基因工程实验讲义

项目名称大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达第一部分实验目的1．了解原核基因克隆与筛选的全过程与实验设计策略、载体的基本结构、基因工程酶（限制性内切酶、连接酶、Taq酶）的各种特性、DNA重组以及重组子筛选与鉴定的相关技术；2．理解基因克隆与筛选的策略及其相关实验原理、碱裂解法质粒提取过程中各种纯化步骤的设计思想，PCR引物设计以及PCR体系设计的原则与注意事项、DNA重组时设计酶切与连接方案的一般规律、重组DNA导入受体细胞方法以及目的重组子的筛选与鉴定方法、影响DNA重组效率的因素；3．掌握质粒DNA的提取与定性定量分析、琼脂糖凝胶电泳、PCR基因扩增及扩增产物回收、核酸的限制性酶切与连接、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化、目的重组子筛选与鉴定等各项基本实验技术方法的基本原理与操作技能。

第二部分实验背景据统计，全世界的盐碱地约占陆地面积的三分之一，我国有大约1亿亩盐碱化耕地。

随着人口的不断增加和现代工业的发展，人均耕地面积日趋减少。

因此，如何开发利用广阔的盐碱地来发展农业生产、提高粮食等作物的产量已经成为政府和科学家必须直面的迫切问题。

盐胁迫是盐碱地抑制植物生长、降低农作物产量的最重要环境因素之一。

长期以来，如何提高植物的耐盐性、增加盐胁迫下农作物的产量一直受到政府和科学家的关注。

深入研究植物对盐胁迫的反应机制和耐盐机理是改造植物、提高其耐盐性的前提。

其中，通过转耐盐基因提高植物耐盐性是一条日益受重视的途径。

研究表明，有些植物在受到盐胁迫时，为消除由盐胁迫所造成的不平衡，会在体内合成和积累一定浓度的小分子量、无毒性的渗透保护剂（如甜菜碱、脯氨酸、海藻糖、山梨醇及甘露醇等），来提高细胞内渗透压，降低Na对酶活性的抑制，增加酶的热稳定性，阻止酶复合物的解离。

这些渗透保护剂还可以清除活性氧，从而有助于植物耐冷害、冻害、高温及干旱等胁迫，广泛存在于细菌、藻类和动植物中。

这类物质对于细胞耐高渗环境起着重要作用。

其中甘露醇和山梨醇属糖醇类物质，其生物合成的关键酶为甘露醇-1-磷酸脱氢酶(MTLD)和山梨醇-6-磷酸脱氢酶(GUTD)。

将负责这些小分子渗透调节物合成的关键酶基因引入植物后，能够起到一定的耐盐作用。

因此，可以通过基因工程的方法使这类植物超量表达甜菜碱、脯氨酸和甘露醇等渗透保护剂，从而提高其耐盐胁迫能力。

本实验项目根据大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶（mannitol-1-phosphate dehydrogenase，MTLD）基因序列设计一对引物，应用聚合酶链式反应（PCR）方法，从大肠杆菌E. coli JM109菌株的基因组中扩增获得甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因序列，该基因序列开放阅读区全长1146 bp，编码由382个氨基酸组成、分子量约为41 kDa。

扩增产物经定向克隆连接到原核表达载体pET-28a(+)，构建重组表达质粒pET-28a(+) /MTLD，并转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞，以期获得能大量表达生产甘露醇-1-磷酸脱氢酶的重组体克隆。

本实验项目从大肠杆菌菌株中克隆MTLD基因，将其构建到原核表达载体上后实现高效表达，从而为通过基因工程方法培育耐盐作物奠定基础。

第三部分实验总体流程第四部分实验内容实验一大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳鉴定1．实验原理基因组DNA的提取通常用于PCR模板、Southern杂交、构建基因组文库（包括RFLP）等。

不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA提取方法有所不同；同种生物的不同各种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。

无论何种生物基因组DNA，其提取方法基本可分为两步：先是温和裂解细胞及溶解DNA，接着采用化学或酶学的方法，去除蛋白、RNA及其它大分子，再用乙醇沉淀出DNA。

常用的经典提取方法有CTAB法和SDS法。

提取基因组DNA总的原则包括：（1）保证核酸一级结构的完整性；（2）其它生物大分子，如蛋白质、多糖、酚类、脂类分子的污染应尽量降到最低；（3）核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；（4）其它核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

本实验中细菌基因组的提取采用天根生化科技有限公司的DP302细菌基因组提取试剂盒。

该试剂盒可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统提取细菌的基因组DNA。

离心吸附柱中采用的硅基质材料能够高效、专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。

提取的基因组DNA 片段大、纯度高，质量稳定可靠。

基因组DNA的提取用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，电泳分离后的DNA用溴化乙啶染色，在254nm波长紫外光检测DNA的提取情况。

2．实验用品(1) 材料本实验所用的大肠杆菌为E. coli JM109菌株，以甘油菌形式-20℃冰箱保存。

(2) 试剂1)天根生化科技有限公司的DP302细菌基因组提取试剂盒。

包括缓冲液GA、缓冲液GD、缓冲液GB、漂洗液PW、洗脱缓冲液TE、蛋白酶K、吸附柱CB3、收集管。

2)10×TBE电泳缓冲液：称取Tris54g，硼酸27.5g，并加入0.5mol/LEDTA(pH8.0) 20mL，定容至1000mL。

3)6×上样缓冲液：0.25%溴酚蓝，40%（w/v）蔗糖水溶液。

4)EB溶液母液：将EB配制成10mg/mL，用铝箔或黑纸包裹。

5)DL2,000TM DNA Marker （TaKaRa公司）：本Marker为已含有1×LoadingBuffer的DNA溶液，可取5μL直接电泳。

（3）仪器超净工作台、恒温振荡仪、高压灭菌锅、pH计、高速离心机、移液枪、水平电泳仪、电泳仪电源、凝胶成像系统、电炉。

3．实验步骤（1）大肠杆菌活化和培养取4微升大肠杆菌E. coli JM109甘油菌接入4mL LB液体培养基中，37℃培养过夜进行活化。

将活化好的菌按照1：100接入锥形瓶中，37℃培养4小时使之进入对数生长期。

（2）基因组DNA的提取1）取细菌培养液1-5mL，10000rpm离心1分钟，尽量吸净上清。

2）向菌体沉淀中加入200μL缓冲液GA，振荡至菌体彻底悬浮。

3）向管中加入20μL蛋白酶K溶液，混匀。

4）加入220μL缓冲液GB，振荡15秒，70℃放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

注意：加入缓冲液GB时可能会产生白色沉淀，一般70℃放置时会消失，不会影响后续实验。

如溶液未变清亮，说明细胞裂解不彻底，可能导致提取DNA量少和提取出的DNA不纯。

5）加220μL无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

6）将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7）向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8）向吸附柱CB3中加入700μL漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

9）向吸附柱CB3中加入500μL漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

10）将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2分钟，倒掉废液。

将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应实验。

11）将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中。

注意：为增加基因组DNA的得率，可将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2分钟，12000rpm离心2分钟。

洗脱缓冲液体积不应少于50μL，体积过小影响回收效率。

（3）DNA的琼脂糖凝胶电泳用1%琼脂糖凝胶电泳检查DNA的提取情况。

样品贮存在-20℃冰箱中备用。

具体步骤如下：1)琼脂糖凝胶液的制备：称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100mL1×TBE电泳缓冲液，瓶口倒扣一个小烧杯或包一层保险膜，于电炉加热。

琼脂全部融化后取出摇匀，即为1%琼脂。

（也可加溴化乙啶2.5μL）2)凝胶板的制备：置水平板于工作台面上，将样品槽模板（梳子）插进水平板上凹槽内，距一端约0.5cm。

梳子底边与水平板表面保持0.5-1mm的间隙。

待琼脂糖冷至65℃左右，小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开在水平板表面形成一层约3mm厚均匀胶层。

液内不存有气泡。

室温下静置0.5－l小时，待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽。

3)加样：将DNA样品液与溴酚蓝-甘油溶液以5：1的体积比混合，用移液枪分别加人到凝胶板的加样槽内。

每个糟加10μL左右。

加样量不宜太多，避免样品过多溢出，污染邻近样品。

加样时注射器针头穿过缓仲液小心插人加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内让其集中沉于槽底部。

DNA Marker取5μL直接进行加样。

4)电泳：加样完毕，靠近样品槽一端连接负极，另一端连接正极，接通电源，开始电泳。

控制电压降不高于5V／cm（电压值V／电泳板两极之间距离比）。

当染料条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。

5)染色：将电泳后的胶取出，小心椎至0.5μL／mL溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min。

6)观察：小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，再将胶板推至凝胶成像系统的样品板上，在紫外灯下进行观察。

DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带，拍照记录下电泳图谱。

4. 注意事项1)菌体培养过程要严格无菌，染菌后提取得到的基因组会成多条带。

2)基因组提取过程中所使用的器材要严格灭菌，防止核酸酶降解基因组。

3)溴乙锭是DNA诱变剂，配制和使用EB染色液时，应戴乳胶手套，并且不要将该溶液洒在桌面或地面上。

凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品，必须经专门处理后，才能进行清洗或弃去。

4)加样量的多少决定于加样槽最大容积。

加人样品的体积应略少于加样槽容积。

对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。

5. 实验结果分析所提DNA的电泳图结果。

6. 思考题1．琼脂糖凝胶电泳时，应注意哪些问题？2．如果提取的DNA中含有蛋白质和RNA污染，应如何解决？3．如果提取的DNA产量较低，分析原因并提出解决办法。

实验二PCR法扩增大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因及PCR产物的纯化1. 实验原理聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction），简称PCR，1983年由Dr. Kary B. Mullis发明，是一种选择性的体外扩增DNA或RNA的分子生物学技术。