02 生物化学实验--酚试剂法(改良Lowry法)测定血清蛋白质含量

酚试剂法（改良 Lowry 法）测定血清蛋白质含量【目的】
1 ．掌握酚试剂法测定蛋白质含量的含量与操作技术。

2 ．熟悉标准曲线的制作方法和分光光度计的应用。

【原理】
蛋白质分子中所含的肽键在碱性溶液中与 Cu 2+ 络合产生紫红色化合物 ( 双缩脲反应 ) ，同时使肽链展开，其中带有酚基的酪氨酸残基充分暴露，后者在碱性条件下使酚试剂中磷钨酸 - 磷钼酸还原，生成钼蓝和钨蓝的化合物，其蓝色深浅与蛋白质含量成正比，与已知浓度的标准蛋白质溶液进行比色，即可计算出测定样品中蛋白质的含量。

酚试剂法测定样品中蛋白质的含量，其特点为方法简便，灵敏度高，能够测定
2 ～100 μ g 的微量蛋白质。

其方法比凯氏定氮法操作简便，其灵敏度比双缩脲法高 100 倍左右。

因此经常被用于科研与临床检验。

【器材】
1 ．座标纸
2 ． 50ml 容量瓶
3 ． 722 型分光光度计
【试剂】
1 ．碱性铜试剂
甲液称取无水碳酸钠 2 . 0g ，溶于 0 . 1mol ／ L 氢氧化钠溶液 100ml 中。

乙液取硫酸铜(CuSO 4 ·5H 2 O) 0 . 5g 溶于 1 ％酒石酸钾溶液 100ml 中。

临用前取甲液 50ml, 乙液 1ml 混合，即为碱性铜试剂。

2 ．标准蛋白质溶液 ( 0.25g /L)
准确称取结晶人血清清蛋白 25mg ，溶于 0 . 9 ％氯化钠溶液中，以容量瓶定容至 100ml 。

3 ． 0 . 9 ％氯化钠溶液
4 ．酚试剂（有成品出售）
取钨酸钠(Na 2 WO 4 ·2H 2 O) 100g 和钼酸钠(Na 2 MO 4 ·2H 2 O) 25g , 溶于 700ml 蒸馏水中，再加入 85 ％磷酸 50ml 和浓盐酸 100ml 混合，置于1500ml 圆底烧瓶中温和地回流 10h ，回流结束后加入硫酸锂(LiSO 4 ·H 2 O) 150g ，水 50ml ，溴 3 ～ 4 滴，除去回流装置，继续沸腾 15min ，以除去剩余的溴，冷却后稀释至 1000ml ，过滤，溶液应呈黄色或金黄色 ( 如带绿色者不能使用，应继续加溴煮沸 ) 。

试剂配置好后置于棕色瓶中保存。

使用前，以酚酞为指示剂，用 0 . 1mol ／ LNaOH 溶液滴定，求出酚试剂的摩尔浓度。

然后根据此浓度，将酚试剂用蒸馏水稀释至最后浓度为 1mol ／ L ( 滴定时可将酚试剂稀释，以免颜色影响 ) 。

试剂放置过久，变成绿色时，可再加溴数滴煮沸 15 分钟，如能恢复原有的金黄色仍可继续使用。

【操作】
1 ．标准曲线的制备
取试管 6 支编号，按下表进行操作
混匀，室温放置 30 min 后，以第 1 管为空白管调零点，在波长 650nm 比色，分别读取各管吸光度值。

以蛋白质浓度为横座标，吸光度值为纵座标，绘制标准曲线。

2 ．血清蛋白质测定
取血清 0 . 1ml ，置于 50ml 容量瓶中，用 0 . 9 ％氯化钠溶液稀释至刻度处，混匀，此为待测血清样品。

另取 3 支试管，标明测定管，标准管、空白管，按下表进行操作：
酚试剂 5 . 0 5 . 0 5 . 0
混匀，室温放置 30 分钟后，在波长 650nm 比色，以空白管调零点，读取各管吸光度值。

【计算】
1 ．标准曲线法
以测定管吸光度值查标准曲线，求得稀释血清蛋白质含量，再乘 500 即得血清蛋白质含量（ g/L ）。

2 ．标准管法
【注意事项】
1 ．各管加入酚试剂后应立即摇匀，不应出现浑浊。

2 ．碱性铜试剂必须新鲜配制。

3 ．本实验对不同蛋白质定量变动较大，凡具有还原性的物质对此实验都有干扰。

4 ．本法测定血清蛋白质含量正常值为 7 ～ 10g /dl 。

【思考题】
1 ．试述标准曲线法与标准管法定量蛋白质的优缺点。

2 ．试述酚试剂法（改良 Lowry 法）测定血清蛋白质含量的优缺点。