试验
℃h
产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化
实验记录
检测项目产气荚膜梭菌检验依据GB 4789.13-2012
培养箱编号天平编号
水浴振荡器编号TSC琼脂制备编号
FTG制备编号含铁牛乳培养基制备编号
革兰氏染色液缓冲动力硝酸盐培养基
乳糖—明胶培养基检测日期
样品编号
样品编号
空白
TSC琼脂黑色菌落数A
℃h（厌氧）
稀释度
10
10
10
10
10
10
10
10
经确证产气荚膜梭菌阳性菌落数B
结果T（CFU/g）
样品编号
空白
TSC琼脂黑色菌落数A
℃h（厌氧）
稀释度
10
对GB 8538-216《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》中产气荚膜梭菌检验的研究与改进
分析检测Analysis and Testingdoi:10.16736/41-1434/ts.2020.14.056对GB 8538-216《食品安全国家标准 饮用天然矿泉水检验方法》中产气荚膜梭菌检验的研究与改进Research and Improvement of Clostridium Perfringens Test in GB 8538-2016 National Standard for Inspection of Natural Mineral Water for Drinking◎ 黄薇臻（南宁市食品药品检验所，广西 南宁 530007）Huang Weizhen(Nanning Testing Institute for Food and Drug Control, Nanning 530007, China)摘 要：以中国检科院测试评价中心（ACAS）组织的矿泉水中产气荚膜梭菌的检测能力验证、测量审核为例，实验检验使用标准GB 8538-2016《食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法》，实验过程滤膜上的菌落在亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）经24 h厌氧环境培养后黑色菌落不明显，甚至不生长黑色菌落影响后续确认性实验，以及确证性实验中含铁牛乳培养基“暴烈发酵”实验现象不明显，针对此现象进行研究与改进。
关键词：产气荚膜梭菌；检验；改进Abstract：Taking the testing ability verification and measurement audit of clostridium perfringens in mineral water organized by the Testing and Evaluation Center of the Chinese Academy of Sciences (ACAS) as an example, the test used standard GB 8538-2016 Inspection Method for Drinking Natural Mineral Water in National Standard for Food Safety”. In the process of the experiment, black colonies on the filter membrane were not obvious after 24h anaerobic culture of sulfite - polymyxin - sulfadiazine (SPS). And there was no black colonies which influenced subsequent confirmatory experiments. The “violent fermentation” of iron-containing milk medium was also not obvious in the confirmatory experiment. Research and improvement were performed based on this.Key words：Clostridium perfringens; Testing; Improvement中图分类号：R123.1产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）为厌氧芽胞菌，是引起食源性胃肠炎常见的病原菌，该菌能引起气性坏疽和食物中毒。
牛奶中产气荚膜梭菌的分离鉴定和带菌量测定
动物医学进展，２０２０，４１（７）：５３ ５７ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ牛奶中产气荚膜梭菌的分离鉴定和带菌量测定 收稿日期：２０２０ ０３ ３０ 基金项目：国家自然科学基金项目（３１９７２０４３） 作者简介：潘奕帆（１９９９－），男，陕西人，本科生，主要从事食品微生物学研究。
通讯作者潘奕帆，刘变芳（西北农林科技大学食品科学与工程学院，陕西杨凌７１２１００） 摘 要：调查陕西关中地区牛奶中产气荚膜梭菌的污染情况及其优势血清型和携带的毒素基因。
通过对３个奶牛场采集的８６份牛奶样品进行细菌分离纯化，应用多重ＰＣＲ鉴定分离菌株的血清型，进行ｃｐｂ２、ｃｐｅ毒素基因检测，并对场３的乳样按照ＧＢ４７８９．１３－２０１２规定的方法进行产气荚膜梭菌带菌量的测定。
结果显示，个体乳样产气荚膜梭菌的分离率为１１．３％（７／６２），且全部为Ａ型菌，５７．１％（４／７）的分离菌株携带ａｔｙｐ．ｃｐｂ２基因，但所有分离菌株均未检测到ｃｏｎｓ．ｃｐｂ２和ｃｐｅ基因。
而混合乳样（２４份）中未分离出目的菌。
场３的２８份乳样中３份产气荚膜梭菌阳性乳的带菌量为１ＣＦＵ／ｍＬ～１５．３ＣＦＵ／ｍＬ。
初步了解了陕西关中地区生鲜牛奶中产气荚膜梭菌的污染情况、血清型及其携带的毒素基因，为关中地区牛奶中该菌污染的防控提供科学依据，为该菌引起食物中毒的流行病学研究提供参考资料。
关键词：牛奶；产气荚膜梭菌；分离鉴定；聚合酶链反应；毒素基因中图分类号：Ｓ８２３．９１；ＴＳ２５２．２文献标识码：Ａ文章编号：１００７ ５０３８（２０２０）０７ ００５３ ０５ 随着生活水平的提高和人们对健康营养的要求，牛奶日益成为家庭餐桌上不可或缺的营养食品之一。
近年来，由产气荚膜梭菌（犆犾狅狊狋狉犻犱犻狌犿狆犲狉 犳狉犻狀犵犲狀狊）导致的食物中毒案例不断增多，鲜牛奶中也同样检测到了产气荚膜梭菌，因此，牛奶卫生安全受到广泛关注，研究表明未经巴氏灭菌的牛奶能检测到许多致病菌，对消费者构成潜在风险。
产气荚膜梭菌检验标准操作程序
产气荚膜梭菌检验标准操作程序As the development of science and technology advances, the testing standards and procedures for Clostridium difficile (C. diff) have become more refined and rigorous. 随着科学技术的进步，产气荚膜梭菌(C. diff)的检测标准和程序变得越来越精细和严格。
When it comes to the detection of C. diff, it is essential to follow standardized operating procedures to ensure accurate and reliable results. 检测C. diff时，遵循标准化的操作程序至关重要，以确保结果准确可靠。
One of the critical steps in the testing process is sample collection. Proper sample collection is crucial for obtaining accurate results. 检测过程中一个关键的步骤是样品采集。
正确的样品采集对于获得准确的结果至关重要。
In addition to sample collection, sample transportation and storage are also vital aspects of the testing procedure. Proper transportation and storage conditions help preserve the integrity of the sample and prevent contamination or degradation. 除了样品采集外，样品的运输和储存也是检测过程中至关重要的方面。
产气荚膜梭菌检验标准的修订
76 食品安全导刊 2013年3月刊TEChNOLOGy ThESIS 科技文苑随着我国经济的快速发展，从产气荚膜梭菌检验工作的实际情况来看，现有标准与出现的新情况、新问题不相适应，主要表现在：原标准的适用性、内容的完整性、操作的规范性等方面还有待进一步的提高。
中国检验检疫科学研究院、中国疾病预防控中心营养与食品安全所和辽宁出入境检验检疫局适时地组织和开展对GB/T 4789.13—2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》的修订，修订后的标准已经颁布实施了。
产气荚膜梭菌（C l o s t r i d i u m Perfringens)是引起食源性胃肠炎最常见的病原菌之一，该菌的各种检测方法对保障食品安全起着非常重要的作用，尤其是食品安全国家标准。
现就GB 4789.13－2012《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》主要修订的部分进行说明，包括以下5个方面。
1 样品制备如样品采集后不能立即进行检验，以前不知道样品该如何处理，现在就可以依据GB 4789.13－2012《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》中5.1样品制备部分对样品及时进行正确处理。
另外，针对固产气荚膜梭菌检验标准的修订□ 刘沛 何艳玲 北京陆桥技术有限责任公司摘 要：GB 4789.13－2012《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》已经颁布实施，文章就该标准的修订部分及修订原因进行详细说明，包括样品制备、选择性计数琼脂的选择、活菌计数培养、确证实验和菌数计算等方面。
关键词：产气荚膜梭菌 检验 国家标准体或半固体样品的处理，增加了拍击式均质器均质的方法，该方法处理样品时效率高且效果好。
拍击式均质器在微生物检测领域中已得到广泛应用，在国内外许多标准和方法中被推荐使用，及时增加该方法，使用时就有据可依了。
2 将选择性计数琼脂由亚硫酸盐-多粘菌素-磺胺嘧啶琼脂（SPS）改为胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂GB/T 4789.13—2003《食品卫生微生物学检验 产气荚膜梭菌检验》采用S PS 琼脂对产气荚膜梭菌进行计数，而U S-F DA BA M （U S-FDA Bacteriological Analytical Manual Chapter 16 Clostridium Perfringens （2001））、I S O 标准（I S O 7937 Microbiology of food and animal feeding stuffs—Horizontal method for the enumeration of Clostridium perfringens—Colony-count technique）和AOAC官方方法[AOAC O f ficia l Method 976.30：Clostridium Perfringens in Foods Microbiological Method （First Action 1976；Final Action 1979）]均采用TSC琼脂对产气荚膜梭菌进行计数，所以安排试验比较TSC琼脂与SPS琼脂的效果。
产气荚膜梭茵的检验
产气荚膜梭茵的检验摘要】目的研究产气荚膜梭茵的检验方法。
方法分析其生态、生物学性状、致病性与免疫性、微生物学检验等。
结论要提高产气荚膜梭茵的检出率，要在多个环节上加以重视，严格按照操作规程，才能提高检出率，有效地治疗厌氧菌引起的化脓性炎症，使患者早日康复。
【关键词】产气荚膜梭茵检验产气荚膜梭菌(c.peueringens)，又名魏氏梭菌(c.welchii)，它是引起气性坏疽的病原菌群之一。
(一)生态产气荚膜梭菌广泛地分布于自然界，尽管它在人畜肠道中数量不大，约104～105/g，但它是人畜肠道正常菌群之一。
此菌对人致病的主要为A型和c型。
A型产气荚膜梭菌是土壤及肠道菌群成员之一，而B、C、D、E型菌可能是动物专性栖生菌，偶尔在人体内发现。
本菌可从食物、牛奶、奶酪或包装不合格的肉食及野味中分离，在人体中除了口腔外，子宫颈、阴道、尿道、消化道中也可分离到，1/5人群还可能从前肘窝皮肤分离到此菌。
A型产气荚膜梭菌参与气性坏疽致病。
(二)生物学性状1.形态产气荚膜梭菌是革兰染色阳性粗大杆菌，约为0.6～2.4μm×1.3～1.9(或3～5)μm，无鞭毛，不运动，直杆菌，两端纯圆，单个或成双排列，偶见长丝状。
芽胞椭圆形，位于菌体中央或次极端，芽胞直径不大于茵体。
在一般培养时不易形成芽胞，在无糖培养基中有。
2.培养厌氧，但要求不严格。
繁殖迅速，培养2 h后，在液体培养基深层即有明显生长，经4～6 h培养后出觋表面生长，在平板培养基上24 h培养，表面蔼落直径2～4，霭形、凸起，光滑、半透明、边缘整齐，无迁徙生长现象。
在血平板上，多数菌株有双层溶血环，内环完全溶血是由于0毒素的作用，外环不完全溶血则是由α毒素所致。
在卵黄琼脂平板上，菌落周围出现乳白色混浊圈，是由于此菌所产生的卵磷脂酶分解了蛋黄中的卵磷脂，此现象可被特异性抗血清所中和，这一现象称为聂格尔(Nagler)反应，对于菌株的确定有决定性意义。
GB产气荚膜梭菌检测
2
《GB 4789.13—2012 食品微生物学检验 产气荚膜梭菌 检验 》
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《GB 4789.13—2012 食品微生物学检验 产气荚膜梭 菌检验 》解决方案
用途 样品制备 GB中的名称 1%蛋白胨水 OXOID的英文名称 Peptone Bacteriological OXOID的中文名称 细菌学蛋白胨 OXOID货号 LP0037B
计数培养
Perfringens Agar 胰胨-亚硫酸盐-环丝 Base (TSC/SFP) 氨酸（TSC）琼脂 Perfringens（TSC） Supplement 液体硫乙醇酸盐培养 Thioglycollate Medium 基（FT）
产气荚膜梭菌 CM0587B TSC/SFP 琼脂基础 产气荚膜梭菌TSC 添 SR0088E 加剂 硫乙醇酸盐培养基 CM0173B CM0173T
GB 产气荚膜梭菌检测
产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）
• 产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）是革兰氏阳性杆状厌氧 菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖 类而产出大量气体以及可以在体内能 形成荚膜而得名。 • 严格厌氧，对营养要求不高，厌氧培 养中生长繁殖极快。 • 此菌多以芽胞形式广泛分布于土壤、 人及动物肠道中。引起食物中毒的食 品大多是畜禽肉类和鱼类食物，牛奶 也可因污染而引起中毒。
确认试验
革兰氏染色液
Gram Stain Kit
革兰氏染色液套装
R400804ຫໍສະໝຸດ 结果观察• 培养：
典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。
• 确证实验：
从单个平板上任选5个（小于5个全选）黑色菌落，分别接种 到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h 用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。产气荚 膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽孢体。 含铁牛乳培养基：暴烈发酵 缓冲动力-硝酸盐培养基：产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐 还原为亚硝酸盐。 乳糖-明胶培养基：产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。
出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法
出口食品中产气荚膜梭状芽孢杆菌检验方法1.适用范围本方法适用于出口食品的检验。
2.培养基和仪器2.1.培养基胰月示 -亚硫酸盐-环丝氨酸(TSC)琼脂；d-环丝氨酸溶液；卵黄乳液；缓冲动力-硝酸盐培养基；乳糖-明胶培养基；产芽孢肉汤；多价蛋白胨-酵母膏(PY)培养基；硫乙醇酸盐液体培养基；蛋白胨水；亚硝酸盐试剂；缓冲甘油-氯化钠溶液。
2.2.仪器吸管1.0mL和10.0mL，分别具有0.1mL和1.0mL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；超低温冰箱；恒温培养箱：36±1℃；恒温水浴箱：46±1℃；培养皿：90或100mm；显微镜。
3.样品制备3.1.样品的贮存和运送如不能立即进行检验时，应在样品中加等量缓冲甘油-氯化钠溶液(液体食品应加双料的)。
将样品作低温保存，直到检验。
运送样品时，应使样品保持冷冻状态，并要避免容器破损。
3.2.制样将样品解冻，取25g移入灭菌均质杯，加225mL蛋白胨水，以13 000r/min 均质2min，如为液体样品，则取样25mL，加入盛有225mL稀释剂的500mL稀释瓶中，摇匀，吸取此1∶10样品匀液10mL加于90mL蛋白胨水中，摇匀，制成1∶100样品稀释液，必要时，按此法将样品作进一步的10倍递增稀释，如从10－3～10－4……。
4.检验4.1.平板计数法倾注不含卵黄的TSC琼脂到10个灭菌平皿中，每皿约5mL，并迅速旋转平皿，使琼脂铺平。
当琼脂凝固后，将每个平皿编号标记，以无菌操作，吸取稀释液样品1mL分别加到每个琼脂平板表面中心。
再向平皿中倾注不含卵黄的TSC 琼脂15mL，缓慢地旋转平皿，使其与接种物混合均匀。
也可用灭菌L形玻璃棒，将0.1mL样品稀释液均匀地涂布于含卵黄乳液的TSC琼脂上，将平板水平静置5～10min，使接种物被吸收。
然后用不含卵黄的TSC琼脂10mL覆盖平板表层(含卵黄的TSC琼脂最适于同时含有其他还原亚硫酸盐梭状芽孢杆菌的食品)。
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食品安全国家标准
食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验
1范围
本标准规定了食品中产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）的检验方法。
本标准适用于食品中产气荚膜梭菌的检验。
2设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
a）恒温培养箱：36℃±1℃；
b）冰箱：2℃～5℃；
c）恒温水浴箱：50℃±1℃，46℃±0.5℃；
d）天平：感量0.1g；
e）均质器；
f）显微镜：10×～100×；
g）无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头；
h）无菌试管：18mm×180mm；
i）无菌培养皿：直径90mm；
j）pH计或pH比色管或精密pH试纸；
k）厌氧培养装置。
3培养基和试剂
3.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂：见附录A中A.1。
3.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）：见附录A中A.2。
3.3缓冲动力-硝酸盐培养基：见附录A中A.3。
3.4乳糖-明胶培养基：见附录A中A.4。
3.5含铁牛乳培养基：见附录A中A.5。
3.60.1%蛋白胨水：见附录A中A.6。
3.7革兰氏染色液：见附录A中A.7。
3.8硝酸盐还原试剂：见附录A中A.8。
3.9缓冲甘油-氯化钠溶液：见附录A中A.9。
4检验程序
产气荚膜梭菌检验程序见图1。
图1产气荚膜梭菌检验程序
5
操作步骤5.1样品制备
5.1.1
样品采集后应尽快检验，若不能及时检验，可在2℃～5℃保存；如8h 内不能进行检验，应以
无菌操作称取25g （mL ）样品加入等量缓冲甘油-氯化钠溶液（液体样品应加双料），并尽快至于-60℃低温冰箱中冷冻保存或加干冰保存。
5.1.2
以无菌操作称取25g （mL ）样品放入含有225mL 0.1%蛋白胨水（如为5.1.1中冷冻保存样品，
室温解冻后，加入200mL 0.1%蛋白胨水）的均质袋中，在拍击式均质器上连续均质1min ～2min ；或置于盛有225mL0.1%蛋白胨水的均质杯中，8000r/min ～10000r/min 均质1min ～2min ，作为1:10稀释液。
5.1.3
以上述1:10稀释液按1mL 加0.1%蛋白胨水9mL 制备10-2～10-6
的系列稀释液。
5.2培养
5.2.1吸取各稀释液1mL加入无菌平皿内，每个稀释度做两个平行。
每个平皿倾注冷却至50℃的TSC 琼脂（可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温）15mL，缓慢旋转平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。
5.2.2上述琼脂平板凝固后，再加10mL冷却至50℃的TSC琼脂（可放置于50℃±1℃恒温水浴箱中保温）均匀覆盖平板表层。
5.2.3待琼脂凝固后，正置于厌氧培养装置内，36℃±1℃培养20h～24h。
5.2.4典型的产气荚膜梭菌在TSC琼脂平板上为黑色菌落。
5.3确证试验
5.3.1从单个平板上任选5个（小于5个全选）黑色菌落，分别接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h。
5.3.2用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检并观察其纯度。
产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗短的杆菌，有时可见芽孢体。
如果培养液不纯，应划线接种TSC琼脂平板进行分纯，36℃±1℃厌氧培养20h～24h，挑取单个典型黑色菌落接种到FTG培养基，36℃±1℃培养18h～24h，用于后续的确证试验。
5.3.3取生长旺盛的FTG培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃±0.5℃水浴中培养2h后，每小时观察一次有无“暴烈发酵”现象，该现象的特点是乳凝结物破碎后快速形成海绵样物质，通常会上升到培养基表面。
5h内不发酵者为阴性。
产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。
5.3.4用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种缓冲动力-硝酸盐培养基，于36℃±1℃培养24h。
在透射光下检查细菌沿穿刺线的生长情况，判定有无动力。
有动力的菌株沿穿刺线呈扩散生长，无动力的菌株只沿穿刺线生长。
然后滴加0.5mL试剂甲和0.2mL试剂乙以检查亚硝酸盐的存在。
15min内出现红色者，表明硝酸盐被还原为亚硝酸盐；如果不出现颜色变化，则加少许锌粉，放置10min，出现红色者，表明该菌株不能还原硝酸盐。
产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
5.3.5用接种环（针）取FTG培养液穿刺接种乳糖-明胶培养基，于36℃±1℃培养24h，观察结果。
如发现产气和培养基由红变黄，表明乳糖被发酵并产酸。
将试管于5℃左右放置1h，检查明胶液化情况。
如果培养基是固态，于36℃±1℃再培养24h，重复检查明胶是否液化。
产气荚膜梭菌能发酵乳糖，使明胶液化。
6结果与报告
6.1典型菌落计数
选取典型菌落数在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。
如果：
a)只有一个稀释度平板的典型菌落数在20CFU～200CFU之间，计数该稀释度平板上的典型菌落；
b）最低稀释度平板的典型菌落数均小于20CFU，计数该稀释度平板上的典型菌落；
c）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
d）某一稀释度平板的典型菌落数均大于200CFU，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的典型菌落数不在20CFU～200CFU之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；
e）2个连续稀释度平板的典型菌落数均在20CFU～200CFU之间，分别计数2个稀释度平板上的典型菌落。
6.2结果计算
6.1计数结果按公式（1）计算：
(1)
式中：
T ——样品中产气荚膜梭菌的菌落数；A ——单个平板上典型菌落数；
B ——单个平板上经确证试验为产气荚膜梭菌的菌落数；
C ——单个平板上用于确证试验的菌落数；
n 1——第一稀释度（低稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；n 2——第二稀释度（高稀释倍数）经确证试验有产气荚膜梭菌的平板个数；0.1——稀释系数；
d ——稀释因子（第一稀释度）。
6.3
报告
根据TSC 琼脂平板上产气荚膜梭菌的典型菌落数，按照6.2中公式计算，报告每g （mL ）样品中产气荚膜梭菌数，报告单位以CFU/g （mL ）表示；如T 值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。
d
n n C B A T )1.0()
(21+=
∑
附录A
培养基和试剂
A.1胰胨-亚硫酸盐-环丝氨酸（TSC）琼脂
A.1.1基础成分
胰胨15.0g
大豆胨 5.0g
酵母粉 5.0g
焦亚硫酸钠 1.0g
柠檬酸铁铵 1.0g
琼脂15.0g
蒸馏水900.0mL
pH7.6±0.2
A.1.2D-环丝氨酸溶液
溶解1gD-环丝氨酸于200mL蒸馏水，膜过滤除菌后，于4℃冷藏保存备用。
A.1.3制法
将基础成分加热煮沸至完全溶解，调节pH，分装到500mL烧瓶中，每瓶250mL，121℃高压灭菌15min，于50℃±1℃保温备用。
临用前每250mL基础溶液中加入20mL D-环丝氨酸溶液，混匀，倾注平皿。
A.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）
A.2.1成分
胰蛋白胨15.0g
L-胱氨酸0.5g
酵母粉 5.0g
葡萄糖 5.0g
氯化钠 2.5g
硫乙醇酸钠0.5g
刃天青0.001g
琼脂0.75g
蒸馏水1000.0mL
pH7.1±0.2
A.2.2制法
将以上成分加热煮沸至完全溶解，冷却后调节pH，分装试管，每管10mL，121℃高压灭菌15min。
临用前煮沸或流动蒸汽加热15min，迅速冷却至接种温度。
A.3缓冲动力-硝酸盐培养基
A.3.1成分
蛋白胨 5.0g
牛肉粉 3.0g
硝酸钾 5.0g
磷酸氢二钠 2.5g。