02 生物化学实验--酚试剂法(改良Lowry法)测定血清蛋白质含量
Lowry’s法(Folin-酚试剂法)
0.60 2.0
80
0.40 2.0
120
0.20 2.0
160
0.50 0.50 2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
注意事项
Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂 是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶 液。
故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后， 必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生 在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。
蛋白样品 混匀，
碱性铜试剂
放10min
注意事项
加酚试剂
即在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与 碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白 质- Cu2+复合物。
原理
第二步：Folin-酚显色反应 Folin-酚试剂在碱性条件下极不稳定，其
磷钼酸盐-磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈 蓝色反应(钼蓝和钨蓝的混合物)。由于蛋白质 中含有带酚羟基的酪氨酸( Tyr ) ，故有此显 色反应。
Lowry’s法（Folin-酚试剂法） 测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method
蛋白质含量测定方法汇总
实验七蛋白质含量测定
测定蛋白质的定量方法有很多，目前常用的有染料法，双缩脲(Biuret)法，酚试剂法(Lowry)法及紫外吸收法。
[目的要求]
1．掌握测定蛋白质的含量基本方法。
2．了解染料法、双缩脲法、Lowry法和紫外吸收法测定原理。
一、染料法
[实验原理]
在酸性溶液中染料考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，此时考马斯亮蓝G-250颜色从红色变为蓝色，吸收高峰从460nm移至595nm。利用这个原理可以测定蛋白质含量。
该法近年在某些方面有取代经典的Lowry法趋势，因为它操作简单，反应时间短，染料-蛋白质颜色稳定，抗干扰性强。本法的缺点是：对于那些与标准蛋白氨基酸组成有较大差异的蛋白质，有一定误差，因为不同的蛋白质与染料的结合是不同的，故该法适合测定与标准蛋白质氨基酸组成相近的蛋白质。
[器材]
吸量管；试管；721型分光光度计
[试剂]
1.标准牛血清白蛋白溶液：配成0.1mg/ml的溶液。
2.待测蛋白质溶液。
3.染料溶液：称取考马斯亮蓝G-2500.1g溶于95%的酒精50ml，再加入85%的浓磷酸100ml，用水稀释至1000ml,混匀备用。
[操作步骤]
按上表分别向各支试管内加入各种试剂，充分混匀，5min后在595nm波长处以0号管调零,测定各管吸光度值（A）。以吸光度值为纵坐标,蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。
2．样品测定：
取1ml样品溶液（约含25～250微克蛋白质），加入染料溶液5ml混匀，5min后测定其595nm吸光度值，对照标准曲线求得蛋白质浓度。
二、双缩脲(Biuret)法测定蛋白质含量
Folin-酚试剂法_Lowry法_测定蛋白质浓度
Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
标准牛血清清蛋白液0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 ——
待测血清——————0.5 0.9%NaCl 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 1.0 0.5
碱性铜溶液 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 混匀，放置10分钟，每管加酚试剂0.5ml，立即混匀，30分钟后，以第6管委空白管，在波长650nm比色，读取光密度。
以1~5管蛋白质浓度为横坐标，光密度为纵坐标，作图得标准曲线。画好后注明所用仪器型号、编号，所用波长，比色杯内经，标准蛋白的种类及浓度，测定方法及制作时间。
根据第7管光密度，由标准曲线找出其对应的浓度。并将样品的浓度单位换算成蛋白质（g）/100ml血清。
注：
1．在用碱性铜溶液处理后，蛋白质发色能力增加3~15倍。加铜处理对酪氨酸与色氨酸的发色能力的影响较小，本法所显颜色有1/4来源于双缩脲反应。
2．检样内蛋白质的含量应在300ug/ml以内，浓度如超出这个范围，反应不呈线性
关系。
3. 发色反应在30分钟即接近极限，在半小时至一小时内颜色略有增加，在1.5~6小时内颜色稳定不变，因此，最好在发色后1.5~6小时内比色。
[器材]
1.721型分光光度计
2.1.5×15cm 试管
3.坐标纸
4.刻度吸管：1. 0ml二支；0.5ml一支；
5.0ml一支。
5.微量加样器（500ul）
[试剂]
1.试剂A : 2% Na2CO3（用0.1N氢氧化钠溶液）。
2.试剂B : (1) 0.5% CuSO4·5H2O（用1％酒石酸钠溶液或酒石酸钾配制）
Lowry氏法测定蛋白质含量
蒸馏水(mL)
1.0 --
--ห้องสมุดไป่ตู้
待测蛋白质溶液(mL)
-- --
1.0
2. 各管加入试剂甲5ml混匀放置10分钟。 3.各管加入试剂乙0.5ml后立即混匀，37℃ 水浴30分钟后用500nm单色光比色测定。 4.计算 样品蛋白质含量（ug/ml）
结果与计算：
根据测定管光密度值计算血清蛋白质 含量，C测=A测*C标/C测
注意事项：
各管加酚试剂时必须快速，并立即摇匀，不应出现
混浊。
移液管使用前要看清楚刻度和是否写着快、吹，如
有则需要用洗耳球吹出剩余液体
进行测定时，加F olin—酚试剂时要特别小心，因
为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只 在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性 的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼 酸—磷钨酸试剂 被破坏之前，还原反应即能发生。
Lowry氏法测定蛋白质含量
The Lowry Method for Protein Quantitation
目的与要求：
掌握Lowry氏法测定蛋白质含量的
原理及方法；
掌握分光光度法
实验原理：
在碱性条件下蛋白质的肽键与Cu2+螯
合，形成蛋白质-铜复合物。（双缩脲反 应 Biuret Reaction）
实验二福林酚试剂法测定测定蛋白质的含量
• 附：乙试剂配制方法：
在2 升磨 口 回流 瓶 中 ， 加 入1 0 0 克钨 酸 钠 (Na2WO4· 2H2O）,25 克钼酸钠（ Na2MoO4· 2H2O）及 700 毫升蒸馏水，再加 50 毫升 85% 磷酸， 100 毫升浓盐酸， 充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束 时，加入150克 硫 酸 锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数 滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。 冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴 的步骤）。稀释至 1 升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中 保存。使用时用标准 NaOH 滴定，酚酞作指示剂，然后 适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
2、Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin －酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白 质作用生 成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试 剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使 还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之 前。
3、样品稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范 围之内，若超过此范围则需将样品酌情稀释。
五、 操作
• 1、标准曲线制作： 各吸取 0、0.2 0.4 0.6 0.8 1.0ml标准蛋白 液于带塞小试管，分别加入不同量的蒸馏水到 1ml ，各加5ml 试剂甲，混匀后室温下（25℃） 放10分钟，加入 0.5ml试剂乙，立即混匀，25℃ 左右反应30分钟，于500nm波长下测定消光值， 以OD500为纵坐标，含量为横坐标，绘出标准曲 线，（浓度低时可用OD750nm）
Lowry’s法(Folin-酚试剂法)
原理
1921年，Folin 首创，利用蛋白质分子中酪氨酸 和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸-磷 钼酸）起蓝色反应。
1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中 加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。
原理
第一步：双缩脲反应 在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)
能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这 个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含 有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩 脲反应。
Lowry’s法（Folin-酚试剂法） 测定蛋白质含量
Determination of protein content by Lowry‘s method
怎样测定血清中蛋白质的含量
蛋白质含量测定的常用方法比较
方法
灵敏度
优点
凯氏定氮法
0.2~ 1.0mg氮 干扰少， 准确
紫外吸收法
50～100mg 快速简便 无损样品
40
0.60 2.0
80
0.40Βιβλιοθήκη Baidu2.0
120
0.20 2.0
160
0.50 0.50 2.0
未知
各管混匀，室温放置10min。 向各管内加入Folin-酚试剂0.20mL, 2s内迅速混匀！ 40℃放置10min。 冷却至室温后，以500nm波长比色，用1号管作空白，读取各管吸光度。
实验四福林—酚试剂法测定血清总蛋白
标准管对照法
选一管与待测管吸光度相近的作为标准
管，根据公式计算：
待测血清蛋白含 量=
（g/L）
A待测 ×C标准 × V标准 ×500
A标准
V待测
注： V标准为标准管加入标准蛋白质的体积 V待测为待测管加入的待测血清的体积
实验结果
标准管
待测管
管号 OD660nm
1Βιβλιοθήκη Baidu
2
3
4
5
6
7
0 0.121 0.250 0.335 0.440 0.525 0.320
ε：摩尔吸光系数 A：物质的吸光度 l：液层的厚度 c：溶液的浓度
标准曲线法
在分光光度计测定范围内，配制一系列已知不 同浓度的标准溶液，在特定波长条件下分别测出 其吸光度值。以吸光度值为纵坐标，相应的溶液 浓度为横坐标在坐标纸上作出一条吸光度与浓度 成正比，并且通过原点的直线，即标准曲线，也 称C-A曲线
实验四
福林—酚试剂法测定血清总蛋白
实验目的
学习测定蛋白质浓度的测定方法
学习绘制标准曲线及用标准曲线求 待测物质含量的方法
实验原理
蛋白质浓度测定 双缩脲法 微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法 紫外吸收法
双缩脲法测定蛋白质
H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2
双缩脲反应：
实验 Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
实验Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
一、实验目的
1、掌握Lowry法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。
2、掌握分光光度计的基本原理及相关操作。
二、实验原理
蛋白质在碱性溶液中其肽键与Cu2+螯合，形成蛋白质-铜复合物，与铜络合的蛋白质中所含的酪氨酸和色氨酸残基，使磷钼酸-磷钨酸（Folin-酚试剂）还原，产生蓝色化合物，在一定条件下，利用蓝色深浅与蛋白质浓度的线性关系作标准曲线并测定样品中蛋白质的浓度。
三、实验器材
试管、刻度吸管、分光光度计、坐标纸、微量加样器
四、实验试剂
1、试剂A为2% Na2CO3（用0.1mol/L的NaOH配制）
2、试剂B为1% CuSO4·5H2O
3、试剂C为2% 酒石酸钠或酒石酸钾
4、试剂D为碱性铜溶液——用50份试剂A、1份试剂B和1份试剂C混合配制而成。混合后的溶液一日内有效。
5、Folin-酚试剂
6、标准牛血清清蛋白溶液
准确称取牛血清蛋白0.4 g，溶于100mL 0.9% NaCl溶液中，稀释10倍后使用。
7、0.9% NaCl溶液
8、待测血清样本
五、实验操作
在波长650 nm比色，读取吸光度。
以1 ~ 5管蛋白质浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，作图得标准曲线。画好后注明所用
仪器型号、编号，所用波长，比色杯内径，标准蛋白的种类及浓度，测定方法及制作日期。
根据第7管吸光度，由标准曲线找出其对应的浓度。并将样品的浓度单位换算成蛋白质(g)/100mL 血清。
六、注意事项
1、在用碱性铜溶液处理后，蛋白质发色能力增加3 ~ 15 倍。加铜处理对酪氨酸与色氨酸的发色能力的影响较小，本法所显颜色有1/4来源于双缩脲反应。
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量生物化学实验报告册模板
生物化学实验报告
姓名：
学号：
专业年级：
组别：
生物化学与分子生物学实验教学中心
实验名称Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
实验日期实验地点
合作者指导老师
评分教师签名批改日期
一、实验目的
1.掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理及其实验操作技术。
2.掌握制作标准曲线的要领和通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量的方法。
二、实验原理
1.双缩脲反应
在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。
2.Folin-酚显色反应
蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
3.在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比色即可求出蛋白质的含量，即可根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。
三、材料与方法：
1.材料：
①样品：健康人血清（300倍稀释）；正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L
②试剂：牛血清白蛋白标准液（200μg/ml）；碱性硫酸铜溶液（当日有效）；Folin-酚试剂
③仪器与器材：V-1100分光光度计；恒温水浴箱；试管6支、试管架；
加样枪、加样枪架；坐标纸
试剂 1 2 3 4 5 6 牛血清白蛋白标准液- 0.2 0.4 0.6 0.8 - 样品液（稀释300倍）- - - - - 0.5 蒸馏水 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.5 碱性硫酸铜 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 2.0 蛋白质浓度（μg/ml）0 40 60 80 160 未知
改良Lowry氏法测定蛋白质含量
改良Lowry氏法测定蛋白质含量
[原理]
蛋白质分子中含有带酚基的酪氨酸，在碱性条件下其肽链与Cu2+ 螯合，形成蛋白质-铜复合物，此复合物中酪氨酸极易使酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸还原，生成蓝色化合物（钼蓝和钨蓝混合物）。蓝色深浅与蛋白质含量成正比的关系可绘制标准曲线，测出样品中蛋白质的含量。
[试剂]
1．蛋白质标准溶液（0.16mg/L）：取80g/L牛血清白蛋白作500倍稀释。取已标定的牛血清白蛋白8mg，用0.9%NaCl稀释至50ml。
2．碱性铜溶液：
甲液：取Na2CO32g溶于0.1mol/L NaOH100ml中。
乙液：取CuSO4·5H2O 0.5g溶于1%酒石酸钾100ml中。
取甲液50ml、乙液1ml混合，此液需临用前配制。
3．酚试剂：取Na2WO4·2H2O 100g和Na2MoO4·2H2O 25g溶于蒸馏水700ml中，再加85% H3PO4 50ml和浓HCl 100ml充分混匀后，置1500ml圆底烧瓶中温和地回流10小时。冷却，取下冷凝装置，加入硫酸锂（Li2SO4·H2O）150g，蒸馏水50ml及溴水数滴。再煮沸15分钟以除去多余的溴。因溴气甚毒，这一步骤应在通风橱中进行。冷却后稀释至1000ml，然后过滤，溶液呈黄色或金黄色（如带绿色则不能用）。贮于棕色试剂瓶中，临用前，取酚试剂5.0ml，加蒸馏水约50ml，以酚酞为指示剂，以1mol/L NaOH溶液进行滴定，求出酚试剂的当量浓度。然后根据此浓度，将酚试剂用蒸馏水稀释成1mol/L。
4. 0.9% NaCl：
02 实验二 蛋白质的定量测定方法
实验二. 蛋白质的定量测定方法
一、Folin-酚试剂法(Lowry法)
【实验目的】
1.学习Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理。
2.掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。
【实验原理】
蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+复合物；第二步：蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。该呈色反应在30分钟内即接近极限，并且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25-100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(5-25μg)在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。
Folin-酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。
【实验材料】
1.实验器材
100毫升容量瓶 2只；移液管 1毫升4支，5毫升2支；721型分光光度计。
2.实验试剂
(1) Fo1in-酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50ml 0.lmol／L氢氧化钠溶液中，再把0.5g硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶于100m1 1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后将前者50ml与后者lml 混合。混合后1日内使用有效。
Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度
7
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二、实验原理
蛋白质浓度测定 微量凯氏定氮法 双缩脲法 Folin-酚试剂法 考马斯亮蓝染色法 紫外吸收法
8
• 常用方法： ① 考马斯亮蓝法(有色)： 10~1000 ug/ml ② 紫外分光光度计法(无色)：100~500 ug/ml
2/3体积，不宜过多或过少；若不慎使溶液流至比色杯外， 须用棉花或擦镜纸吸干，才能放入比色架。比色杯用后应 立即用自来水冲洗干净。 3. 测定溶液浓度的吸光度值在0.1~0.8之间最符合光吸收定律， 线性好、读数误差较小。
18
➢实验名称 ➢ 摘要（目的、方法、结果、结论） ➢ 实验目的 ➢ 实验原理 ➢ 操作要点（主要步骤） ➢ 实验结果 ➢ 结论和讨论 （结果分析、思考题等）
酚试剂/ml
空白
标准
-
0.4
-
-
1.0
0.6
5.0
5.0
混合均匀，室温10min
0.5
0.5
待测
_ 1.0 5.0
0.5
各管充分混合均匀，置于室温放置30min, 以空白管调零， 波长650nm 比色，分别读取各管吸光度值。取三次测定的 平均值，根据公式（P156）计算出待测蛋白浓度。
13
3. 722型分光光度计的使用
实验一 蛋白质的定量测定 Lowry法
一、 实验目的
1、 熟悉改良Lowry法测定血清蛋白质含量的原理。
2 、掌握直接比色法和标准曲线法的应用。
3 、熟悉分光光度计的使用。
二、 实验原理
考马斯亮蓝法 紫外分光光度法 பைடு நூலகம்owry法
二、 实验原理
蛋白质
碱性铜试剂
肽键
酪氨酸、色氨酸等 紫红色蛋白质-铜的络合物 氨基酸残基
酚试剂
蓝紫色溶液
A=KLC
直接比色法
标准曲线法
三、 实验步骤
试剂（ml） 标准蛋白溶液
（250μg/ml）
1
2
3
4
5
6
测 定 管
稀释血清
标 准 管
空 白 管
1.0
5.0
0.2 0.8
5.0
0.4 0.6
5.0
0.6 0.4
5.0
0.8 0.2
5.0
1.0 5.0
1.0
0.4 0.6
5.0
1.0
5.0
0.9% NaCl
碱性铜试剂
5.0
混匀，37℃ 保温20 分钟 酚试剂 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
混匀，37℃ 保温30分钟
四、 结果与分析
血清蛋白质含量的计算
生化实验报告 福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度
生化实验报告福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度
实验目的：
利用福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度。
实验原理：
福林-酚试剂法是一种常用的蛋白质定量方法。该方法利用在碱性条件下，蛋白质和福林-酚试剂在高温下反应生成可溶性淡红色复合物，其最大吸收峰位于560 nm。该复合物的吸光度与蛋白质的浓度呈线性关系，可以通过比较不同浓度蛋白质标准溶液的吸光度来测定待测蛋白质的浓度。
实验步骤：
1. 准备蛋白质标准溶液：称取不同浓度的蛋白质标准溶液（如1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL等）分别加入福林-酚试剂，使得最终浓度为0.2 mg/mL，并用称重瓶搅拌均匀。
2. 制备待测蛋白质样品：将待测蛋白质样品溶解在适量的缓冲液中，使其浓度在标准曲线的线性范围内。
3. 加入福林-酚试剂：取相同体积的蛋白质标准溶液和待测蛋白质样品分别加入福林-酚试剂，并用试管架将其放入预热至60°C的水浴中反应15分钟。
4. 冷却：将试管从水浴中取出，放置到冰水中冷却至室温。
5. 测定吸光度：使用分光光度计将各个标准溶液和待测样品的吸光度分别置于560 nm处测量。
6. 建立标准曲线：依次将标准溶液的吸光度值绘制于纵轴，浓度值绘制于横轴，得到标准曲线。
7. 测定样品浓度：根据待测样品的吸光度值和标准曲线，确定其蛋白质浓度。
实验注意事项：
1. 确保福林-酚试剂无色，否则应更换新的试剂。
2. 需要在60°C的水浴或恒温器中对试剂进行反应，确保反应
温度稳定。
3. 温度过高或过低都会影响测定的准确性，应控制好试管在水浴中的时间。
4. 标准曲线的制备需要使用不同浓度的标准溶液，并且至少应包含一组空白对照组。
实验1Folin酚试剂法测蛋白质含量教案
注意事项
Folin-酚试剂在酸性条件下较稳定，而碱性硫酸铜试剂 是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜-蛋白质溶 液。
故当Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中后， 必须立即混匀（加一管混匀一管），使还原反应发生 在磷钼酸-磷钨酸试剂被破坏之前。
蛋白样品 混匀，
碱性铜试剂
放10min
注意事项
怎样测定血清中蛋白质的含量
蛋白质含量测定的常用方法比较
方法
灵敏度
优点
凯氏定氮法
0.2~ 1.0mg氮 干扰少， 准确
紫外吸收法
50～100mg 快速简便 无损样品
考马斯亮蓝法 （Bradford）法 双缩脲法
1～5ug 1～20mg
灵敏、简 便、快速
干扰相对 少，较快
Lowry法
20～250ug 灵敏度高
1951年，Lowry对此法进行了改进，先于标本中 加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。
原理
第一步：双缩脲反应 在碱性溶液中,双缩脲(H2NOC－NH－CONH2)
能与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物,这 个反应叫做双缩脲反应。由于蛋白质分子中含 有与双缩脲结构相似的多个肽键, 因此有双缩 脲反应。
即蛋白质- Cu2+复合物中所含的酪氨酸或 色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸， 生成蓝色的化合物。
Folin-酚试剂法测定蛋白质含量
Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量
实验目的
掌握Folin- 酚试剂法测定蛋白质含量的原理、操作技术
掌握制作标准曲线的要领，并通过标准曲线求样品溶液中待测定物质含量。提高在严格时间限定下的实验操作能力。
二、实验原理
蛋白质分子中酪氨酸可以和色氨酸残基（酚基）还原酚试剂（磷钨酸- 磷钼酸）起蓝色反应，此法由folin 在1921 年开创。
1951年，Lowry 对此法进行了改进，先于标本中加碱性铜试剂，再与酚试剂反应，提高了灵敏度。
第一步：双缩脲反应
在碱性溶液中,双缩脲（H2NOC－NH－CONH2能）与Cu2+作用,形成紫色或紫红色的络合物。即在碱性溶液中，蛋白质分子中的具有双缩脲结构的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+ 作用生成紫红色的蛋白质- Cu2+复合物。
第二步：Folin- 酚显色反应
Folin- 酚试剂在碱性条件下极不稳定，其磷钼酸盐- 磷钨酸盐易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钼蓝和钨蓝的混合物）。蛋白质- Cu2+复合物中所含的带酚羟基的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。
在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故与同样处理的蛋白质标准液比较即可求出样品中蛋白质的含量。
三、实验材料
（一）样品
健康人血清（300倍稀释，正常人血清蛋白质含量：60~80 g/L ）
（二）试剂
牛血清白蛋白标准液（200μg/ml ），碱性硫酸铜溶液，Folin- 酚试剂
（三）仪器与器材
V-1100分光光度计，恒温水浴箱，移液管（2mL），洗耳球，试管6 支，试管架，加样枪，加样枪架
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酚试剂法（改良 Lowry 法）测定血清蛋白质含量【目的】
1 ．掌握酚试剂法测定蛋白质含量的含量与操作技术。
2 ．熟悉标准曲线的制作方法和分光光度计的应用。
【原理】
蛋白质分子中所含的肽键在碱性溶液中与 Cu 2+ 络合产生紫红色化合物 ( 双缩脲反应 ) ，同时使肽链展开，其中带有酚基的酪氨酸残基充分暴露，后者在碱性条件下使酚试剂中磷钨酸 - 磷钼酸还原，生成钼蓝和钨蓝的化合物，其蓝色深浅与蛋白质含量成正比，与已知浓度的标准蛋白质溶液进行比色，即可计算出测定样品中蛋白质的含量。
酚试剂法测定样品中蛋白质的含量，其特点为方法简便，灵敏度高，能够测定
2 ～100 μ g 的微量蛋白质。其方法比凯氏定氮法操作简便，其灵敏度比双缩脲法高 100 倍左右。因此经常被用于科研与临床检验。
【器材】
1 ．座标纸
2 ． 50ml 容量瓶
3 ． 722 型分光光度计
【试剂】
1 ．碱性铜试剂
甲液称取无水碳酸钠 2 . 0g ，溶于 0 . 1mol ／ L 氢氧化钠溶液 100ml 中。
乙液取硫酸铜(CuSO 4 ·5H 2 O) 0 . 5g 溶于 1 ％酒石酸钾溶液 100ml 中。
临用前取甲液 50ml, 乙液 1ml 混合，即为碱性铜试剂。
2 ．标准蛋白质溶液 ( 0.25g /L)
准确称取结晶人血清清蛋白 25mg ，溶于 0 . 9 ％氯化钠溶液中，以容量瓶定容至 100ml 。
3 ． 0 . 9 ％氯化钠溶液
4 ．酚试剂（有成品出售）
取钨酸钠(Na 2 WO 4 ·2H 2 O) 100g 和钼酸钠(Na 2 MO 4 ·2H 2 O) 25g , 溶于 700ml 蒸馏水中，再加入 85 ％磷酸 50ml 和浓盐酸 100ml 混合，置于1500ml 圆底烧瓶中温和地回流 10h ，回流结束后加入硫酸锂(LiSO 4 ·H 2 O) 150g ，水 50ml ，溴 3 ～ 4 滴，除去回流装置，继续沸腾 15min ，以除去剩余的溴，冷却后稀释至 1000ml ，过滤，溶液应呈黄色或金黄色 ( 如带绿色者不能使用，应继续加溴煮沸 ) 。试剂配置好后置于棕色瓶中保存。使用前，以酚酞为指示剂，用 0 . 1mol ／ LNaOH 溶液滴定，求出酚试剂的摩尔浓度。然后根据此浓度，将酚试剂用蒸馏水稀释至最后浓度为 1mol ／ L ( 滴定时可将酚试剂稀释，以免颜色影响 ) 。试剂放置过久，变成绿色时，可再加溴数滴煮沸 15 分钟，如能恢复原有的金黄色仍可继续使用。
【操作】
1 ．标准曲线的制备
取试管 6 支编号，按下表进行操作
混匀，室温放置 30 min 后，以第 1 管为空白管调零点，在波长 650nm 比色，分别读取各管吸光度值。以蛋白质浓度为横座标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线。
2 ．血清蛋白质测定
取血清 0 . 1ml ，置于 50ml 容量瓶中，用 0 . 9 ％氯化钠溶液稀释至刻度处，混匀，此为待测血清样品。另取 3 支试管，标明测定管，标准管、空白管，按下表进行操作：
酚试剂 5 . 0 5 . 0 5 . 0
混匀，室温放置 30 分钟后，在波长 650nm 比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。
【计算】
1 ．标准曲线法
以测定管吸光度值查标准曲线，求得稀释血清蛋白质含量，再乘 500 即得血清蛋白质含量（ g/L ）。
2 ．标准管法
【注意事项】
1 ．各管加入酚试剂后应立即摇匀，不应出现浑浊。
2 ．碱性铜试剂必须新鲜配制。
3 ．本实验对不同蛋白质定量变动较大，凡具有还原性的物质对此实验都有干扰。
4 ．本法测定血清蛋白质含量正常值为 7 ～ 10g /dl 。
【思考题】
1 ．试述标准曲线法与标准管法定量蛋白质的优缺点。
2 ．试述酚试剂法（改良 Lowry 法）测定血清蛋白质含量的优缺点。