基因定点突变
定点突变原理
定点突变原理定点突变原理是指生物体基因组中某个特定位置的碱基序列发生突变的现象。
这种突变可以是单个碱基的替换、插入或缺失，也可以是更大范围的基因片段的改变。
定点突变可以导致生物体的遗传信息发生改变，从而影响其表型特征和遗传特性。
定点突变的发生通常是由于DNA复制过程中的错误或外部环境因素的影响。
在DNA复制过程中，酶类会不时出现错误，导致新合成的DNA链上出现错误的碱基。
此外，环境因素如辐射、化学物质等也会对DNA分子产生损害，导致定点突变的发生。
定点突变可以分为两种类型，点突变和插入/缺失突变。
点突变是指单个碱基的改变，包括错义突变、无义突变和无框移码突变。
错义突变是指由于碱基替换导致对应的氨基酸发生改变，从而影响蛋白质的结构和功能；无义突变是指由于碱基替换导致对应的密码子变成终止密码子，导致蛋白质合成过程中提前终止；无框移码突变是指由于碱基插入或缺失导致密码子的读框发生改变，从而影响蛋白质合成过程中的氨基酸序列。
插入/缺失突变则是指在基因组中插入或缺失一段碱基序列，导致基因的框架发生改变，进而影响蛋白质的合成。
定点突变的发生对生物体的遗传特性和表型特征都会产生影响。
在遗传学研究中，定点突变被认为是生物体进化过程中的重要驱动力之一。
一些有利于生物体适应环境的定点突变可以被自然选择所保留，从而在种群中逐渐普及。
而一些不利于生物体适应环境的定点突变则可能被淘汰。
因此，定点突变在生物体的进化过程中扮演着重要的角色。
定点突变也是许多遗传性疾病发生的原因之一。
一些致病基因中的定点突变会导致蛋白质结构和功能的改变，从而引发一系列遗传性疾病。
对定点突变的研究有助于我们更好地理解遗传疾病的发病机制，并为相关疾病的治疗提供理论基础。
总之，定点突变是生物体遗传信息发生变化的重要方式，它对生物体的遗传特性、进化过程以及遗传性疾病的发生都具有重要影响。
对定点突变的深入研究不仅有助于我们更好地理解生物体的遗传特性，也为相关领域的研究提供了重要理论基础。
基因定点突变
基因定点突变基因定点突变是基因功能研究的重要手段之一，本文将从引入突变碱基、缺失突变、插入突变、错位突变、置换突变、无义突变、同义突变、抑制突变等方面，详细介绍基因定点突变的方法及意义。
1.引入突变碱基引入突变碱基是基因定点突变的一种常见方法，通过在特定位置插入或替换一个或多个碱基，以达到研究基因表达和功能的目的。
在引入突变碱基前，需要了解野生型DNA序列和突变DNA序列的差异以及可能的突变类型。
常见的引入突变碱基的方法包括寡核苷酸介导的基因定点诱变和PCR扩增后直接诱变。
这些方法能够有效地在基因组中引入所需突变，为研究基因表达和功能奠定基础。
2.缺失突变缺失突变是指在基因组中缺失一个或多个碱基对的突变类型。
这种突变通常会导致基因表达的下降甚至丧失，进而影响生物体的表型。
通过缺失突变研究基因功能的方法是敲除技术，即利用特异性核酸内切酶将目标基因的一部分切除。
敲除技术可以有效地用于研究基因组中非必需区的功能以及筛选基因敲除小鼠模型等。
3.插入突变插入突变是指在基因组中插入一个或多个碱基对的突变类型。
插入突变的后果取决于插入的序列和位置。
在基因组中插入外源序列可能导致基因表达的改变或产生新的表型。
插入突变通常通过同源重组或非同源末端连接实现。
利用插入突变可以研究基因的增强子、启动子等调控元件的功能以及研究转录因子结合位点等。
4.错位突变错位突变是指DNA序列中碱基对的相对位置发生改变的突变类型。
错位突变可能会导致基因表达的下降或丧失，但也可能产生新的表型。
错位突变的产生通常通过特定的核酸内切酶和连接酶实现。
利用错位突变可以研究DNA复制、修复和重组等方面的机制，同时也可以用于构建人工染色体等。
5.置换突变置换突变是指DNA序列中两个或多个不同碱基对之间的替换产生的突变类型。
置换突变可能会导致基因表达的改变或产生新的表型。
与缺失和插入突变相比，置换突变的后果可能更加复杂和微妙。
利用置换突变可以研究不同氨基酸之间的替换对蛋白质结构和功能的影响，从而深入了解基因表达和调控的机制。
定点突变
1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
5’-NNNNNNNNNNNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNNNNNNNNNNNN-5’完全互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNTNNNNNNN-5’部分互补5’-NNNNNNANNNNNNNNNNNNNNNNN-3’3’-NNNNNNNNNNNNNNNT-5’部分互补一对中间位置的点突变引物设计3.PCR：PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增；PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增。
基因定点突变技术.
四、展望
定点突变技术可以高效地应用于ＤＮＡ缺失改造、 蛋白质工程和酶等多个研究领域。它不仅加深人们对 蛋白质、酶等物质的了解，而且也为进一步研究这些 物质提供技术支持。另外，突变技术可以对某一特性 相关位点同时进行突变，这就极大地提高了获取突变 子的效率，避免了高强度的筛选工作，同时也节约了 大量的时间和资金。突变技术在蛋白质工程研究将会 继续保持迅猛势头，且在医学、农业科学、肿瘤研究、 基因表达与调控等领域，突变技术的应用也越来越广 阔。因此，我们有理由相信突变技术在未来会有光明 的应用前景。
基因定点突变技术
目录
一、定点突变简介
二、基因定点诱变 三、基因定点突变应用
四、展望
一、定点突变简介
定点突变（site-directed mutagenesis） 技术可以有目的性地在已知ＤＮＡ 序列中 取代、插入或缺失一定的核苷酸片段，可以 有目的或针对性的改变ＤＮＡ序列中的碱基 次序；它不仅可以用来阐明基因的调控机理， 也可以用来研究蛋白质结构与功能之间的关 系。
1、寡核苷酸盒式诱变
（Cassette mutagenesis）
利用一段人工合成的具有突变 序列的寡核苷酸片段，即寡核苷酸 盒，取代野生型基因中的相应序列。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
2、寡核苷酸引物诱变
使用化学合成的含有突变碱基的寡 核苷酸片段作为引物，启动单链DNA 分子进行复制，随后这段寡核苷酸引 物便成为了新合成DNA子链的一个组 成部分，因此所产生出来的新链便具 有已发生突变的碱基序列
1、突变技术在蛋白质工程中的应用
突变技术在蛋白质工程中的应用 非常广泛和成功。此技术不仅是蛋白 质定向改造的强有力工具，而且也是 研究蛋白质结构和功能关系的重要方 法。
基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略一、定点突变得目得把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.二、定点突变得原理定点突变就是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒)中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。
定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。
体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。
蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。
对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。
而利用定点突变技术改造基因：比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP)就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移),而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。
定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR 产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．三、引物设计原则引物设计得一般原则不再重复.突变引物设计得特殊原则:(1）通常引物长度为2５~４5 bp,我们建议引物长度为3０~35 bp。
一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12 bｐ。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。
定点突变
1.1.1基因定点突变简介（INTRODUCTION）定点突变（site-directed mutagenesis）是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化，包括碱基的添加、删除、点突变（单点/多点）等。
定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
原理上分两种：1. 搭桥法（重叠PCR）2. 一步法（全质粒PCR）►搭桥法（重叠PCR）定点突变搭桥法共需要两对引物（两端引物，中间引物）,三次PCR，其中前两次PCR可同时完成，原理如图一所示：两次PCR的产物回收，作为模板加上两端引物primer F和primer R 进行PCR3。
搭桥法定点突变PCR1：以primer F 和primer Rm 为引物对扩增PCR2：以primer R 和primer Fm 为引物对扩增实验步骤（PROCEDURE）1.两对引物的Tm值都应相当。
两端PCR引物参照普通引物设计并无特殊要求。
所需引入突变包含在中间引物互补区域内（需要在两条引物上均引入点突变），请勿将突变位点置于引物3’ 末端且突变位点距离3’ 端最少要有15个碱基，因为有非匹配碱基的存在，太短会导致引物与模板无法结合。
2.对于一对中间引物的设计，如左图所示（高亮处是突变碱基），两引物间可以是完全互补，也可是部分互补。
但两引物间互补部分的Tm值不能太低（太低导致PCR3无法配对延伸）。
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基因定点突变全攻略
基因定点突变全攻略基因定点突变是指基因序列中的一些碱基发生了改变，可以是单个碱基的替换、插入或删除。
这种突变一般发生在DNA的编码区域，会导致蛋白质的氨基酸序列发生改变，从而影响蛋白质的功能。
基因定点突变在许多遗传病和疾病中起着重要的作用。
以下是关于基因定点突变的全攻略。
1.基因定点突变的类型基因定点突变可以分为三类：错义突变、无义突变和非义突变。
错义突变是指被改变的碱基导致了密码子的改变，从而使蛋白质的氨基酸序列发生了改变。
无义突变是指被改变的碱基导致了密码子的提前终止，从而使蛋白质的合成过早终止。
非义突变是指被改变的碱基导致了密码子的改变，但不会改变蛋白质的合成。
2.基因定点突变的起因基因定点突变可以由多种因素引起，如自然突变、致突变剂和辐射。
自然突变是指在正常细胞分裂和DNA复制过程中产生的突变。
致突变剂是指能够引起DNA突变的化学物质或物理因素，如化学药物、辐射等。
辐射包括离子辐射和非离子辐射，如X射线、紫外线等。
3.检测和诊断基因定点突变检测和诊断基因定点突变可以通过分子生物学技术进行，如PCR、DNA测序和核酸杂交等。
PCR可以扩增特定的DNA片段，从而使突变的碱基更容易被检测到。
DNA测序可以确定基因序列的每个碱基，从而找到突变的位置和类型。
核酸杂交可以通过与已知突变序列杂交，检测是否存在突变。
4.基因定点突变的遗传5.基因定点突变与疾病总结：基因定点突变是基因序列中的一些碱基发生改变，影响蛋白质的功能。
基因定点突变可以分为错义突变、无义突变和非义突变。
突变的原因包括自然突变、致突变剂和辐射。
基因定点突变的检测和诊断可以通过分子生物学技术进行。
基因定点突变可以遗传给后代，影响他们的生长和发育。
基因定点突变在许多疾病中起着重要作用，了解基因突变对于早期诊断和治疗具有重要意义。
定点突变的原理和应用
定点突变的原理和应用1. 定点突变的定义定点突变是指在DNA序列中发生的局部突变，导致该位置的碱基序列发生改变。
这种突变只发生在特定的位点上，不会影响其他的DNA区域。
2. 定点突变的原理定点突变通常是通过基因编辑技术实现的，最常用的技术是CRISPR/Cas9系统。
以下是定点突变的原理步骤：•选择目标基因：首先需要选择一个或多个目标基因进行突变。
•设计RNA引导序列：设计一个RNA引导序列，使其能够与目标基因的特定区域配对。
•制备Cas9蛋白：将Cas9蛋白在实验室中通过重组技术制备出来。
•激活CRISPR/Cas9系统：给细胞提供Cas9蛋白和RNA引导序列，激活CRISPR/Cas9系统。
•RNA引导序列与目标基因配对：激活后的Cas9蛋白会与RNA引导序列形成复合物，引导该复合物与目标基因的特定区域配对。
•Cas9蛋白的剪切活性：一旦Cas9蛋白与目标基因配对成功，其剪切活性会被激活，导致目标基因的突变。
3. 定点突变的应用定点突变技术在生命科学研究和生物工程领域有广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用领域：3.1 疾病研究通过定点突变技术，可以模拟、研究多种遗传性疾病。
通过突变引入到实验动物模型中，可以深入了解疾病的发生机制、病理过程和潜在治疗方法。
3.2 基因治疗定点突变技术可以用于基因治疗，通过修复特定基因的突变来治疗某些遗传性疾病。
例如，修复CFTR基因的突变可以治疗囊性纤维化。
3.3 遗传改良定点突变技术可用于改良作物品种，使其具有更好的品质、更高的产量或更强的抗逆能力。
3.4 新药开发定点突变技术可以用于研究药物的作用机制和副作用，以及筛选潜在的药物靶点。
3.5 细胞工程通过定点突变技术，可以对细胞进行工程改造，从而使其具有特定的功能或性状，广泛应用于医药、能源和材料等领域。
4. 定点突变技术的优势和挑战定点突变技术相比传统的突变技术具有以下优势：•准确性：定点突变技术可以实现特定位点的精确突变，避免了无关的突变。
基因定点突变方法及其应用
基因定点突变方法及其应用基因定点突变是指在基因组中特定位置的发生的突变。
基因定点突变可以是单个碱基的突变，也可以是多个碱基的突变。
这可以发生在DNA、RNA或蛋白质的编码区域或非编码区域。
基因定点突变方法是用于研究基因突变的工具和技术。
它们在生物医学研究、疾病诊断、药物研发等领域有着广泛的应用。
1.PCR扩增：PCR扩增是一种常用的基因定点突变方法，可以快速有效地扩增所需的DNA片段。
通过在PCR反应中引入突变引物，可以在特定位点引入单个碱基变异。
这种方法被广泛应用于基因功能研究、遗传性疾病的诊断和突变的检测等领域。
2.扩增-测序：扩增-测序方法是一种将突变引物引入待测基因位点的PCR扩增方法，随后使用测序技术验证突变是否成功。
这种方法可用于研究基因突变与人类遗传病之间的相互关系，还可以用于检测药物抗性突变、病毒突变等领域。
3.分子克隆：分子克隆是一种将特定DNA片段插入载体DNA的方法。
通过将突变片段与目标DNA结合，随后将其放入宿主细胞，可将所需的突变引入到目标基因中。
这种方法广泛应用于蛋白质工程、基因功能研究等领域。
4. CRISPR-Cas9系统：这些基因定点突变方法在基因功能研究、疾病诊断和治疗、药物研发等领域有着广泛的应用。
在基因功能研究中，通过引入特定的突变，研究人们可以研究基因的功能和调控机制。
例如，通过基因定点突变，可以研究基因在发育、免疫反应、代谢调节等过程中的作用和调节机制。
在疾病诊断和治疗中，基因定点突变方法可以用于检测与一些遗传性疾病有关的突变。
例如，通过扩增-测序方法可以检测BRCA1和BRCA2基因的突变，从而评估患者患乳腺和卵巢癌的风险。
此外，基因定点突变方法也可以用于基于个体遗传背景的个体化药物治疗。
在药物研发领域，基因定点突变方法可以用于评估药物的疗效和副作用。
通过引入特定的突变，可以模拟蛋白质靶点的突变，评估药物对该靶点的亲和力和选择性。
这对于开发更有效和安全的药物具有重要意义。
基因的定点突变的原理
基因的定点突变的原理基因的定点突变是指在DNA序列中的特定位置发生的突变，即碱基序列的改变。
这种突变发生在特定的位置，通常是基因编码区域，会引起氨基酸序列的改变，从而对蛋白质的功能产生影响。
定点突变的原理主要涉及以下几个方面：1. 突变的起源：定点突变可以是自发发生的，也可以是由外部因素引起的。
自发突变通常是由DNA复制过程中的错误引起的，包括碱基替换、插入或缺失等变异。
而外部因素如辐射、化学物质等也可能引起DNA损伤并导致定点突变。
2. 碱基替代：定点突变最常见的形式是碱基替代，即一个碱基被另一个碱基替代。
这种替代可能是同义突变，即替代后的密码子依然编码相同的氨基酸。
也可能是错义突变，即替代后的密码子编码不同的氨基酸，从而改变蛋白质的结构和功能。
3. 密码子的改变：在定点突变时，被替代的碱基往往位于密码子序列中的特定位置。
这种替代可能导致密码子的改变，从而改变蛋白质的翻译过程。
例如，突变可能导致起始密码子的改变，影响蛋白质的翻译起始，或者导致终止密码子的改变，影响蛋白质的翻译终止。
4. 功能影响：定点突变引起的氨基酸序列的改变可能会影响蛋白质的结构和功能。
如果突变发生在蛋白质的活性位点或功能域内，可能会影响蛋白质的结合能力、催化能力或信号转导等功能。
这种影响可能是有益的，例如产生对环境更有优势的适应性变异，也可能是有害的，例如导致疾病的发生。
总之，定点突变是指DNA序列特定位置发生的突变，可能是自发发生的或由外部因素引起的。
突变可以是碱基替代，导致密码子的改变，进而影响蛋白质的结构和功能。
这些突变的结果可能是有益的适应性变异，也可能是有害的疾病突变。
基因定点突变技术简介-sill
基因定点突变技术简介：一般来说，基因突变是不定向的，是随机的，且突变频率非常低。
而通过定点突变技术，可以按照预定设计，对某个已知基因的特定碱基进行定点增删或转换，最终改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，因此基因定点突变技术是蛋白质工程研究中的重要工具。
基因定点突变主要有以下三种方法：1.寡核苷酸介导的定点突变该方法以M13噬菌体的DNA为载体，在操作时，首先利用转基因技术，将待诱变的目的基因插入到M13噬菌体的正链DNA上，制备含有目的基因的单链DNA。
再使用化学合成的含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，启动单链DNA分子进行复制，这段寡核苷酸引物便成为新合成的DNA子链的一个组成部分，将其转入细胞后，经过不断复制，可获得突变的DNA分子。
Stratagene公司研制了QuikChangeLightning Site-Directed Mutagenesis Kit即是在此种方法上进行改良的：以含目的DNA的质粒为模板，在要突变处设计一对反向互补的引物，用高保真酶进行扩增，再用dpnI消化掉质粒模板，将已经形成环状的PCR产物转化进大肠杆菌就可以。
2．盒式定点突变该方法是利用一段人工合成的含有突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中相应序列。
这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当其退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端。
由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体。
但这种方法需要在靶DNA区段的两侧存在一对限制酶单切点，限制了该方法的使用。
3.PCR介导的定点突变经典PCR介导的定点突变法，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应(见图2)。
头两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA 片段经变性和退火可以形成具有3’凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。
基因定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR 产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以G CG→A CG为例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAG G CGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAG A CGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCG T CTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变原理
基因定点突变原理
基因定点突变是指基因序列中的一个或多个碱基发生变化，从而导致基因表达和蛋白质合成的不同。
基因定点突变可以是点突变、插入或删除突变等，其发生原因包括自然选择、环境压力和遗传漂变等。
基因定点突变的原理是DNA分子的结构和化学特性。
DNA分子由四种碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鸟嘌呤）组成，它们按照一定的规则排列在DNA的两个互补链上。
当一个碱基发生变化时，将导致基因序列的改变，影响到蛋白质的合成和功能。
基因定点突变的影响取决于突变的位置和类型。
有些突变可能会导致基因表达和蛋白质功能的改变，从而导致遗传病的发生。
而有些突变则可能没有显著的影响，因为它们在非编码区域或者不影响蛋白质功能的区域。
基因定点突变的发现和研究对于理解遗传学和发展基因治疗等
领域具有重要意义。
通过对基因定点突变的分析，可以预测某些遗传病的发病风险，同时也可以开发新的基因治疗方法，为人类健康事业做出贡献。
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基因的定点突变的原理
基因的定点突变的原理
基因的定点突变是指基因中某一个碱基发生改变，从而导致基因编码的氨基酸序列发生变化。
其原理可以归纳为以下几点：
1. 突变的发生是由突变原因所引起的，突变原因主要有自然突变和诱发突变两种。
自然突变是由于DNA复制过程中的错误所引起的，而诱发突变则是由于不同的生物或环境因素引起的。
2. 突变的类型可分为点突变和插入/缺失突变。
点突变是指单个碱基的改变，而插入/缺失突变则是指在基因中插入或者丢失一段碱基序列。
3. 定点突变是指发生在特定位置的突变，比如基因编码区域中的一个碱基发生改变，从而导致相应的氨基酸变化。
这种突变常常会影响到蛋白质的结构和功能。
4. 定点突变的发生和检测需要依靠基因测序技术。
现代测序技术能够高效准确地检测基因序列中的每一个碱基，从而判断基因是否发生了突变。
此外，通过人工合成基因的方法，可以精确地制造含有特定突变的基因序列，进而研究突变对蛋白质结构和功能的影响。
基因定点突变
基因定点突变一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。
二、定点突变的原理通过设计引物，并利用PCR将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的PCR产物，在PCR产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了。
三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复。
突变引物设计的特殊原则：（1）通常引物长度为25~45 bp，我们建议引物长度为30~35 bp。
一般都是以要突变的碱基为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为11-12 bp。
若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要11-12个bp才能与模板搭上，而这种突变PCR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补的引物。
（2）如果设定的引物长度为30 bp，接下来需要计算引物的Tm值，看是否达到78℃（GC含量应大于40%）。
（3）如果Tm值低于78℃，则适当改变引物的长度以使其Tm值达到78℃（GC含量应大于40%）。
（4）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置。
（5）最好使用经过纯化的引物。
Tm值计算公式：Tm=0.41×(% of GC)–675/L+81.5注：L：引物碱基数；% of GC：引物GC含量。
四、引物设计实例以GCG→ACG为例：5’-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3’（1）首先设计30 bp长的上下游引物，并将A (T)设计在引物的中央位置。
Primer #1: 5’-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3’Primer #2: 5’-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3’（2）引物GC含量为40%，L为30，将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm=75.5（Tm=0.41×40-675/30+81.5）。
基因定点突变
人工合成 具有突变 序列的 DNA片段
野生型基因
盒式诱变
应用：SOD酶化学修饰研究：
天然的SOD 稳定性较差，具有免疫原性，功能相 对单一，而限制了其应用，化学修饰可以增强酶稳 定性，降低免疫原性。 2003 年，赵数进，尹亮等用相对分子量为 2000~20000的PEG 修饰SOD，发现相对分 子量为6000 的PEG 修饰效果好 1986 年，袁勤生等用高碘酸钠氧化右旋糖酐成 二醛修饰SOD, 实验表明，修饰酶不仅完全保留了 天然酶的活性，而且在耐热性、耐酸性，抗胃蛋白 酶水解的能力等方面明显优于天然酶。
寡核苷酸定点突变
1）在克隆外源基因时，需要从已感染 M 13 的大肠杆菌细胞中获取含有 M 13 双链复制型 DNA ，将外源基因插 入到M 13 DNA 中； 2）在定点诱变时，需从培养液中分离 出 M 13 的重组噬菌体，并从中提取携 带外源基因 M 13 的单链重组 DNA 。 3）再进行体外定位诱变，人工合成一 段改变了碱基顺序的寡核苷酸片段 （8~18bp），以此作为引物，在体外 合成互补链，获得含有错配碱基的完整 双链 M 13 DNA ， 4）双链 M 13 DNA转染大肠杆菌， M 13 在大肠杆菌中扩增，形成噬菌斑。 理论上一半是野生型，另一半则含有突 变基因。用诱变的寡核苷酸引物作为探 针，通过杂交即可鉴定出突变体。
PCR定点突变
整个反应体系为50μl，其中含无菌去离 子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、 P2引物各1μl，pESOD质粒1μl(约 100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反应 条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性 1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25个 循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
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盒 式 诱 变
人工合成 具有突变 序列的 DNA片段
野生型基因
应用：SOD酶化学修饰研究：
天然的SOD 稳定性较差，具有免疫原性，功能相 对单一，而限制了其应用，化学修饰可以增强酶稳 定性，降低免疫原性。 2003 年，赵数进，尹亮等用相对分子量为 2000~20000的PEG 修饰SOD，发现相对分 子量为6000 的PEG 修饰效果好 1986 年，袁勤生等用高碘酸钠氧化右旋糖酐成 二醛修饰SOD, 实验表明，修饰酶不仅完全保留了 天然酶的活性，而且在耐热性、耐酸性，抗胃蛋白 酶水解的能力等方面明显优于天然酶。
GCC
+ polymerase
CAG GCC
(4)
translation
Thr
Juang RH (2004) BCbasics
Mutant protein
replication
Smith (1993)
Only one amino acid changed Val → Thr
寡核苷酸定点突变
(2)PCR介导的定点突变
结果
定点突变后3个质粒测序结果及突变前后序 列对比3个质粒的测序结果有2种，分别和文 献的Cu，Zn-SOD序列对比： 其中1个质粒测序结果和Cu,Zn-SOD基因 序列完全一致，说明突变未成功； 另外2个质粒分别有2个碱基和Cu,Zn-SOD 因序列不同，也就是Cys的密码子TGC变成 了Ala的密码子GCC，其他序列与Cu，ZnSOD基因一致，符合预期要求。
利用酶作为催化剂进行生物催 化与生物转化，已成为生产精细化 学品、手性药物、食品添加剂等的 重要工具,获得了广泛应用。
天然酶的局限-源于酶的自然进化过程
天然的生物催化剂存在着无法适应工业化生产中非 自然条件的限制天然酶用于工业生产 不能很好地适应环境的转变，较差的溶解性不稳定 性以及苛刻的酶促反应条件使其不适于大规模应用 酶在活细胞的复杂条件下，底物或产物之一可能 会强烈抑制酶生物催化过程的活力 在非水溶液中酶不能够接受不同的底物
SOD酶化学修饰研究：
有关SOD 化学修饰开展的工作，用来作为 修饰剂的分子有脂肪酸、糖、蛋白质及维生 素等, 但未发现用激素作为修饰剂。 有报道：褪黑素MT，化学名称为N-乙酰5-甲氧基色胺，，研究表明它是一种抗氧化 剂，可有效清除化学反应中产生的羟自由基。 修饰酶MT－SOD， 保留SOD 的歧化活性 的同时，也具备MT 清除自由基的能力以及 MT其他的生理功能。
Point Mutations(碱基替代)
5’…T-A-C…..3’ 3’...A-T-G……5’ A-A-C T-T-G T-A-G A-T-C T-A-T A-T-A T-A-C A-T-G Transcription A-A-C
Aspargine codon
Gene Replication 基 因 定 点 突 变
引物
A G A G T A
N 体定突 图21- D A的 外 点 变
寡核苷酸定点突变基本原理
★利用人工合成带突变位点的寡聚核苷酸作为引物， 利用M13噬菌体载体系统合成突变基因。 ★首先将待诱变的基因克隆在M13噬菌体载体上， ★另外，人工合成一段改变了碱基顺序的寡核苷酸片 段（8~18bp），以此作为引物，在体外合成互补 链， ★再经体内扩增基因，经此扩增出来的基因即是突变 了的基因。
SOD酶化学修饰研究：
1994 年，阎家麟、谢文正等用被氯化亚砜活化 的月桂酸修饰牛血Cu,Zn-SOD ，其活性回收率 为93%，修饰率为80%，半衰期明显延长，蛋 白质的免疫原性降低，热稳定性及抗蛋水解酶的能 力也明显增强。 1996 年，邹国林，胡萍等用膜脂成分的硬脂酸 作为修饰剂，对SOD 进行化学修饰。修饰SOD 对温度、pH、蛋白酶水解的稳定性比天然SOD 增强，且免疫原性消除，在低浓度的某些有机介质 中活性比在水中高。
在最初所建立的 PCR 方法中 就可看出只要引物带有错配碱 基，便可使 PCR 产物的末端 引入突变。但是诱变部位并不 总在 DNA 片段的末端，有 时也希望对靶 DNA 的中间 部分进行诱变。 目前采用重组 PCR 进行定位 诱变，可以在 DNA 片段的 任意部位产生定位突变。
PCR介导的定点突变
定向进化技术
人为地创造特殊的进化条件，模拟自 然进化机制，在体外对基因进行随机突 变，从一个或多个已经存在的亲本酶（天 然的或者人为获得的）出发，经过基因的 突变和重组，构建一个人工突变酶库，通 过一定的筛选或选择方法最终获得预先期 望的具有某些特性的进化酶。
PCR定点突变
整个反应体系为50μl，其中含无菌去离 子水41μl，10×Pfu Polymerase Buffer(含Mg2+)5μl，20μmol／L P1、 P2引物各1μl，pESOD质粒1μl(约 100ng)，Pfu DNA聚合酶1μl(5U)；反应 条件为：94℃预变性3min；然后94℃变性 1min，65℃ 30s，72℃延伸7min，25个 循环；最后72℃延伸7min，4℃保存。
SOD酶基因定点突变修饰研究：
铜锌超氧化物歧化酶(Cu，Zn-SOD) 在体 内停留时间短(通常只有6～10min)，使 得Cu，Zn-SOD的应用受到很大限制。 本研究采用一种近年来新的定点突变技术― 快速PCR定点突变方法成功地对Cu，ZnSOD进行了基因改良，将Cu，Zn-SOD基 因中非活性中心的Cys111密码子突变为 Ala密码子，以提高其稳定性。
U-A-G
Stop codon
U-A-U
Tyrosine codon
U-A-C
Tyrosine codon
m-RNA
Translation Normal Wild type
Missense
Incomplete Normal Nonsense Silent
点 突 变 的 结 果
碱基替代
碱基替代
碱基替代插入或缺失
需要4条PCR引物:分 别是含有突变的碱基并 且反向部分重叠的引物 A,A’,以及与目的基因两 端互补的引物B,C. 任何基因，只要两端 及需要变异的部位的序 列已知，就可用 PCR 诱 变去改造基因的序列。
PCR介导的定点突变
首先,引物A, B和A’ ,C两 两配对,分两管进行第一次 PCR,产生两个部分重叠的 DNA片段. 然后将上述两管PCR产物 混合,变性再复性,在DNA 聚合酶的作用下延伸产生 完整的双链DNA, 用引物B,C,以新合成的完 整双链DNA为模板进行第 二次PCR,即可得到含有预 期突变位点的DNA片段.
第五讲
基因定点突变和酶定向进化技 术及应用
一 基因定点突变技术及应用
1 体外定点突变技术的目的
基因定点突变是指按照设计的要求，使基因的特定 序列发生插入、删除、置换和重排等变异。 体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的 关系的有力工具。 蛋白质的结构决定其功能，对某个已知基因的特定 碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应 的氨基酸序列和蛋白质结构和功能,改造酶的不同 活性或者动力学特性
寡核苷酸定点突变
1）在克隆外源基因时，需要从已感染 M 13 的大肠杆菌细胞中获取含有 M 13 双链复制型 DNA ，将外源基因插 入到M 13 DNA 中； 2）在定点诱变时，需从培养液中分离 出 M 13 的重组噬菌体，并从中提取携 带外源基因 M 13 的单链重组 DNA 。 3）再进行体外定位诱变，人工合成一 段改变了碱基顺序的寡核苷酸片段 （8~18bp），以此作为引物，在体外 合成互补链，获得含有错配碱基的完整 双链 M 13 DNA ， 4）双链 M 13 DNA转染大肠杆菌， M 13 在大肠杆菌中扩增，形成噬菌斑。 理论上一半是野生型，另一半则含有突 变基因。用诱变的寡核苷酸引物作为探 针，通过杂交即可鉴定出突变体。
Site-directed mutagenesis
Wild type
CAG GTC
(1)
CAG GTC 重组 DNA 野生双链
(5)
translation
Val
CAG
(2)
Wild type protein + primer
CAG CGG 突变引物 GCC 突变双链
(6)
Mutant
primer
(3)
2 体外定点突变的方法
具体方法有三种： (1)寡核苷酸介导的定点突变 (2)PCR介导的定点突变 (3)盒式突变
（1）寡核苷酸介导的定点突变
寡聚核苷酸定点 诱变技术是由加 拿大的生物化学 家（michael smith，1932-） 发明的。
寡核苷酸定点突变基本原理
合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作 为引物，其中含有所需要改变的 碱基，使其与带有目的基因的单 链 DNA 配对。 合成的寡核苷酸引物除短的错配 区外，与目的基因完全互补。 然后用 DNA 聚合酶使寡核苷酸 引物延伸，完成单链 DNA 的复 制。 由此产生的双链 DNA ，一条链 为野生型亲代链，另一条为突变 型子代链。 将获得的双链分子通过转导入宿 主细胞，并筛选出突变体，其中 基因已被定向修改。
1993年,美国科学家Arnold F H 首先提出酶分子的定向进化的概 念，并用于天然酶的改造或构建新 的非天然酶。
定向进化（Directed evolution）是近20年发 展起来的一项新技术，是达尔文的进化论思想 在核酸、肽或蛋白等分子水平上的延伸和应用 它不需要深入了解蛋白质的结构功能关系，在 实验室条件下人工模拟生物大分子自然进化过 程，在体外对基因进行随机诱变，使基因发生 大量变异，并定向选择出所需性质的突变体， 可以在短时间内实现自然界几百万年才能完成 的进化过程
菌株与质粒
E.coli DH5α，由本实验室保存 质粒pESOD(含Cu，Zn-SOD基因、Ampr 基因以及EcoRI酶切位点，整个质粒约 33kb)，由实验室构建，并转化于E.coli DH5α保存。