生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology
生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology
(5)所有溶液应加DEPC至0.1％，室温处理过夜， 或室温下磁力搅拌20分钟，然后高压蒸汽灭菌 处理（或加热至70℃1小时或60℃过夜，以去 除所有残留的DEPC）。
(6)所用的化学试剂应为新包装，称量时使用干 烤处理的称量勺。所有操作均应在冰浴中进行， 低温条件可减低RNA酶的活性。
2.核酸的分离、纯化应达到以下三点要求： ①排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子
时，应去除RNA分子，反之亦然； ②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分
子的污染应降低到最低程度； ③核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有
机溶剂和过高浓度的金属离子。
3.为了保征分离核酸的完整性和纯度，在实验 过程中，应注意以下事宜： ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少 各种有害因素对核酸的破坏； ②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、 过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在 pH4-10条件下进行；
如何抑制内源性RNase的活性？
要尽可能早地去除细胞内蛋白，加入 RNase 抑 制 剂 ， 力 争 在 提 取 的 起 始 阶 段 对 RNase活力进行有效地抑制。
RNase抑制物： （1）低特异性RNase抑制物： 不同类型的低特异性RNase抑制物均可不同 程度地抑制Raise的活性，其中包括 DEPC 皂土(bentonite):Al2O3·4SiO2·H2O 复合硅酸盐(Macaloid) 肝素 氧钒基—核苷复合物 多胺
生物技术专业综合实验的设计与教学实践
生物技术专业综合实验的设计与教学实践
摘要：生物技术是一门以实验为基础的学科，合理设置生物技术综合实验教学内容、整合实验教学课程、改革教学效果评价体系，对于培养学生的科研创新精神，提高学生动手实践能力，对实验教学质量的提升以及创新应用型人才的培养都会起到积极的促进作用。
关键词：生物技术综合实验实验教学
作为一门新兴学科，生物技术具有涉及领域宽、涵盖范围广、基础性强的特点，也是现代生物学发展并与相关学科交叉融合的产物。包括了基因工程、蛋白质工程、细胞工程、发酵工程等领域。新时代的教学改革要求生物技术专业理论结合实际，充分发挥实验教学的作用，培养学生科研创新能力以及实践操作能力[1]。目前实验教学在不同程度上仍然是理论教学的辅助内容和手段，实验方法多以验证已知结果作为主要目标，这种教学模式的优点是与理论教学环环相扣，但同时具有以下缺点：第一，实验课内容缺乏学科间的互相联系，无法达到实验技能的系统训练，而生物技术是一门交叉学科，通过单独设置的实验课程很难形成系统的知识框架体系；第二，实验内容在技术手段上容易出现重复，由于各门课程在实验课上自成体系，课程之间往往开设性质和内容
上有所雷同；第三，实验内容相对陈旧，多以验证性实验为主，没有随着科学技术的发展而及时更新；第四，实验室开放不够全面，教学资源无法得到充分利用，第五，学生的创造能力和学习热情得不到充分的发挥。以上缺点严重制约着创新性人才的成长与培养。针对上述不足，为了加强学生实践能力和创新能力的培养，通过以下几个方面对生物技术综合实验教学方法进行了改革和实践，并取得了理想效果。
生物技术综合实验
金属螯合亲和层析
a. 许多蛋白分子上带有金属离子，则此蛋白质可 能会吸附该金属。 b. 若把某金属固定到固相载体上，则此载体将会 专一性地吸附需要此金属的蛋白质。 c. 基因操作时，经常在表达蛋白质的末端加上一 段含有六个 His 的片段；则此表达蛋白质，可以 吸附到含有镍的吸著剂上，可以用咪唑流洗出 来。 d. 这种载体上结合有某些可与金属产生配位键 的基团 (如 nitrilotriacetic acid)，这些基团与金 属离子结合 (如镍离子)后，即可成为亲和吸附剂。
特异性配体亲和层析法与通用性配 体亲和层析法
特异性配体亲和层析法：配体一般为复杂的生 命大分子物质（如抗体、受体和酶的类似底物 等），它具有较强的吸附选择性和较大的结合 力。
通用性配体亲和层析法：配体则一般为简单的 小分子物质（如金属、染料，以及氨基酸等）， 它成本低廉、具有较高的吸附容量，通过改善 吸附和脱附条件可提高层析的分辨率。
两大类离子交换介质
由介质带电基团的不同，可分为两大类： 介质－带电基团(counter ion) (1) 阳离子交换介质 (cation exchanger)： 载体-阴离子基团 ..... 阳离子 (2) 阴离子交换介质 (anion exchanger)： 载体-阳离子基团 ..... 阴离子
1 表达蛋白质的分离沉淀
蛋白质分离
培养基
收集菌体 洗涤
生物学教育综合试验
生物学教育综合实验
Comprehensive Experiment of Biological Education
【课程编号】021*******【课程类别】学科基础课
【学分数】4学分【适用专业】生物科学
【学时数】 128学时【编写日期】 2009年6月
一、教学目标
本课程是在生物化学、发育生物学及现代生物技术等理论课的基础上，开设的一门基础性兼综合与设计性实验课。该课程的教学内容主要突出实验技术的基础性和实用性，把目前最基本的生化、发育生物学及现代生物技术等领域的研究技术融入具体的系列实验中形成综合与设计性大实验，一方面让每个同学通过实际操作来达到更好地训练学生们的实验技术技能的目的；另一方面让学生学会现代生物技术常规的仪器设备及部分大型仪器设备的使用，并进一步培养学生的创新思维和独立分析问题、解决问题的能力，提高学生从事科学研究的综合素质。
二、教学内容和学时分配
实验一、实验总论4学时基础性
主要内容：课程设计思路简介，实验准备（清理仪器、配置试剂等）。
教学要求：了解生物学教育综合实验课的目的与要求、评分标准及仪器操作要求。
重点、难点：理论学习与试剂的配置。
实验二、碱性磷酸酶的分离纯化及其纯化参数测定28学时综合性
主要内容：
大肠杆菌单菌落碱性磷酸酶的诱导表达，菌体收集和超声破碎，分离纯化碱性磷酸酶（离子交换层析法、硫酸铵沉淀法和分子筛层析法），样品的浓缩与保存、分离纯化参数的测定、分离纯化过程的提纯倍数与回收率的确定以及SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。
教学要求：
了解蛋白质分离纯化的基本过程；
生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology课件
转化( transformation)： a．用新鲜制备的（或从-80℃冰箱中取出置冰上5
分钟至刚好解冻的）感受态细菌100μl感受态 细菌至预冷管中。 b．加入1-50ng DNA，用微量移液器吸头搅动两次， 以便DNA扩散均匀，用手指弹动管壁数次。 c．马上放置冰上30分钟。
宿主细胞是基因克隆载体的增殖场所，对于一 个适当的宿主细胞，具有以下几个要求： ①对重组子的复制和扩增没有严格的限制； ②不存在特异的内切酶体系降解重组子； ③在重组子增殖过程中，不对载体DNA进行修饰； ④不会产生载体DNA的体内重组； ⑤容易导入重组子； ⑥符合“重组DNA操作规则”的安全标准。
在基因克隆技术中，重组子导入受体细胞有 两个概念： ➢转化(transformation or introduction)：特 指以质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细 菌的过程。 ➢转染(transfection)：是指噬菌体、病毒或以 它作为载体构建的重组子导入细胞的过程。
高效率感受态细胞的制备（氯化钙转化法）: 操作步骤 ( protocol)：
生物技术综合实验
Comprehensive experiments of biotechnology
《生物技术综合实验》教学大纲
《生物技术综合实验》实验课程教学大纲
课程名称(中文) 生物技术综合实验
课程名称(英文) Comprehensive Experiments of Biotechnology
课程编号33101105
课程类型专业必修课
教材名称《生物技术综合实验指南》（陆勇军等）自编教材
是否独立设课是√否
学时学分:总学时 108 总学分 3 实验学时108实验学分3
开出时间：四年级第十学期
适用专业生物技术专业、生物技术及应用专业、逸仙班
先修课程《生物化学》、《生物技术学》、《微生物学》、《遗传学》
备注：课程类型分为公共必修课、公共选修课、专业必修课、专业选修课
一、课程简介及基本要求
本课程是一门综合性实验课程。要求学生在掌握生物化学、生物技术学、微生物学和生物化学技术原理等的基础上，学习和掌握生物技术实验的基本原理和技术，主要包括基因工程常规操作（如从生物材料中提取功能基因、再把该基因克隆到载体DNA上。然后转化至细菌或酵母中进行表达等）技术及一系列生物大分子的提取（包括从微生物、动物或植物材料中提取）、分离、纯化的方法和技术。了解并掌握各种常规生化仪器及发酵器材的使用和保养；培养和训练学生具有良好的科研素质、有较强的分析问题和解决问题的能力，为今后独立从事生物技术及相关学科领域的研究奠定基础。
二、课程目的及要求
1.通过实验综合运用各门理论课相关知识，并加深理解。
2.培养学生实事求是的科学品德、团结合作的科学工作精神、善于思考和分析、解
决问题的能力，全面提升他们的科研素质，为今后独立从事生物技术及相关学科
生物技术制药综合实验的探索与实践
生物技术制药综合实验的探索与实践
生物技术制药是一项重要的领域，发展迅猛，涉及广泛。为了进一步提高生物技术制药方面的实验能力，研究生物技术制药方面的理论知识和技术手段，我们开展了生物技术制药综合实验的探索与实践。
一、实验内容
1. 基因克隆
基因克隆是生物技术制药的基础，本次实验通过pBluescript SK(+)载体、菌株DH5α及质粒DNA的构建，练习了基因克隆的整个过程，包括连接酶切DNA、转化细胞肢、种植菌落、提取质粒DNA、限制性内切酶切割和凝胶电泳分析等。
2. 细胞培养
细胞培养是生物技术制药中非常重要的一项技术，为了掌握细胞培养的技术，我们用了人肝癌细胞株Hep3B和COLO320细胞，进行细胞培养、细胞分裂周期的测定和细胞药物敏感性实验。
3. 表达与纯化
表达与纯化是生物技术制药中非常重要的一部分，本次实验使用重组质粒
pET28a-SUMO-IL-2和BL21(DE3)菌株，通过诱导表达和亲和层析纯化等步骤，获取目的蛋白重组人白细胞介素2(rhIL-2)。
4. 免疫技术
免疫技术在生物技术制药中有着广泛应用，本次实验重点涉及到酶联免疫吸附实验ELISA和免疫印迹实验Western Blot。ELISA用于检测目的蛋白的质量，Western Blot用于检测目的蛋白的表达和识别。
二、实验过程
在实验的过程中，我们重点学习了基因克隆和表达纯化技术的方法和步骤，进行了反复实验和优化，完善了相应的实验方案，同时搭配了其他实验环节，如细胞培养和免疫技术实验等，全面提升了自身的实验技能和理论知识。
生物技术综合试验虚拟仿真试验教学-桂林医学院生物技术学院医药
生物技术综合实验虚拟仿真实验教学
2.实验教学项目描述
2-1名称
生物技术综合实验
2-2实验目的
生物技术综合实验由移液枪基本操作、重组质粒提取、DNA琼脂糖凝胶电泳、医学细胞培养综合实验、普通PCR、紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度、RNA逆转录、荧光定量PCR、蛋白质变性与SDS-PAGE电泳、Western Blot检测蛋白表达等多个虚拟仿真实验组成。本实验的目的是使学生熟悉分子细胞生物学实验常规仪器设备的使用，包括移液枪、摇床、离心机、电泳仪、细胞培养箱、超净工作台、紫外分光光度计以及PCR仪等；掌握质粒提取、DNA电泳、细胞培养、逆转录、荧光定量PCR、蛋白质电泳及Western Blot等原理、相关知识点和具体实验操作；串联分子克隆、细胞培养、基因相对定量检测以及蛋白分析等知识，使学生所学分子生物学、细胞生物学、遗传学以及基因工程等知识融会贯通，系统的掌握生物技术核心知识。
2-3实验原理（或对应的知识点）
生物技术综合实验由多个实验组成，现对实验原理进行分别说明：
重组质粒提取的原理：挑单一菌落，在含抗生素的LB培养液中培养扩增。离心收集扩增了的大肠杆菌，用碱性液裂解细菌，再经酸性液形成钾-SDS-蛋白质-膜复合物，离心后，此复合物与细菌染色体DNA、高分子量的RNA得到沉淀，而细菌中小分子量的质粒溶液上清之中，经乙醇沉淀课可得到质粒DNA。
DNA琼脂糖凝胶电泳原理：琼脂糖是从琼脂中提取的一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。DNA在碱性条件下（pH8.0的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和构型不同，在电场中的泳动速率液不同。溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，
《生物技术综合实验》教学大纲
《生物技术综合实验》教学大纲
课程编号：
课程名称：生物技术综合实验
实验学时：80
一、本实验课的性质、任务与目的
生物技术综合实验技术已成为实验技能综合训练和培养不可缺少的一部分。本课程训练学生实际综合能力培养和操作。要求学生充分掌握多种技术的应用，提高学生在综合实验技术方面的动手能力，为参加科研实践打下坚实的基础。
二、本实验课所依据的课程基本理论
《生物化学》、《微生物学》、《分子生物学》、《基因工程》、《酶工程》和《下游加工技术》等生物技术专业的专业基础课和专业课。
三、实验类型与要求
1. 实验类型：总体为综合型。设计为目标明确、逻辑性强和连贯性好的大实验，即以纤维素酶基因的克隆和表达为主线，将多门课程所涉及的实验内容串联成综合性大实验，达到实验前后连贯，步步论证，提高良好的综合实验技术能力和水平。
2. 实验要求：必修
四、实验项目与实验学时分配
五、考核方式与评分办法
实际操作和实验报告分别占50％和50％。
六、本实验课配套教材或实验指导书
实验指导书：生物技术综合实验
参考书：
1．魏群.分子生物学实验指导.北京：高等教育出版社，2007
2．朱旭芬. 基因工程实验指导。北京：高等教育出版社，2006
3．周俊宜.分子生物学基本技能和策略.北京：科学出版社,2003
4. [美]J.萨姆布鲁克等.分子克隆实验指南.北京：科学出版社,2005
5. 刘箭。分子生物学及基因工程实验教程。北京：科学出版社,2008
七、实验报告要求
实验报告的内容包括：实验名称、日期、目的、实验原理、实验仪器设备与材料、实验步骤，实验结果及分析讨论。
关于生物技术综合实验报告
关于生物技术综合实验报告
生物技术综合实验
甘薯Y -谷氨酰半胱氨酸合成酶(Y -GCS)基因的克隆和
原核表达
学生：学号：
同实验者：
谷胱甘肽(glutathione, GSH)GSH具有多种重要生理功能，抗自由基和抗氧化应激作用，保护细胞膜的完整性等。
Y -GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶，可以调控GSH 的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫过程中起着重要作用，说明Y -GCS也与植物抗逆
过程密切相关。
实验一甘薯叶片RNA提取
一、实验目的
1. 了解真核生物RNA提取的原理；
2. 掌握Trizol提取的方法和步骤。
二、实验原理
Trizol试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快
速抽提总RNA勺试剂，在匀浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA勺完整性。TRIzol的主要
成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白，
核酸物质解聚得到释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8—羟基喹啉、异硫氰酸胍、B -巯基乙醇等来抑制内源和外源RNaseb %的8—羟基喹啉可以抑制RNase,与氯仿联合使用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，导致细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。B -巯基乙醇的主要作用是
破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA用这种
方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少。
生物技术综合实验教学设计
生物技术综合实验教学设计
引言
生物技术是21世纪最具应用前景的新兴科技之一，它广泛应用于
医药、食品、农业、环境等领域。为了培养生物技术领域的专业人才，高校生物类专业开设了相关的课程，其中实验教学是非常重要的一环。本文主要介绍了一种生物技术综合实验教学设计，旨在提高学生的实
际操作能力和综合素质，培养其生物技术相关的应用能力。
实验目的
1.掌握基本的实验操作技能及常用实验仪器的使用方法；
2.学会运用生物技术的基本原理进行实验；
3.加深对生物技术相关知识的理解，并进一步培养创新能力
和科学素养；
4.培养学生良好的团队协作精神和实践能力。
实验内容及方法
1.实验主题：酶解法制备小分子多肽
2.实验内容：
•酶解鸡蛋白制备小分子多肽
•净化小分子多肽
•鉴定小分子多肽的合成情况
3.实验方法：
•酶解鸡蛋白方法：鸡蛋白加入水后均匀混合，加入适量酶液，在37℃恒温恒湿下培养一定时间。
•净化小分子多肽方法：将酶解后的鸡蛋白液使用柱层析法进行分离，收集目标组分并洗脱。
•鉴定小分子多肽的合成情况方法：运用紫外分光光度计测量目标组分的吸光度和A280/A260比值，并进行SDS-PAGE电泳。
实验步骤及时间安排
实验步骤时间安
排
第1周
确定实验方案、组织实验分组，并安排实验室场地及实验仪
器设备
第2周
熟悉实验步骤、安全注意事项和实验记录方法、了解小分子
多肽的相关知识
进行酶解反应，收集取样；制备半制备柱层析，净化溶液并
第3周
进行样品收集
第4周
继续进行净化并确定目标组分；进行SDS-PAGE电泳实验，分
析结果，制备文章
实验总结及实验报告撰写（包括实验过程、数据处理及结果
生物技术综合实验指导手册
生物技术综合实验
实验指导
适用专业：生物技术
鲁东大学生命科学学院
鲁大生科 2006
目录
第一部分、综合性实验 (4)
综合项目一、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选 (4)
实验一、培养基配制及样品采集 (4)
实验二、样品处理及初筛 (5)
实验三、α-淀粉酶产生菌的分离与筛选 (6)
综合项目二、酵母菌的诱变育种 (8)
实验四、培养基配制和菌种活化 (8)
实验五、酵母菌的诱变处理 (9)
实验六、呼吸缺陷型菌株的初筛 (10)
实验七、呼吸缺陷型酵母菌的验证 (11)
综合项目三、谷氨酸发酵及提取工艺 (12)
实验八、谷氨酸菌种的制备 (12)
实验九、谷氨酸的中糖发酵及控制 (13)
实验十、发酵液中谷氨酸的回收及精制 (15)
综合项目四、红曲发酵及红曲色素的提取 (17)
实验十一、红曲液体菌种的制备 (17)
实验十二、红曲固体发酵 (18)
实验十三、红曲色素的提取及色价测定 (19)
综合项目五、糖化酶的发酵和提取 (22)
实验十四、培养基的配制和菌种活化
实验十五、糖化酶的摇瓶发酵
实验十六、糖化酶的提取、浓缩、活性测定
第二部分：设计性实验 (25)
设计性实验要求 (25)
设计项目一、摇瓶发酵法生产柠檬酸 (26)
设计项目二、固体发酵法生产柠檬酸 (29)
设计项目三、α-淀粉酶生产 (32)
设计项目四、酵母细胞的固定化 (33)
第三部分附录 (36)
附录一、中试发酵设备的使用方法 (36)
附录二、气升式生化反应器的使用 (38)
附录三、发酵液中还原糖的测定方法 (40)
附录四、谷氨酸浓度测定法 (42)
附录五、α-淀粉酶的测定方法 (43)
关于生物技术综合实验报告
关于生物技术综合实验报告
生物技术综合实验
甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表达
学生：学号：
同实验者：
谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多种重要生理功能, 抗自由基和抗氧化应激作用, 爱惜细胞膜的完整性等。γ-GCS是植物细胞中GSH生物合成的限速酶, 能够调控GSH的生物合成量。GSH在生物体抵御冷害、干旱、重金属、真菌等胁迫进程中起着重要作用, 说明γ-GCS也与植物抗逆进程紧密相关。
实验一甘薯叶片RNA提取
一、实验目的
1. 了解真核生物RNA提取的原理；
2. 把握Trizol提取的方式和步骤。
二、实验原理
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀浆和裂解进程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成份的同时维持RNA的完整性。TRIzol 的要紧成份是苯酚。苯酚的要紧作用是裂解细胞，使细胞中
的蛋白，核酸物质解聚取得释放。苯酚虽可有效地变性蛋白质，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中还加入了8－羟基喹啉、异硫氰酸胍、β-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。%的8－羟基喹啉能够抑制RNase，与氯仿联合利用可增强抑制作用。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质并使蛋白质二级结构消失，致使细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离。β-巯基乙醇的要紧作用是破坏RNase蛋白质中的二硫键。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方式取得的总RNA中蛋白质和DNA污染很少。
教学大纲-本科生 生物技术综合实验--上课版 内容较多 2013-5-25
《生物技术综合实验》课程教学大纲
（English）
一、课程说明
课程编码：
课程总学时：24
周学时：3
学分：2
1．课程性质：
专业必（选）修课
2．适用专业与学时分配：
适用生物技术专业。
教学内容与学时分配
3．课程教学目的与要求：
生物技术综合实验是生物技术专业的一门专业基础课程，是一门独立的实验课程，同时也是为了配合分子生物学和基因工程的教学而开设的。实验过程中，首先将有关的基本原理、基本技术和方法给学生做一介绍，在学生掌握了以上基本知识的基础上给定实验内容和目的，让学生自己动手，并出一定的实验结论。希望通过本实验培养学生主动学习、学以致用、独立思考的能力。
4．推荐教材及参考书：
推荐教材：《分子克隆实验指南：第三版（上下）（全二册）》，〔美〕J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，北京：科学出版社，2008 年.
参考书目：
（1）《现代分子生物学实验原理与技术》，陈德富，陈喜文，北京：科学出版社，2011 年。
（2）《分子生物学及基因工程实验教程(第二版)》，刘箭、吴春霞、曹雪松、王元秀、宿红艳，北京：科学出版社，2011 年。
（3）《分子生物学实验技术》，屈伸，刘志国．北京：化学工业出版社，2008。
5．课程考试方法与要求：
考核方式：考试（考查）
评分标准：50%平时成绩：包括出勤、实验操作，实验效果、讨论情况等实验能力+ 50%实验报告
6．实验教学改革：
……
二、教学内容纲要
实验一分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备的使用（3学时）
1．【实验目的】：
在基因工程实验中，实验人员经常要接触到一些对人体有害的实验试剂，如有致癌作用的溴化乙锭（EB）、丙希酰胺等，它们或者可能诱发癌症，或者对人的神经系统产生累积毒害。因此，每一个人都应严格按照实验安全操作的有关要求进行操作。
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一、核酸分离提取的原则
1.分离纯化核酸总的原则 2.①应保证核酸一级结构的完整性； 3.②排除其它分子的污染，保证较高纯度。
2.核酸的分离、纯化应达到以下三点要求： ①排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子
时，应去除RNA分子，反之亦然； ②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分
子的污染应降低到最低程度； ③核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有
3.DNA沉淀：一般采用2倍体积乙醇沉淀 或用异丙醇（0.6）
4.DNA溶解：一般采用TE
方法一：酚抽提法（见实验指导p20）
DNA பைடு நூலகம்xtraction
从外周血提取基因组DNA的步骤 PROCEDURE OF DNA EXTRACTION FROM BLOOD.doc
三、RNA的分离与纯化 -真核细胞RNA的制备
于样品中的组织细胞。
怎样去除外源性RNase的污染？
(1)操作者的手直接触摸之处，毫无疑问会留下 RNase，说话带出的唾液也富含RNase。故整 个操作过程中，应戴口罩和手套。
(2)空气中飞尘携带的细菌、霉菌等微生物，也 是污染外源RNase的一条途径，所以操作过 程应在比较洁净的环境中进行。
其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+，Ca2+的 激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸 (EDTA)、柠檬酸盐，基本上可以抑制DNA酶的活 性。
而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品， 而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生 物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
二、真核细胞染色体DNA的制备
生物技术综合实验
Comprehensive experiments of biotechnology
教学要求
通过教学，要求学生掌握分子生物学与基因工程的 基本理论，巩固所学的理论知识；
使学生了解科研工作的基本思路，学会如何设计实 验，如何分析实验，培养分析问题和解决问题的能 力；
培养和训练学生的基本实验技能，培养学生的独立 工作能力和创造能力。
（2）为了获得大分子量的DNA，一般采用 蛋白酶K和去污剂温和处理法。
2. 去除蛋白质 常用酚、氯仿抽提。反复的抽提操作对DNA
链的机械剪切机会较多，所以有人使用高浓度 甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可以获得 200kb以上的DNA片段，适用于粘粒(cosmid)构 建基因组文库。
根据不同的实验要求，可选择不同的实验 方法制备真核细胞染色体DNA。
掌握真核生物基因组DNA的提取的 基本原理。
提取高质量基因组DNA的主要用途： PCR扩增的模板 用于构建基因组文库 用于Southern blot 杂交分析
真核细胞染色体DNA的制备过程
1. 真核细胞的破碎 （1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮
破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可 导致DNA链的断裂。
reesei induced by different inducers 图1. 木霉总RNA的分离 1. 微晶纤维素 2. 天然稻草粉
RNA 分离的关键因素是尽量减少 RNA酶的污染！
如何创造一个无RNase的环境 ？ ➢极力避免外源RNase的污染：主要来源于
操作者的手、实验的器皿和试剂 ➢尽力抑制内源性RNase的活力：主要来源
核酸的种类： ➢ 真核生物的染色体DNA为双链线性分子；真核细胞
器DNA为双链环状分子； ➢ 原核生物的基因组DNA、质粒DNA为双链环状分子； ➢ RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不
同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核 mRNA分子多数在3’端带有ploy(A)结构;tRNA 的 三叶草结构。 ➢ 病毒的DNA、RNA，其存在形式多种多样，有双链环 状、单链环状、双链线状和单链线状等。
机溶剂和过高浓度的金属离子。
3.为了保征分离核酸的完整性和纯度，在实验 过程中，应注意以下事宜： ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少 各种有害因素对核酸的破坏； ②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、 过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在 pH4-10条件下进行；
③减少物理因素对核酸的破坏，物理破坏因素 主要是机械剪切力，其次是高温。 ④防止核酸的生物降解，细胞内或外界的各种 核酸酶（ DNA酶、 RNA酶）酶解核酸链中的磷 酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。
掌握基因重组的基本过程，如：核酸DNA、RNA 和质粒DNA提取、酶切、连接、转化及重组子的 酶切鉴定等技术。
掌握外源基因的表达技术和蛋白质电泳分析技术， 蛋白质提取、分离和纯化技术。
核酸的分离与纯化
Isolation and purification of nucleic acids
不论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分 子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核 酸的分离与提取是生化与分子生物学研究中非 常重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关 系到实验的成败。
从细胞中分离RNA的纯度与完整性对于许多 分子生物学实验至关重要。如Northern blot及 cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度 上决定于RNA的质量。
RNA主要由以下几类分子组成：rRNA(占RNA 总量的80％—85％)、tRNA和核内小分子 RNA(占10％-15％)、mRNA(占1％～5％)。
rRNA在总RNA分子中含量最丰富 ，由28S、 18S、5S及4S几类组成，它们之间同源性大， 分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分 子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子 交换层析进行分离。
mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在 细胞中含量少，绝大多数mRNA分子(除血红蛋白 及 有 些 组 蛋 白 mRNA 以 外 ) ， 均 在 3’ 端 存 在 20250个多聚腺核苷酸poly(A)。利用此特征，可 很方便地从总RNA中，用寡聚(dT)亲和层析柱分 离mRNA。
mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白 质，而mRNA是分子生物学的主要研究对象之一。
鉴 定 所 提 取 总 RNA 分 子 的 质 量 ， 可 以 通过琼脂糖电泳后观察是否有明显得 28S、18S条带来判断。
Fig.1 Total RNA isolated from Trichoderma