第六章荧光光谱

但如果处于第一电子激发态最低 振动能级的电子通过无辐射跃迁 （ 系 间 交 连 ， intersystem crossing)改变自旋方向，则因消 耗部分能量而降至另一种激发态 。原来成对电子中的一个自旋方 向被倒转，成为不配对电子，电 子自旋之和不为0 S＝1/2＋1/2＝1 多重性 M＝2S＋1＝21＋1＝3 因此这种电子激发态称为三线(电 子 激 发 ) 态 ， 或 三 重 态 (triplet state)。
上面提到的“环境极性加强，max红移 ”的规律，并不是绝对的。例如，如果在 激发态的寿命之内，分子没有足够的时间 来重新排列并降低激发态的能量，则可能 发 生 max 兰 移 的 情 况 。 这 种 现 象 称 为 “orientation constraint”。这说明在利用max 作为环境极性的探针时要十分谨慎。
在极性溶剂中af 较大，产生红移。
同一种荧光物质在不同极性的环境中 环境(如溶剂)的极性对max的影响 ，其 max 可能会有所差别。一般来说 ，激发态的极性比基态要强，因此被 激发的荧光分子将趋向于与极性溶剂 （或极性环境）相互作用，使溶剂分 子的电子分布会发生变化，偶极子重 新取向，而这又会反过来影响荧光分 子的基态和激发态能级，减少激发态 的能量，引起发射谱的红移。例如， 当溶剂的极性由乙二醇、甲醇、异丙 醇到辛醇依次减小时，ANS（1-氨基8-萘磺酸酯，一种荧光探针，常用于 与蛋白质非共价结合）的荧光谱发生 兰移，量子产率提高。
规律:
ItI 0e
-kt
其中I0 是激发时最大荧光强度，It 是时间t 时的荧光强度，k是衰减常数。假定在时间时测得 的It为I0的1/e，则是我们定义的荧光寿命。
寿命是衰减常数k的倒数。事实上，在瞬间激发后的 某个时间，荧光强度达到最大值，然后荧光强度将按 指数规律下降。从最大荧光强度值后任一强度值下降 到其1/e所需的时间都应等于。
荧光光谱灵敏度高的原因
荧光辐射的波长比激发光波长长，测量到 的荧光频率与入射光的频率不同；
荧光在各个方向上都有发射，因此可以在 与入射光成直角的方向上检测； 这样，荧光不受来自激发光的本底的干扰， 灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，测量用 的样品量很少，且测量方法简便。
荧光光谱第二个特点是信息量较大
呈镜象对称关系。
在发射谱中最大荧光强度的位臵称为max， 它是荧光光谱的一个重要参数，对环境的极 性和荧光团的运动很敏感。
荧光寿命(fluorescence lifetime)
去掉激发光后，分子的荧光强度降到去掉激发光
时荧光强度I0的1/e所需要的时间，称为荧光寿命
，常用表示。如荧光强度的衰减符合指数衰减的
激发谱和吸收谱的关系
既然激发谱是表示某种荧光物质在不同波 长的激发光作用下所测得的同一波长下荧 光强度的变化，而荧光的产生又与吸收有 关，因此激发谱和吸收谱极为相似，呈正 相关关系。
吸收谱与发射谱的关系
由于激发态和基态有相似的振 动能级分布，而且从基态的最
低振动能级跃迁到第一电子激 发态各振动能级的几率与由第 一电子激发态的最低振动能级 跃迁到基态各振动能级的几率 也相近，因此吸收谱与发射谱
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溶剂影响 溶剂影响的结果可以用Lippert方程来描述：
a
f
2 1 n 2 1 ( * ) 2 2 1 2 n 2 1 hc a3
＋常数 其中，a与f分别为荧光分子的吸收波数与发射 波数， af 反映了吸收光与发射光能量的差别 ；为溶剂的介电常数；h为普朗克常数；c为光速 ，a为荧光分子在溶剂中的半径，与 分别为荧 光分子处于基态和激发态时的偶极矩。
由于各种竞争性过程而使荧光量子产率减小 的现象称为淬灭(quenching)，如温度淬灭、 杂质淬灭等。量子产率对于生色团周围的环 境以及各种淬灭过程很敏感。量子产率的改 变必然会引起荧光强度的改变。因此，如果 只需要研究量子产率的相对值，则只要量测 荧光强度也就足够了。
荧光强度
荧光强度F取决于激发态的初始分布IA与量子产率 的 乘积。 这里的F指的是向各个方向上发射的荧光强度的总和， 实际上，谱仪收集的只是其中的一小部分。因此仪器测 到的荧光强度Ｆ IA Z，这里Z是仪器因子。 椐据Beer-Lambert定律可以推得：
荧光光谱能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、峰位、 峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。 荧光光谱还可以检测一些紫外-可见吸收光谱检测不到的时间 过程过程。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁， 荧光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。每个过 程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大约10-15 秒)，但两个过程中有一个时间延搁，大约为10-8秒，这段时 间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之 间的竞争。由于荧光有一定的寿命，因此可以检测一些时间 过程与其寿命相当的过程。例如，生色团及其环境的变化过 程在紫外可见吸收的10-15 秒的过程中基本上是静止不变的， 因此无法用紫外可见吸收光谱检测，但可以用荧光光谱检测。
由上式可见，介电常数增加会使能量差增大，而折射率增加 使能量差减少。由于荧光分子激发态的偶极矩一般要大于 基态偶极矩，荧光分子偶极矩的增大与溶剂分子相互作用 ，使溶剂分子的电子分布和偶极子取向发生变化。溶剂偶极 子的重新取向需要比电子重新分布长得多的时间。介电常数 不仅与偶极子取向有关，也与电子取向有关，上式中第一 项()/(2)是电子和偶极子重新取向的结果；折射率n与 电子重新分布有关，因此上式中第二项是电子重新分布的结 果。 由于非极性溶剂分子没有偶极矩，因此没有在激发态荧光分 子的作用下偶极子重新取向的问题， n2， af很小。而
EMISSlON LlFETlMES
荧光光谱的基本原理
Fluorescence
Fluorescence is emission from a singlet state, where the electron spins in the molecule are paired.
单重态（单线态）与三重态（三线态）
Fλ=2.3I0 (A)C·· l· Z
式中 (A)为激发波长A处的消光系数，Ｃ为样品分 子的浓度，I0为入射光强度，I0为透过样品后的光强度 ，l为光程（样品池光径）
如果激发光强保持不变，且和Z与激发波长无关，则
F (A)
很显然，荧光强度与样品在波度A处的消光系数有关， 而消光系数与激发波长是密切相关的，消光系数随波长 的变化即吸收谱，因此荧光强度也随激发波长的变化而 变化。激发谱与吸收谱呈现正相关关系。 当然，实际上仪器因子Z与波长是有关的，这就使得激 发谱与吸收谱并不完全相似。
对稀溶液来说，荧光强度F与吸收度A成正比: FkI0A 这里k是比例常数，I0是吸收前的光强度， 是荧光量子 产率。 的绝对值是较难用实验的方法测量的，因为必须事先知 道仪器的修正因子。实际测量中大多采用相对法，即用已 知量子产率的标准样品与待测样品进行比较。 若两种溶液测量条件完全相同，则它们的k和I0相同: F1/F2A1 1/(A2 2) 1/ 2F1A2/(F2A1) 已知2就可求出1。
2008年诺贝尔化学奖
某些物质被一定波长的光照射时，会在一定 时间内发射出波长比入射光长的光，如果这个时间 比较短，这种光就称为荧光。荧光由一种能发荧光 的矿物 萤石(fluospar)而得名。
我们这里要介绍的荧光，是指物质在吸收紫 外光和可见光后发出的波长较长的紫外荧光或可见 荧光。 除了紫外光和可见光可能激发荧光外，其它 的光如红外光、X射线也可能激发出荧光，因此除 紫外荧光或可见荧光外，还有红外荧光、X射线荧 光等。
单线基态（A）、单线激发态 （B）和三线激发态（C）
仪器结构
FLUORESCENCE INSTRUMENTATlON
Diagram of a simple fluorescence instrument
Figure 8 Schematic diagram of a single-beam spectrofluorometer. From Perkin-Elmer.
电子自旋的大小用自旋量子数S表示，S可为+1/2或－1/2，这里的正 负号取决于自旋的方向。基态中每个能级通常被两个自旋相反的即自旋 配对的电子占据。配对电子中，一个S＝+1/2，另一个S＝－1/2，所以 自旋总和S＝＋1/2－1/2＝0。 如果不考虑原子核的自旋，则总角动量J＝L＋S，L为总公转角动量， S为总自旋角动量，L、S与J的组合需要符合一定的量子条件，J总共可 以取M个不同的数值，M称为多重性。当L足够大时。可以证明，J可以有 (2S+1)个不同的数值，即 M=2S＋1 当所有的电子都配对时， S＝＋1/2－1/2＋1/2－1/2…＝0, 则 M＝2S＋1＝1 当成对电子中的一个被激发到S1、S2等电子能级激发态时，其自旋不 变，即仍和处于基态的另一电子成对。这些能态都被称为单线态或单重 态(singlet state)。
环境对荧光参数的影响
荧光分析的主要特点是灵敏度高。一般来说，荧光分 析的灵敏度要比吸收光谱测量高2－3个数量级。但正因 为其灵敏度高，因此也容易受到各种因素的干扰。例如 样品的温度度、pH值以及样品中杂质的存在等等。有 时，为了得到可靠的结果，实验设计和操作中需要考虑 和设法减少这些因素的影响；有时，也可巧妙地利用荧 光参数对环境困素的敏感性来达到我们的目的。 下面，我们将分别列举一些环境因素对 max 、 F 和 F 等荧光参数的影响。
Figure 9. Schematic diagram of a ratiometric spectrofluorometcr.
荧光显微镜
主要譜参量
激发谱和发射谱
荧光光谱包括激发谱和发射谱两种。 激发谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得
的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同
波长的激发光的相对效率； 发射谱则是某一固定波长的激发光作用下荧光强度 在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长 的光成分的相对强度。
第六章荧光光谱
Fluorescence
由于绿色荧光蛋白用紫外线一照就 下村修现年80岁的下村修1928 发出鲜艳绿光，研究人员将绿色荧光 年出生于日本京都府，1960年 蛋白基因插入动物、细菌或其他细胞 获得名古屋大学理学博士学位后 的遗传信息之中，让其随着这些需要 赴美，先后在美国普林斯顿大学、 跟踪的细胞复制，可“照亮”不断长 波士顿大学和伍兹霍尔海洋生物 大的癌症肿瘤、跟踪阿尔茨海默氏症 实验所工作。他1962年从一种 对大脑造成的损害、观察有害细菌的 水母中发现了荧光蛋白，被誉为 生长，或是探究老鼠胚胎中的胰腺如 生物发光研究第一人。 何产生分泌胰岛素的β细胞。 马丁· 沙尔菲马丁· 沙尔菲出生于1947年，现年61岁，是美国哥伦比 亚大学生物学教授。他获奖的主要贡献在于向人们展示了绿色荧 光蛋白作为发光的遗传标签的作用，这一技术被广泛运用于生理 学和医学等领域。 瑞典皇家科学院8日宣布，美籍华裔科学家钱永健、美国生物学家 马丁· 沙尔菲和日本有机化学家兼海洋生物学家下村修共同获得 2008年度诺贝尔化学奖，将均分1000万瑞典克朗（约合140万美元） 奖金。帮助他们获奖的是绿色荧光蛋白。这种蛋白为生物与医学实 验带来革命，它发出的荧光像一盏明灯，帮助研究人员照亮生命体 在分子层面和细胞层面的诸多反应。
澳大利亚科学家最新发现 ，一种叫“螳螂虾”的海 里动物通过发出色彩鲜艳 的荧光来恐吓警告敌对者 或者吸引性配偶，
用荧光抗体染色之 原生动物
green-fluorescent protein (GFP)
K. Brejc et.al., PNAS 94 (1997) 2306
1 nm
荧光光谱的特点