鸡卵类粘蛋白的提取及活性和分子量测定

鸡卵类粘蛋白的分离纯化、活性及分子量测定

王娇红王璟璐栗晓飞郭迎会

（河北大学生命科学学院2009生物工程，河北保定,071002）

摘要：目的对鸡卵类粘蛋白的抑制胰蛋白酶的抑制活性、分子量、及在有机溶剂中沉淀的情况进行测定，进而加深对其性质及应用的了解，同时，掌握蛋白质提取、分离纯化及性质测定技术。方法通过有机溶剂沉淀蛋白质得类粘蛋白粗品，离子交换柱层析纯化蛋白质得其纯品，BAEE法测类粘蛋白抑制胰蛋白酶的抑制的活性，SDS-PAGE测分子量。结果经粗提得CHOM粗品12.9mL,得CHOM纯品2.8mL,加入类粘蛋白吸光值减少，鸡卵类粘蛋白在电泳行为上呈现不均一行。结论 CHOM在中性或酸性环境中稳定，在50%丙酮或10%三氯乙酸中有较好的溶解度，是胰蛋白酶的抑制剂，CHOM是鸡卵清中含有的一种糖蛋白，有微不均一行。

关键词：鸡卵类粘蛋白胰蛋白酶分离纯化

中图分类号：Q5-33 文献标志码：A

The separation、purification and activity and molecular weight determination of CHOM Wang Jing-lu, Wang Jiao-hong, Li Xiao-fei, Guo Ying-hui

（College of Life Hebei University 2009 Bioengineering, Hebei Baoding，071002）Abstract: Objective Validate the characters of CHOM, then make a further digestion of its character and usage. At the same time, command the technology of purification and determination of protein. Methods Get the rough CHOM via depositing impure proteins by using organic solvent. Get the pure CHOM via ion-exchange column chromatography. Use the BAEE method to determine the activity of CHOM. Use SDS-PAGE to determine the molecular weight of CHOM. Results Get the rough CHOM about 12.9mL, the pure CHOM about 2.8mL. After putting CHOM into the solution of BAEE and trypsin, the absorbency declines. CHOM has a little difference on electrophoresis. Conclusion CHOM is steady in the neutral or acidic surroundings and has a good solubility in 50% acetone or 10% TCA. It is the inhibition of trypsin. CHOM is a kind of glycoprotein in the egg white which has a little difference.

Keywords：chicken ovomucoid trypsin purification

前言

鸡卵类粘蛋白是鸡卵清中含有的一种糖蛋白，除对牛和猪的胰蛋白酶有强烈的抑制作用外，对枯草杆菌蛋白酶也有一定的抑制作用，但对胰凝乳蛋白酶无抑制作用，对人的胰蛋白酶也无明显抑制作用，因此常用于胰蛋白酶酶学性质的研究。在pH7.8～8.0碱性条件下，CHOM可可逆性的结合胰蛋白酶，以CHOM为配基制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术对胰蛋

白酶进行分离纯化。为加深对CHOM的相关性质的理解和掌握，进而在现有基础充分利用相关技术，并发现或开拓其新的应用，进行了此项试验。

本论

1 试剂与器材

1.1 粗提所需试剂

三氯乙酸-丙酮溶液（0.5MTCA与丙酮的体积比为1:4），丙酮,0.20. 2 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液pH6.5磷酸盐缓冲液。

1.2 纯化所需试剂

0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液，0. 2 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液，DEAE-纤维素，0.5mol/L氯化钠-0.5mol/L氢氧化钠溶液，0.5mol/L盐酸，0.3 mol/L氯化钠-0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液，1.0 mol/L 氯化钠-0.02 mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液，蔗糖。

1.3 胰蛋白酶活力及类粘蛋白抑制活力测定试剂

0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液，BAEE-0.05mol/L pH8.0 Tris-HCl缓冲液(每毫升Tris-Hcl缓冲液汗0.3mg BAEE和2.22mg氯化钙)，胰蛋白酶溶液(10ug/mL)

1.4 SDS-PAGE测定分子量所需试剂

胶母液：30%Acr-0.8%Bis贮液，Acr150克，Bis4克定容至500毫升。

pH8.7Tris-Hcl缓冲液：Tris92克，1mol/L HCl120 mL,TEMED2.5 mL,10%SDS 3mL，加蒸馏水溶解，定容至500mL。

pH6.7Tris-Hcl缓冲液：Tris30克，1mol/L HCl240 mL,TEMED2.5 mL,10%SDS 3mL，加蒸馏水溶解，定容至500mL。

pH8.3Tris-Gly电极缓冲液：Tris6.0克,28.8g Gly,1g SDS, 加蒸馏水溶解，定容至1000mL。

样品液：pH6.7缓冲液2mL，甘油 10mL，10%SDS 10mL，巯基乙醇1mL，加溴酚蓝少许，定容至50mL.

0.05%考马斯亮蓝R250染色液：2.5g考马斯亮蓝，甲醇250mL，冰乙酸50mL，水定容至500mL。

脱色液：7%乙酸。

1.5 器材

微量取液器，冰箱，恒温水浴锅，紫外分光光度计，核酸蛋白检测仪，低速离心机，电磁炉，电泳仪

2 方法

2.1 粗制品的制定

取一枚鸡蛋的蛋清，体积37mL，放于250mL烧瓶中，将其放入25～30℃水浴锅中，不断搅拌下加入等体积4℃预冷的三氯乙酸-丙酮溶液，有大量白色沉淀生成，呈泡沫状，此时测烧瓶中pH为7。用8mL 三氯乙酸调p H3.5或以下，继续在水浴锅中搅拌30min，4℃下放置1h,4000r/min离心20min，得到上清液36.6mL,边搅拌边加入4倍体积的冷丙酮，4℃冰箱中保存大约4.5h，4000r/min离心20min,取沉淀，此沉淀即为粘蛋白粗品，此过程注意要用冷丙酮，并且要边搅拌边加入，因为用有机溶剂沉淀蛋白质时，