基因定点突变
pcr定点突变技术原理
pcr定点突变技术原理
PCR定点突变技术是指基于聚合酶链反应技术和脱氧核糖核酸（DNA）技术，通过检测特定位点的特定DNA序列，以及该特定位点在
基因突变中发生变化的方法。该技术通过引入多个PCR扩增特定序列，并在PCR产物中检测突变位点。整个PCR定点突变分析流程包括：DNA
提取、PCR扩增、筛选、突变检测、数据分析等步骤。第一步，先从患
者的脱氧核糖核酸（DNA）样本中取出要检测特定位点的特定DNA序列；第二步，涉及倍性引物的PCR扩增得到的DNA复制物，称为弧菌状病
毒（HCV）；第三步，以线性化步骤将弧菌状病毒和分子材料分离出来，生成紫外可见化质粒，只保留差异片段；第四步，读取所有特征模式，以获得有效的特征模式，以及发现相关的突变和多态性；第五步，通
过对所有样本进行数据挖掘来识别单项显著突变，以确定检测突变位
点的实验结果。
PCR定点突变技术是一种快速、准确的技术，使得迅速检测基因变
异和检测新发现的个体基因变异变得可能，完成病原菌或其他物质的
突变检测，为基因治疗、基因疾病的诊断和治疗，基因改造有重要的
应用前景。
编辑和定点突变技术在生命科学中的应用
编辑和定点突变技术在生命科学中的应用近年来，编辑和定点突变技术在生命科学领域中得到了广泛应用。这些技术具有高效性和准确性，能够对基因、蛋白质等生物分子进行修改，进而理解生命机制并开发出新的治疗手段。本文就编辑和定点突变技术在生命科学中的应用进行阐述。
1. 基因编辑技术
基因编辑技术是通过对基因序列进行改变，来实现对生物体遗传特征的精确控制。其中最为常见的编辑技术是CRISPR/Cas9技术。该技术具有高效性、精准性、灵活性，能够用于强化或削弱某一基因的表达，开发新药物或优化工业微生物。
CRISPR/Cas9技术的主要原理是通过设计Cas9蛋白与靶基因特异性相结合，然后通过RNA分子识别目标位点，在特定基因序列特异性地剪切下来。此种剪切可以随后引导局部DNA修复机器，以导致特定序列的删除或代替，并确保目标基因的微小变异。这一过程完全由细胞自己完成，因此无需外加化学药品等。
2. 定点突变技术
定点突变技术是基于体内重组技术、激光重组技术等方法，使得基因突变的出现变得高效而快速。现有的几种突变技术包括CRISPR/Cas9平台、ZFN（锌指核酸酶）平台和TALEN（类锌指核酸酶）平台。
ZFN平台是指用锌指蛋白和FokI核酸酶形成的一种高效的可编程切割酶，在人体的各种组织中都有较好的表现，可以通过人体的自然生理过程来改变某些基因。但是，由于ZFN平台易使基因不完整而导致突变，因此该技术需要更多的研究才能被广泛应用。
TALEN平台由优化的细胞转化和TALEN的选择组成，是在CRISPR/Cas9平台之前被研究人员广泛关注的技术。该平台具有与CRISPR/Cas9相似的优点，可精确地触发基因组移动而导致基因突变。同时，TALEN平台还可以跨越更多基因，因此该平台被视为CRISPR/Cas9技术的缓兵之计。
热点微专题08 基因编辑技术及定点突变-2023年高考生物二轮复习(人教版2019)
得到含有突变位点的双链载体；
④最后将双链载体引入宿主细胞复制，
并进行筛选和鉴定。
知识拓展：基因定点突变技术
2．PCR定点突变技术 （1）重叠延伸PCR
①此技术共需四个引物 引物2和引物3的突起处代表与模板链不 能互补的突变位点，而这两条引物有部 分碱基（包括突变位点）是可以互补的。 ②分别利用引物1和引物2，引物3和引 物4进行PCR，得到两个DNA片段 ③得到的DNA片段可以通过引物2和引物 3互补的碱基杂交在一起，它们再在DNA 聚合酶的作用下延伸，就能成为一条完 整的DNA片段。 ④最后，用引物1和引物4进行扩增得到 含有突变位点的DNA片段。
2.定点诱变技术是近年来生物工程研究中发展迅速的一个领域。通过定点诱变可以在体外 改造目的DNA分子，进而研究基因的表达以及蛋白质的结构与功能之间的关系。经典的大 引物PCR定点诱变技术成为基于PCR的定点诱变技术中应用最普遍的方法，操作过程如图甲。 研究者欲改造某基因并将其导入大肠杆菌的质粒中保存，该质粒含有氨苄青霉素抗性基因、 LacZ基因及一些酶切位点，结构如图乙。回答下列问题：
(2)为实现质粒和改良基因的高效连接，选用限制酶XmaⅠ而不选用限制酶SmaⅠ的原 因是_S_m_a_I_的__酶__切__末__端__为__平__末__端__，__无__法__与__改__良__基__因__上__的__黏__性__末__端__连__接_____________。 为将改良基因构建在质粒上，还需要__B_g_l__Ⅱ_、__D_N_A_连__接__酶_____等酶。
定点突变
基因定点突变
一、定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理
通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：
（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例
以G CG→A CG为例：
5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’
（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’
定点突变的原理和应用
定点突变的原理和应用
1. 定点突变的定义
定点突变是指在DNA序列中发生的局部突变，导致该位置的碱基序列发生改变。这种突变只发生在特定的位点上，不会影响其他的DNA区域。
2. 定点突变的原理
定点突变通常是通过基因编辑技术实现的，最常用的技术是CRISPR/Cas9系统。以下是定点突变的原理步骤：
•选择目标基因：首先需要选择一个或多个目标基因进行突变。
•设计RNA引导序列：设计一个RNA引导序列，使其能够与目标基因的特定区域配对。
•制备Cas9蛋白：将Cas9蛋白在实验室中通过重组技术制备出来。
•激活CRISPR/Cas9系统：给细胞提供Cas9蛋白和RNA引导序列，激活CRISPR/Cas9系统。
•RNA引导序列与目标基因配对：激活后的Cas9蛋白会与RNA引导序列形成复合物，引导该复合物与目标基因的特定区域配对。
•Cas9蛋白的剪切活性：一旦Cas9蛋白与目标基因配对成功，其剪切活性会被激活，导致目标基因的突变。
3. 定点突变的应用
定点突变技术在生命科学研究和生物工程领域有广泛的应用。下面列举了一些
常见的应用领域：
3.1 疾病研究
通过定点突变技术，可以模拟、研究多种遗传性疾病。通过突变引入到实验动
物模型中，可以深入了解疾病的发生机制、病理过程和潜在治疗方法。
3.2 基因治疗
定点突变技术可以用于基因治疗，通过修复特定基因的突变来治疗某些遗传性
疾病。例如，修复CFTR基因的突变可以治疗囊性纤维化。
3.3 遗传改良
定点突变技术可用于改良作物品种，使其具有更好的品质、更高的产量或更强
的抗逆能力。
基因突变位点解读
基因突变位点解读
在基因检测中，突变位点通常是通过比较被测者的DNA与正常人群的DNA 来确定的。如果一个位点在正常人群中是常见的，但在被测者的DNA中发生了变异，那么这个位点就是突变位点。此外，突变位点也可以是遗传疾病的致病位点。在这种情况下，如果被测者携带了致病位点，那么他们可能会患上遗传疾病。基因突变的类型
基因突变的类型有很多种，包括点突变、插入、缺失和倒位等。点突变是指单个碱基发生了改变，而插入、缺失和倒位等是指多个碱基发生了改变。这些突变可能会导致基因功能的改变，从而对人类的生理和病理过程产生影响。
定点突变的原理及应用
定点突变的原理及应用
1. 简介
定点突变（Site-directed mutagenesis）是一种通过有意诱导改变DNA的特定
位置的技术。通过改变DNA序列，可以产生新的突变型，并用于研究基因功能、
蛋白质结构与功能关系、以及药物设计等领域。本文将介绍定点突变的原理及应用。
2. 原理
定点突变技术主要有两种方法：化学法和分子生物学法。以下是两种方法的原
理说明：
2.1 化学法
化学法主要通过碱基修饰剂来改变DNA序列。常用的方法是使用化学修饰剂
N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine (MNNG) 或nitrous acid (HNO2)处理DNA，
使其发生碱基突变。这些碱基修饰剂会引起DNA中的碱基发生氧化、甲基化、烷
基化等修饰，导致DNA序列的变化。
2.2 分子生物学法
分子生物学法是目前应用较广泛的定点突变方法。主要有以下几个步骤： 1）
设计引物：根据目标突变位点的上下游序列，设计引物。 2）PCR扩增：使用设计
的引物进行PCR扩增，得到含有突变位点的DNA片段。 3）点突变：使用特定的
酶和突变体模板进行点突变反应，使目标位点发生突变。 4）验证突变：通过测序
或其他技术手段验证突变是否成功。
3. 应用
定点突变技术在许多领域都有广泛的应用，包括但不限于以下几个方面：
3.1 研究基因功能
定点突变可以用于研究基因功能和调控机制。通过引入特定的突变体，可以观
察到基因功能的变化，进而研究基因在生物体内的作用机制。
3.2 蛋白质结构与功能关系研究
蛋白质的结构与功能之间具有密切的关系。定点突变可以通过改变蛋白质的氨
基因定点突变DNA实验技术方法
基因定点突变DNA实验技术方法
要研究和检测基因定点突变，需要使用一系列的实验技术方法。以下
是几种常用的DNA实验技术方法：
1.基因测序技术
基因测序技术是研究基因组突变的关键方法之一、它可以将DNA分子
按顺序解码，并确定单个核苷酸的序列。经过多年的发展，现在有很多种
基因测序技术可供选择，如Sanger测序、Illumina测序、PacBio测序和
单分子DNA测序。这些技术可以高效地测定基因组中各个位置的核苷酸序列，并揭示基因定点突变的存在。
2.聚合酶链式反应（PCR）
PCR是一种用于扩增特定DNA片段的方法，可以在PCR反应过程中选
择性地扩增感兴趣的基因片段。对于基因定点突变的研究，PCR可以用来
扩增包含突变位点的DNA片段，并通过测序分析来确定突变的类型。
3.引物延伸法
引物延伸法是一种常用的检测单核苷酸多态性（SNP）和点突变的方法。该方法使用引物和DNA聚合酶来识别特定位点，并从该位点延伸引物，以确定突变的存在与否。引物延伸法可以用于快速、高效地检测多个位点
的突变。
4. 限制性酶切酶（Restriction Enzyme Digestion）
限制性酶切酶可以通过识别特定的DNA序列并在该序列周围切割DNA
来检测和分析基因定点突变。当突变中产生或消失限制性酶切位点时，可
以通过酶切后的DNA片段的大小变化来检测突变。
5. DNA芯片技术（DNA Microarray）
DNA芯片技术是一种高通量的基因分析技术，可以同时检测和比较大
量的基因表达水平。通过将DNA分子固定在芯片的表面并用荧光探针进行
定点突变
基因定点突变
一、定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理
通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：
（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例
以G CG→A CG为例：
5’-CCTCCTTCAGTA TGTAG G CGACTTACTTA TTGCGG-3’
（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’
基因定点诱变的方法及原理
基因定点诱变的方法及原理
基因定点诱变是指在特定位置引发基因突变的一种技术或方法。通过基因定点诱变技术，可以精确地改变基因组中特定位置的碱基序列，从而研究或改变目标基因的功能。
目前常用的基因定点诱变方法主要有以下几种：
1. CRISPR-Cas9系统：CRISPR-Cas9（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats-CRISPR associated protein 9）是一种基于RNA-DNA 相互识别的靶向基因编辑技术。该系统利用Cas9蛋白通过结合到特定的DNA 序列来导向编辑目标位置，而CRISPR RNA（crRNA）和互补序列的转录过程产生了指导RNA（sgRNA）。CRISPR-Cas9系统可以通过设计合成特定的sgRNA来诱导Cas9蛋白与目标基因的DNA序列结合，并在目标位点引入双链断裂，通过自然修复过程来实现基因突变。
2. TALEN系统：TALEN（Transcription activator-like effector nuclease）是一种由TAL（Transcription activator-like）蛋白和核酸酶融合而成的基因编辑工具。TAL蛋白可通过识别和结合特定的DNA序列来实现靶向基因编辑。TALEN 系统利用设计合成的TAL蛋白与核酸酶的融合体结合到目标基因的DNA序列上，并通过酶活性诱导DNA的双链断裂，从而引发基因突变。
3. ZFN系统：ZFN（Zinc finger nuclease）是由锌指蛋白（Zinc Finger Protein）
基因定点突变技术.
4、大引物诱变法
首先用正向突变引物（M） 和反向引物（R1），扩增模板 DNA产生双链大引物（PCR1）， 与野生型DNA分子混合后退火并 使之复性，第二轮PCR中加入正 向引物（F2），与PCR1中产生 的一条互补链配对，扩增产生带 有突变的双链DNA。由于F2中的 退火温度显著高于第一轮PCR所 使用的引物M和R1，因此，可忽 略引物M和R1在本轮反应中所造 成的干扰。
基因定点突变技术
目录
一、定点突变简介
二、基因定点诱变 三、基因定点突变应用
Leabharlann Baidu
四、展望
一、定点突变简介
定点突变（site-directed mutagenesis） 技术可以有目的性地在已知ＤＮＡ 序列中 取代、插入或缺失一定的核苷酸片段，可以 有目的或针对性的改变ＤＮＡ序列中的碱基 次序；它不仅可以用来阐明基因的调控机理， 也可以用来研究蛋白质结构与功能之间的关 系。
四、展望
定点突变技术可以高效地应用于ＤＮＡ缺失改造、 蛋白质工程和酶等多个研究领域。它不仅加深人们对 蛋白质、酶等物质的了解，而且也为进一步研究这些 物质提供技术支持。另外，突变技术可以对某一特性 相关位点同时进行突变，这就极大地提高了获取突变 子的效率，避免了高强度的筛选工作，同时也节约了 大量的时间和资金。突变技术在蛋白质工程研究将会 继续保持迅猛势头，且在医学、农业科学、肿瘤研究、 基因表达与调控等领域，突变技术的应用也越来越广 阔。因此，我们有理由相信突变技术在未来会有光明 的应用前景。
基因定点突变
基因定点突变
一、定点突变的目的
把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理
通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则
引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：
（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5
注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例
以G CG→A CG为例：
5’-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’
（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’
定点突变和饱和突变
定点突变和饱和突变是两种常用的蛋白质工程技术，它们都可以改变目标基因的序列，从而影响蛋白质的结构和功能。但是，这两种技术也有很大的不同，主要体现在以下几个方面：
突变的范围
定点突变是指在目标基因的特定位点上，引入预先设计好的碱基替换、插入或缺失，从而产生特定的氨基酸替换、添加或删除的突变体。定点突变的目的是根据已有的关于蛋白质结构、功能、催化机理等信息，有目的地改变蛋白质性能或特异性。
饱和突变是指在目标基因的某一位点或某几个位点上，将原来的碱基替换成所有可能的其他碱基，从而产生所有可能的氨基酸替换的突变体。饱和突变的目的是探索蛋白质功能和结构之间的关系，以及寻找具有改善或新颖性能的蛋白质突变体。
因此，定点突变是一种有选择性的突变技术，它只改变目标基因中感兴趣的部分；而饱和突变是一种无选择性的突变技术，它改变目标基因中所有可能的部分。
突变的方法
定点突变通常采用PCR方法来实现，即利用合成的含有突变碱基的引物来扩增目标基因片段，并将其克隆到载体中。这种方法虽然能够在特定
位点引入特定碱基突变，但一次只能引入一种突变碱基，若进行饱和突变需要合成多条突变引物。这样做既费时又费力，而且容易出错。
饱和突变则采用其他更高效和简便的方法来实现，比如使用简并密码子、随机引物、DNA重组等技术。简并密码子是指可以编码多种氨基酸的密码子，比如NNK或NNS（N表示任意碱基，K表示G或T，S表示G或C），它们可以编码20种氨基酸中的19种（除了色氨酸）。随机引物是指含有随机碱基序列的引物，它们可以产生各种不同组合的密码子。DNA重组是指利用限制性内切酶、连接酶等酶来切割和连接不同来源或不同位置的DNA片段，从而产生新型DNA序列。这些方法都可以在目标基因上产生大量不同类型和位置的突变，并且操作简单快速。
pcr介导的定点突变概念
pcr介导的定点突变概念
PCR（聚合酶链式反应）介导的定点突变是一种用于在特定DNA 序列中引入特定突变的技术。该技术通常用于基因工程和分子生物学研究中，以研究基因的功能、构建突变体或进行蛋白质工程等。
PCR 介导的定点突变的基本原理如下：
1. 设计引物：首先，需要设计一对引物，其中一个引物包含要引入的突变。引物的设计需要考虑到突变的位置和类型，以及PCR 的反应条件等因素。
2. 合成突变引物：根据设计的引物，使用化学方法合成包含突变的引物。
3. PCR 反应：将合成的突变引物与野生型 DNA 模板混合，并进行 PCR 反应。在 PCR 反应中，突变引物会与野生型 DNA 模板退火，并在延伸阶段引入突变。
4. 克隆和筛选：将 PCR 产物克隆到载体中，并通过筛选或测序等方法鉴定携带突变的克隆。
PCR 介导的定点突变技术具有高效、快速、简便等优点，可以在短时间内引入特定的突变。然而，该技术也存在一些局限性，如突变效率可能较低、突变类型有限等。因此，在使用该技术时需要仔细设计引物和反应条件，并进行严格的质量控制。
dpn1定点突变原理
dpn1定点突变原理
dpn1定点突变原理是一种基因突变分析方法，用来确定基因序列中的突变位点。
该原理利用特定引物扩增基因序列，并采用基因测序技术对扩增产物进行测序。在测序过程中，引物中的特定核苷酸位点会发生突变，形成两个不同的碱基。通过比较突变位点上的碱基组成，可以确定基因序列中的突变。
dpn1定点突变原理可用于分析基因的单碱基多态性（SNP）和小片段内的插入/缺失变异。该方法能够高效、准确地检测基因突变，并广泛应用于基因突变鉴定、疾病诊断和研究等领域。
该原理的关键是选择合适的引物和测序方法，以确保突变位点上的碱基能够被准确测序。此外，为了提高检测的特异性和敏感性，还可以结合其他方法，如聚合酶链反应（PCR）、限制性内切酶切割等。
总之，dpn1定点突变原理是一种可靠、高效的基因突变分析方法，对于研究和诊断基因突变具有重要意义。
基因的定点突变的原理
基因的定点突变的原理
基因的定点突变是指基因中某一个碱基发生改变，从而导致基因编码的氨基酸序列发生变化。其原理可以归纳为以下几点：
1. 突变的发生是由突变原因所引起的，突变原因主要有自然突变和诱发突变两种。自然突变是由于DNA复制过程中的错误所引起的，而诱发突变则是由于不同的生物或环境因素引起的。
2. 突变的类型可分为点突变和插入/缺失突变。点突变是指单个碱基的改变，而插入/缺失突变则是指在基因中插入或者丢失一段碱基序列。
3. 定点突变是指发生在特定位置的突变，比如基因编码区域中的一个碱基发生改变，从而导致相应的氨基酸变化。这种突变常常会影响到蛋白质的结构和功能。
4. 定点突变的发生和检测需要依靠基因测序技术。现代测序技术能够高效准确地检测基因序列中的每一个碱基，从而判断基因是否发生了突变。此外，通过人工合成基因的方法，可以精确地制造含有特定突变的基因序列，进而研究突变对蛋白质结构和功能的影响。
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2 体外定点突变的方法
具体方法有三种： (1)寡核苷酸介导的定点突变 (2)PCR介导的定点突变 (3)盒式突变
（1）寡核苷酸介导的定点突变
寡聚核苷酸定点 诱变技术是由加 拿大的生物化学 家（michael smith，1932-） 发明的。
寡核苷酸定点突变基本原理
合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作 为引物，其中含有所需要改变的 碱基，使其与带有目的基因的单 链 DNA 配对。 合成的寡核苷酸引物除短的错配 区外，与目的基因完全互补。 然后用 DNA 聚合酶使寡核苷酸 引物延伸，完成单链 DNA 的复 制。 由此产生的双链 DNA ，一条链 为野生型亲代链，另一条为突变 型子代链。 将获得的双链分子通过转导入宿 主细胞，并筛选出突变体，其中 基因已被定向修改。
二 酶定向进化技术及应用
主要内容
天然酶的应用及局限性 酶的定向进化的思想 酶的定向进化的策略和方法 酶的定向进化技术的应用
一天然酶的作用及局限性
生物体系之所以能够相对独立地存在于自然界 中，并维持其独立性和生命的延续性，都是因为生物 体内的一系列酶在发挥着作用。 酶保证了生物体内组成生命活动的大量生化反应 得以按照预定的方向有序、精确而顺利地进行，几乎 所有生物的生理现象都与酶的作用紧密相关，可以这 样说，没有酶的存在，就没有生物体的一切生命活动。
在最初所建立的 PCR 方法中 就可看出只要引物带有错配碱 基，便可使 PCR 产物的末端 引入突变。但是诱变部位并不 总在 DNA 片段的末端，有 时也希望对靶 DNA 的中间 部分进行诱变。 目前采用重组 PCR 进行定位 诱变，可以在 DNA 片段的 任意部位产生定位突变。
PCR介导的定点突变
Site-directed mutagenesis
Wild type
CAG GTC
(1)
CAG GTC 重组 DNA 野生双链
(5)
translation
Val
CAG
(2)
Wild type protein + primer
CAG CGG 突变引物 GCC 突变双链
(6)
Mutant
primer
(3)
PCR定点突变
整个反应体系为50μl，其中含无菌去离 子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、 P2引物各1μl，pESOD质粒1μl(约 100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反应 条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性 1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25个 循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
SOD酶化学修饰研究：
1994 年，阎家麟、谢文正等用被氯化亚砜活化 的月桂酸修饰牛血Cu,Zn-SOD ，其活性回收率 为93%，修饰率为80%，半衰期明显延长，蛋 白质的免疫原性降低，热稳定性及抗蛋水解酶的能 力也明显增强。 1996 年，邹国林，胡萍等用膜脂成分的硬脂酸 作为修饰剂，对SOD 进行化学修饰。修饰SOD 对温度、pH、蛋白酶水解的稳定性比天然SOD 增强，且免疫原性消除，在低浓度的某些有机介质 中活性比在水中高。
利用酶作为催化剂进行生物催 化与生物转化，已成为生产精细化 学品、手性药物、食品添加剂等的 重要工具,获得了广泛应用。
天然酶的局限-源于酶的自然进化过程
天然的生物催化剂存在着无法适应工业化生产中非 自然条件的限制天然酶用于工业生产 不能很好地适应环境的转变，较差的溶解性不稳定 性以及苛刻的酶促反应条件使其不适于大规模应用 酶在活细胞的复杂条件下，底物或产物之一可能 会强烈抑制酶生物催化过程的活力 在非水溶液中酶不能够接受不同的底物
盒 式 诱 变
人工合成 具有突变 序列的 DNA片段
野生型基因
应用：SOD酶化学修饰Βιβλιοθήκη Baidu究：
天然的SOD 稳定性较差，具有免疫原性，功能相 对单一，而限制了其应用，化学修饰可以增强酶稳 定性，降低免疫原性。 2003 年，赵数进，尹亮等用相对分子量为 2000~20000的PEG 修饰SOD，发现相对分 子量为6000 的PEG 修饰效果好 1986 年，袁勤生等用高碘酸钠氧化右旋糖酐成 二醛修饰SOD, 实验表明，修饰酶不仅完全保留了 天然酶的活性，而且在耐热性、耐酸性，抗胃蛋白 酶水解的能力等方面明显优于天然酶。
转化
用Dpn I限制性内切酶处理PCR反应产物， 直接转化感受态的E.coli DH5α， E.coli DH5α涂布培养后，随机挑3个菌落 并提取相应质粒，由上海博亚生物技术育限 公司测序。
结果
提取的质粒经EcoRI酶切后琼脂糖电泳 质 粒大小为3300bp左右，证明所提取的质粒 就是pESOD质粒 PESOD质粒测序的部分结果 所测序列与 文献报道的Cu,Zn-SOD序列对比完全一 致， 证明pESOD质粒内含的Cu,Zn-SOD基因完 全正确
SOD酶基因定点突变修饰研究：
铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD) 在体 内停留时间短(通常只有6～10min)，使 得Cu，Zn-SOD的应用受到很大限制。 本研究采用一种近年来新的定点突变技术― 快速PCR定点突变方法成功地对Cu，ZnSOD进行了基因改良，将Cu，Zn-SOD基 因中非活性中心的Cys111密码子突变为 Ala密码子，以提高其稳定性。
（3）盒式突变 （cassette mutagenesis）：
1985年Wells提出的一种基因修饰技术—盒式 突变。 盒式突变: 就是用一段人工合成具有突变序列的 DNA片段，取代野生型基因中的相应序列,这就 好像用各种不同的盒式磁带插入收录机中一样， 故而称合成的片段为“盒”，这种诱变方式为盒式 诱变。 然而，并非所有变异区附近都能找到合适的限制 位点，如果不存在限制位点，就要用寡核苷酸指 导的定位诱变引入限制位点。
GCC
+ polymerase
CAG GCC
(4)
translation
Thr
Juang RH (2004) BCbasics
Mutant protein
replication
Smith (1993)
Only one amino acid changed Val → Thr
寡核苷酸定点突变
(2)PCR介导的定点突变
结果
定点突变后3个质粒测序结果及突变前后序 列对比3个质粒的测序结果有2种，分别和文 献的Cu，Zn-SOD序列对比： 其中1个质粒测序结果和Cu,Zn-SOD基因 序列完全一致，说明突变未成功； 另外2个质粒分别有2个碱基和Cu,Zn-SOD 因序列不同，也就是Cys的密码子TGC变成 了Ala的密码子GCC，其他序列与Cu，ZnSOD基因一致，符合预期要求。
菌株与质粒
E.coli DH5α，由本实验室保存 质粒pESOD(含Cu，Zn-SOD基因、Ampr 基因以及EcoRI酶切位点，整个质粒约 33kb)，由实验室构建，并转化于E.coli DH5α保存。
引物设计
根据Cu，Zn-SOD基因序列和定点突变的要求， 将Cu，Zn-SOD中第111位Cys的密码子TGC突变 为Ala密码子GCC，设计出一对包含突变位点的引 物(正、反向)P1和P2,具体序列如下： P1： 5′CTCTCAGGAGACCATGCCATCATTGGCCG CAC 3′； P2： 5′GTGCGGCCAATGATGGCATGGTCTCCTGA GAG 3′。 下划线的碱基为突变位置。
寡核苷酸定点突变
1）在克隆外源基因时，需要从已感染 M 13 的大肠杆菌细胞中获取含有 M 13 双链复制型 DNA ，将外源基因插 入到M 13 DNA 中； 2）在定点诱变时，需从培养液中分离 出 M 13 的重组噬菌体，并从中提取携 带外源基因 M 13 的单链重组 DNA 。 3）再进行体外定位诱变，人工合成一 段改变了碱基顺序的寡核苷酸片段 （8~18bp），以此作为引物，在体外 合成互补链，获得含有错配碱基的完整 双链 M 13 DNA ， 4）双链 M 13 DNA转染大肠杆菌， M 13 在大肠杆菌中扩增，形成噬菌斑。 理论上一半是野生型，另一半则含有突 变基因。用诱变的寡核苷酸引物作为探 针，通过杂交即可鉴定出突变体。
Point Mutations(碱基替代)
5’…T-A-C…..3’ 3’...A-T-G……5’ A-A-C T-T-G T-A-G A-T-C T-A-T A-T-A T-A-C A-T-G Transcription A-A-C
Aspargine codon
Gene Replication 基 因 定 点 突 变
第五讲
基因定点突变和酶定向进化技 术及应用
一 基因定点突变技术及应用
1 体外定点突变技术的目的
基因定点突变是指按照设计的要求，使基因的特定 序列发生插入、删除、置换和重排等变异。 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的 关系的有力工具。 蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定 碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应 的氨基酸序列和蛋白质结构和功能,改造酶的不同 活性或者动力学特性
定向进化技术
人为地创造特殊的进化条件，模拟自 然进化机制，在体外对基因进行随机突 变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天 然的或者人为获得的）出发，经过基因的 突变和重组，构建一个人工突变酶库，通 过一定的筛选或选择方法最终获得预先期 望的具有某些特性的进化酶。
需要4条PCR引物:分 别是含有突变的碱基并 且反向部分重叠的引物 A,A’,以及与目的基因两 端互补的引物B,C. 任何基因，只要两端 及需要变异的部位的序 列已知，就可用 PCR 诱 变去改造基因的序列。
PCR介导的定点突变
首先,引物A, B和A’ ,C两 两配对,分两管进行第一次 PCR,产生两个部分重叠的 DNA片段. 然后将上述两管PCR产物 混合,变性再复性,在DNA 聚合酶的作用下延伸产生 完整的双链DNA, 用引物B,C,以新合成的完 整双链DNA为模板进行第 二次PCR,即可得到含有预 期突变位点的DNA片段.
SOD酶化学修饰研究：
有关SOD 化学修饰开展的工作，用来作为 修饰剂的分子有脂肪酸、糖、蛋白质及维生 素等, 但未发现用激素作为修饰剂。 有报道：褪黑素MT，化学名称为N-乙酰5-甲氧基色胺，，研究表明它是一种抗氧化 剂，可有效清除化学反应中产生的羟自由基。 修饰酶MT－SOD， 保留SOD 的歧化活性 的同时，也具备MT 清除自由基的能力以及 MT其他的生理功能。
引物
A G A G T A
N 体定突 图21- D A的 外 点 变
寡核苷酸定点突变基本原理
★利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物， 利用M13噬菌体载体系统合成突变基因。 ★首先将待诱变的基因克隆在M13噬菌体载体上， ★另外，人工合成一段改变了碱基顺序的寡核苷酸片 段（8~18bp），以此作为引物，在体外合成互补 链， ★再经体内扩增基因，经此扩增出来的基因即是突变 了的基因。
1993年,美国科学家Arnold F H 首先提出酶分子的定向进化的概 念，并用于天然酶的改造或构建新 的非天然酶。
定向进化（Directed evolution）是近20年发 展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想 在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用 它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在 实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过 程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生 大量变异，并定向选择出所需性质的突变体， 可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成 的进化过程
U-A-G
Stop codon
U-A-U
Tyrosine codon
U-A-C
Tyrosine codon
m-RNA
Translation Normal Wild type
Missense
Incomplete Normal Nonsense Silent
点 突 变 的 结 果
碱基替代
碱基替代
碱基替代插入或缺失
现代生物工程的对酶的要求
能具备长期稳定性和活性 能适用于水及非水相环境 能接受不同的底物甚至是自然界不存在的 合成底物 能够在特殊环境中合成和拆分制作新药物 或药物的原材料
如何利用相对简单的方法以 达到对天然酶的改造或构建新 的非天然酶就显得非常有研究 意义和应用前景。
二蛋白质定向进化概念的提出