生物技术综合实验Comprehensiveexperimentsofbiotechnology

一、核酸分离提取的原则
1.分离纯化核酸总的原则 2.①应保证核酸一级结构的完整性； 3.②排除其它分子的污染，保证较高纯度。
2.核酸的分离、纯化应达到以下三点要求： ①排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子
时，应去除RNA分子，反之亦然； ②其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分
子的污染应降低到最低程度； ③核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有
3.DNA沉淀：一般采用2倍体积乙醇沉淀 或用异丙醇（0.6）
4.DNA溶解：一般采用TE
方法一：酚抽提法（见实验指导p20）
DNA பைடு நூலகம்xtraction
从外周血提取基因组DNA的步骤 PROCEDURE OF DNA EXTRACTION FROM BLOOD.doc
三、RNA的分离与纯化 -真核细胞RNA的制备
于样品中的组织细胞。
怎样去除外源性RNase的污染？
(1)操作者的手直接触摸之处，毫无疑问会留下 RNase，说话带出的唾液也富含RNase。故整 个操作过程中，应戴口罩和手套。
(2)空气中飞尘携带的细菌、霉菌等微生物，也 是污染外源RNase的一条途径，所以操作过 程应在比较洁净的环境中进行。
其中DNA酶，需要金属二价离子Mg2+，Ca2+的 激活，使用金属二价离子螯合剂乙二胺四乙酸 (EDTA)、柠檬酸盐，基本上可以抑制DNA酶的活 性。
而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品， 而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生 物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
二、真核细胞染色体DNA的制备
生物技术综合实验
Comprehensive experiments of biotechnology
教学要求
通过教学，要求学生掌握分子生物学与基因工程的 基本理论，巩固所学的理论知识；
使学生了解科研工作的基本思路，学会如何设计实 验，如何分析实验，培养分析问题和解决问题的能 力；
培养和训练学生的基本实验技能，培养学生的独立 工作能力和创造能力。
（2）为了获得大分子量的DNA，一般采用 蛋白酶K和去污剂温和处理法。
2. 去除蛋白质 常用酚、氯仿抽提。反复的抽提操作对DNA
链的机械剪切机会较多，所以有人使用高浓度 甲酰胺解聚核蛋白联合透析的方法，可以获得 200kb以上的DNA片段，适用于粘粒(cosmid)构 建基因组文库。
根据不同的实验要求，可选择不同的实验 方法制备真核细胞染色体DNA。
掌握真核生物基因组DNA的提取的 基本原理。
提取高质量基因组DNA的主要用途： PCR扩增的模板 用于构建基因组文库 用于Southern blot 杂交分析
真核细胞染色体DNA的制备过程
1. 真核细胞的破碎 （1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮
破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可 导致DNA链的断裂。
reesei induced by different inducers 图1. 木霉总RNA的分离 1. 微晶纤维素 2. 天然稻草粉
RNA 分离的关键因素是尽量减少 RNA酶的污染！
如何创造一个无RNase的环境 ？ ➢极力避免外源RNase的污染：主要来源于
操作者的手、实验的器皿和试剂 ➢尽力抑制内源性RNase的活力：主要来源
核酸的种类： ➢ 真核生物的染色体DNA为双链线性分子；真核细胞
器DNA为双链环状分子； ➢ 原核生物的基因组DNA、质粒DNA为双链环状分子； ➢ RNA分子在大多数生物体内均是单链线性分子；不
同类型的RNA分子可具有不同的结构特点，如真核 mRNA分子多数在3’端带有ploy(A)结构;tRNA 的 三叶草结构。 ➢ 病毒的DNA、RNA，其存在形式多种多样，有双链环 状、单链环状、双链线状和单链线状等。
机溶剂和过高浓度的金属离子。
3.为了保征分离核酸的完整性和纯度，在实验 过程中，应注意以下事宜： ①尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少 各种有害因素对核酸的破坏； ②减少化学因素对核酸的降解，为避免过酸、 过碱对核酸链中磷酸二酯键的破坏，操作多在 pH4-10条件下进行；
③减少物理因素对核酸的破坏，物理破坏因素 主要是机械剪切力，其次是高温。 ④防止核酸的生物降解，细胞内或外界的各种 核酸酶（ DNA酶、 RNA酶）酶解核酸链中的磷 酸二酯键，直接破坏核酸的一级结构。
掌握基因重组的基本过程，如：核酸DNA、RNA 和质粒DNA提取、酶切、连接、转化及重组子的 酶切鉴定等技术。
掌握外源基因的表达技术和蛋白质电泳分析技术， 蛋白质提取、分离和纯化技术。
核酸的分离与纯化
Isolation and purification of nucleic acids
不论是基因工程还是蛋白质工程，核酸分 子是这些技术应用所涉及的主要对象，所以核 酸的分离与提取是生化与分子生物学研究中非 常重要的基本技术。核酸样品的质量将直接关 系到实验的成败。
从细胞中分离RNA的纯度与完整性对于许多 分子生物学实验至关重要。如Northern blot及 cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度 上决定于RNA的质量。
RNA主要由以下几类分子组成：rRNA(占RNA 总量的80％—85％)、tRNA和核内小分子 RNA(占10％-15％)、mRNA(占1％～5％)。
rRNA在总RNA分子中含量最丰富 ，由28S、 18S、5S及4S几类组成，它们之间同源性大， 分子量变化不大，所以可根据它们的密度和分 子大小，通过密度梯度离心，凝胶电泳或离子 交换层析进行分离。
mRNA分子种类繁多，分子量大小不均一，在 细胞中含量少，绝大多数mRNA分子(除血红蛋白 及 有 些 组 蛋 白 mRNA 以 外 ) ， 均 在 3’ 端 存 在 20250个多聚腺核苷酸poly(A)。利用此特征，可 很方便地从总RNA中，用寡聚(dT)亲和层析柱分 离mRNA。
mRNA分子群体编码细胞内所有的多肽和蛋白 质，而mRNA是分子生物学的主要研究对象之一。
鉴 定 所 提 取 总 RNA 分 子 的 质 量 ， 可 以 通过琼脂糖电泳后观察是否有明显得 28S、18S条带来判断。
Fig.1 Total RNA isolated from Trichoderma