江苏水稻黑条矮缩病病毒的RT_PCR分析和快速检测

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水稻品种抗水稻黑条矮缩病鉴定和介体飞虱体内病毒的定量测定

水稻品种抗水稻黑条矮缩病鉴定和介体飞虱体内病毒的定量测定水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)属于呼肠孤病毒科,斐济病毒属,引起的水稻黑条矮缩病是东亚和东南亚地区最严重的水稻病害之一。

近年来该病害尤其在稻麦轮作区的发病率迅速上升,严重威胁水稻、小麦和玉米的安全生产。

灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)和其他2种飞虱白脊飞虱(Unkanodes sapporona Matsumura)白带飞虱(U.albifascia Matsumura)均以持久增殖型方式传播RBSDV。

此外,由白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath)传播的南方黑条矮缩病毒(SRBSDV)于2001年在中国广东省阳江市首次发现,已经传播蔓延到中国南部、越南和日本,成为杂交水稻的主要威胁。

本研究旨在通过筛选的水稻品种对RBSDV的抗病性,并探索不同介体飞虱体内病毒含量的时空动态。

在温室对收集自河南、山东和辽宁等地的66个水稻品种进行了抗RBSDV鉴定。

结果表明,两优3399、大粮207、X008、宁粳4号、圣稻301和两优1129等7个水稻品种表现抗病;沈农1406、D264、博377、中稻1号、春潮88、临香1号、圣稻15号、苏秀9号、苏秀10号、郑稻19、徐稻7号、津优9702、原稻108、苏秀326、原旱稻3号、X007和扬两优6号等16个水稻品种表现为中抗,其他品种表现为中感或高感。

大田抗病性鉴定与温室抗病性鉴定具有明显的正相关性(P=0.0003)。

另外,本研究成功利用实时定量PCR(q RT-PCR)Taq Man探针法检测定量了水稻中RBSDV的拷贝数,抗感水稻品种中RBSDV的拷贝数与其抗病性具有显著的相关性。

利用绝对定量q RT-PCR对整头介体昆虫或其不同器官进行定量检测RBSDV的拷贝数,结果表明,仅在灰飞虱中检测到RBSDV,整头灰飞虱中RBSDV的拷贝数随时间延长增多,说明了RBSDV在介体灰飞虱体内存在明显的复制。

江苏省水稻矮缩病的病原鉴定

江苏省水稻矮缩病的病原鉴定高瑞珍;程兆榜;杨荣明;朱凤;季英华;任春梅;吴丽莉;周益军;范永坚【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2012(027)005【摘要】根据已发布的水稻黑条矮缩病毒(RBSDV)和南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV)S7片段的序列分别设计特异性引物RB-S7-F/R和SRB-S7-F/R,采用RT-PCR、序列测定和同源性比对的方法,对2009年江苏发生的水稻矮缩病的病原进行了鉴定.结果表明,用RB-S7-F/R引物在47份检测样品中有36份可以扩增到一条1200 bp左右的目的片段,而用SRB-S7-F/R引物未能扩增到预期条带.序列测定结果表明,扩增片段与已经发表的RBSDV中国分离物相应片段的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为93.3％～ 100％和97.4％～100％,与SRBSDV相应片段的核苷酸和氨基酸同源性为77.4％～79.5％.系统进化分析得到类似结果.上述研究表明,2009年引起江苏水稻矮缩病症的病原为RBSDV,尚未发现SRBSDV的危害.【总页数】5页(P174-178)【作者】高瑞珍;程兆榜;杨荣明;朱凤;季英华;任春梅;吴丽莉;周益军;范永坚【作者单位】江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014;江苏省植保站,江苏南京210046;江苏省植保站,江苏南京210046;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014;江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京210014【正文语种】中文【中图分类】S435【相关文献】1.江苏省近年来新发生的一种水稻矮缩病害病原初步鉴定 [J], 季英华;任春梅;程兆榜;周彤;周益军2.从“Y两优900”水稻发生南方水稻矮缩病引发的思考 [J], 程大军;谢炜;叶伟清;刘文辉;杨国军;方樟清;3.广西主栽水稻品种抗水稻齿叶矮缩病鉴定 [J], 谢慧婷;崔丽贤;李战彪;秦碧霞;陈锦清;蔡健和4.陕西韩城严重发生的小麦矮缩病病原鉴定与原因分析 [J], 王江飞;柳树宾;吴蓓蕾;谢家建;王锡锋5.水稻瘤矮病病毒和矮缩病病毒的核苷酸结合蛋白和核酸结合蛋白及其结合能力分析 [J], 梁建设;钟伯雄因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

江苏里下河地区水稻黑条矮缩病的发生与防治

症状【３１。２０世纪６０年代在江苏省苏南稻区严重发生，８０年代末以来危害逐年加重。２００４ — ２００６年在江苏省沿海、里下河局部地区零星可见，２００７ — ２００８年发生范
本茎蘖数１３０．５万。每ｈｍ施纯氮３００ｋｇ，基肥：分蘖肥：穗肥＝４：２：４，Ｎ：Ｐ２０５：Ｋ２０＝１：０．５：０．５。
（１）机插。采用软盘育秧，５月２８１３播种，６月１５日移栽，行株距３０．０ｅｍｘｌ２．０ｃｍ，每ｈｍ栽插２７万丛，每丛３～４株苗，基本苗１１２．５万。每ｈｍ施纯氮３００ｋｇ，基肥：分蘖肥：穗肥＝４：３：３，Ｎ：Ｐ０：Ｋ０＝１：０．５：０．８。（２）抛秧稻。５
差异。扬州地区水稻生产应选用淮稻１３号、扬育粳２号、南粳４４和武运粳２９号等发病较轻的品种，采用机插秧、抛秧等轻简稻作方式，化学防治以防治灰飞虱为主，切断毒链，有效控制水稻黑条矮缩病的发生。关键词：水稻黑条矮缩病；品种；稻作方式；病株率；防治
中图分类号：￥４３５．１１１文献标识码：Ｂ文章编号：１００６ — ８０８２（２０１３）Ｏｌ一００７０ — ０４
黑条矮缩病是由灰飞虱传播的水稻病毒病。受害植株田间通常表现为矮缩丛生、叶色深、心叶扭曲等

水稻黑条矮缩病研究进展

地区这种病害的发生超过了９％，成了巨大的经济损０造
失。在浙江、北发生的一种小麦、米矮缩病经试验证河玉
一
十面体，大小７５～８ｍ，０ｎ病毒粒子有衣壳内外２层，双层外壳均含有突起（ｐｋ）ｓｉ。细胞质中病毒粒子以３种形式存在：ｅ
摘要：稻黑条矮缩病已成为近几年来我国水稻上的重要病害之一，水稻黑条矮缩病的研究已成为当前一大水对
热点。本文系统介绍了水稻黑条矮缩病的病原、检测方法、流行原因及防治对策等方面的研究情况，为今后有效控制黑条矮缩病提供了基础。关键词：水稻；黑条矮缩病；研究进展
水稻黑条矮缩病的典型症状是病株矮缩，叶色浓绿僵硬，叶背、鞘和茎秆有早期为蜡白色、期为黑褐色的短条状不叶后规则突起。在水稻不同生育期其发病症状有所不同。
１１秧苗期症状．
２２病原基因组分析．
明也是由水稻黑条矮缩病毒引起的。因此有必要对国内外的研究进展进行介绍与总结，我国水稻黑条矮缩病的综为
合防治提供依据。
１水稻黑条矮缩病的症状
ＲＳＶ基因组由ｌＢＤ０条线性的双链ＲＡ（ｓＮ组成，ＮｄＲＡ）大小为２１２ｎ。１９４ｔ０条基因组片段，按其在凝胶上的迁移率

水稻黑条矮缩病毒的RT—PCR检测

９０年代以来，病又迅速回升流行该呼肠孤病毒科（８。该病毒属１）济病毒属（ｖ衄）有斐ｉ，
接种２，４ｈ连续接种４次，共接４０棵苗。将接种过８
的水稻对号移栽到防虫网室中。对号收集最后成活的４０头灰飞虱，于一３ ℃冰箱内，为Ｒ－Ｅ置ｏ作ＴＰＲ昆虫检测材料。并将检测结果与相应的水稻植株发病情况进行比较。同时取４０头未饲毒的灰飞虱作为
维普资讯
浙江农业学报Ａａａ
：ｋ脚一ｒ１（）１７—１９２０拉－．４２：１．１．０２
水稻黑条矮缩病毒的Ｒ．ＣＴＰＲ检测
吕永平，雷娟利，金登迪，陈声祥（江农科院病实室浙州３）浙省业学毒验江杭１￣１
一
从浙江省仙居县下各镇病区采集水稻病株３棵
作为实验材料，以网室里的健康水稻植株作为对照。１２带毒虫．
般减产１％一４００％，病田甚至颗粒无收 ’ 。重
取１ —２龄无毒灰飞虱若虫，在表现典型症状的
ＤｅｅｔＲＢＳｔｃＤＶｔｗｉｈＲＴ．ｐＣＲ
Ｌ ∞ ｐｒＥｕａｌ，Ｉｅｇｄ，：ＥＵＹｉ，ＬＩａ－ＪＪｉＮＤａ－ｉ（ＮＨ
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哪町，蜀愕Ａａｅｙｃｄｍ
Ｓｉｃ一

水稻黑条矮缩病的发生和病毒检测

Ａｂｔｃ：ＴｅｅｈｄｎｔｙｔｂｅｅｏｄｈｔｒｅｐａｔｄｓａｅｗａａｓｄｂｒｅｂａｋｓｒａｅｗａｉｓｉｂｉｓａｔｈｒａｏｅｅｎｒｐｓｅｔａｉｌｎｉｅｓｓｃｕｅｙｉｌｃｔｋｄｄｒｖｒｎＨｕｅ．ｃｃｅｆｕ
水稻黑条矮缩病毒（ｉｌｋｓｅｋｄｄａＲｃｂａｔａｅｗｒｅｃｒｆｖｒｓＲＳＶ）呼肠孤病毒科（ｅｖｉａ）的斐ｉ，ＢＤ是ｕＲｏｉｄｅ中ｒ
济病毒属（ｈｔｒｉｓ成员 …，由灰飞虱、Ｐｙｏｅｒ）ｖｕ可白背飞
ｔｓｆＪｎｚｏｃｔ．Ｂｙｔｍｓｏｓｒｅｉｏｉｇｈｕｉｅｙｙｓｍｐｏｂｅｖｄ，１％Ｓ－ＡＧＥｎＲＰＲｅｅｔｎｔｅｐｔｏｅｆｒｅｗａｉｅｓ０ＤＳＰａｄＴ－Ｃｄｔｃｉ，ｈａｈｇｎｏｃｄｒｄｓａｅｏｉｆ
ＯｃｕａｃａｄｃｒｎｅｎＶｉｕｓＭｏｅｕａｔｃｉｎｆＲｉｅＢｌｃＳｔｅｋｅＤｗａｆＤｉｅｓｒｌｃｌｒＤｅｅｔｏｏｃａｋｒａｄｒｓａｅ
ＺＡＮＧＳｎ — ａ．ＩＤ — ｏｇ，ＩＯｏｇｌｉＺＡＮＣａｇｑｎ￣ＷＵＺ－ｉｎ。ＥＬａ — ｕＨｏｇｂｉＬａｙｎ３ＡＤｎ —ａｚＨＧｈｎ — ｉｇ，Ａｇｉｌｒ，ａｇｅＵｉｒｉ，Ｊｎｚｏ３０５，Ｈｕｅ，ｈｎ；－ＫｙＬｂｒｔｒｏｅｔｉｅａｄＢｏｈｍｓ１ｏｅｅｏｒｕｔｅＹｎｔｎｖｓｙｉｇｈｕ４４２ｌｃｕｚｅｔｂｉＣｉａ２ｅａｏａｙｆＰｓｉｄｎｉｃｅｉｒｏｃｔｙ

利用RT-PCR快速检测水稻条纹叶枯病病毒

ＲＳＶｎｉｆｃｅｉｅａｄｏｔｅｏｔｐａｓｉｎｅｔｄｒｃｎｈｒｈｓｌｎｔ．
Ｋｅｒ：ｒｃｔｉｅｄｓａｅ；ＲＴ— ｙｗｏｄｓｉｅｓｒｐｉｅｓＰＣＲ；ｖｒｓｄｔｃｉｉｕｅｅｔｏｎ
ａｅｌｓ，ｉｅａｄｈｓｌｎｓｏｒａｏｔｎｅｆｒｔｅｄｓａｅｆｒｃｓｉｇｏｒｐｉｆｐｉｒｔｌ）ｒｎｏｔｐａｔｉｆｇｅｔｉｒａｃｏｈｉｓｏｅａｔｎ．Ｆｕａｒｏｒｍｅｓｕｃｍｐｅｓ
植株中分别扩增出水稻条纹叶枯病病毒基因组特有的４个条带，通过测序和Ｇｎａｋｂｓ证实。利用该方法并ｅｂｎｌｔａ
可以对水稻和其它寄主进行条纹叶枯病病毒早期检测。
关键词：稻条纹叶枯病；ＴＰＲ；毒检测水Ｒ —Ｃ病中图分类号：３．１Ｓ４１１文献标识码：Ａ文章编号：６２—７５２０）１００５１７５Ｘ（０８０ —０４ —０
ｔ０ｐｗｅｅｏｔｉｅｎｉｅｔｄｒｃｌｎｔ，ｅｐｃｉｅｙ．Ｔｈｅａａｅｓｇｅｔｗａｅｔｄｔｏ３０ｂｒｂａｎｄｉｎｆｃｅｉｅｐａｓｒｓｅｔｖｌｅｓｐｒｔｅｍｎｓｌｇａｅｏｐＥＭ — ｅｓｅｔｒｈｅｅｕｎｅｏｃｎｏｒ．ＴｈｉｐｏｃａｅｕｅｏｒｅｒｙｄｔｃｉｎｏＧＴ— ａｙｖｃｏ．ｔｎｓｑｅｃｄｔｏｆｍｓａｐｒａｈｃｎｂｓｄｆａｌｅｅｔｏｆ

江苏水稻黑条矮缩病毒S10的cDNA克隆序列分析

ｅｋｄｄｒｉｖｒｓｃｙｗｒｓｃｂａｋｓｒａｅｗａｆＦｊｉｕ；ＤＮＡｃｏｅＳ０；ｅｕｎｅａａｙｉｅｉｌｎ；ｌＳｑｅｃｎｌｓｓ
摘要：从来自江苏连云港并在本实验室保存的水稻黑条矮缩病毒接种的病株玉米中提取ｄＲＡ．用改进的单引ｓＮ采物扩增技术获得丁病毒基因组片段￥０的ｃＮ１ＤＡ克隆井测定了其垒序列。结果表明￥０全长ｌ８ｌｐ含有一个１０ｂ．ＯＦ组织结构与日本报道的ＲＳＲ．ＢＤＶ基本一致，核苷酸和推导的氮基酸序列与ＭＲＤＶ的相似性分别为８％和７５
（苏省农业科学院植物保护研究所，苏ＮＶ１１）江江，２￣４
ｃＤＮＡｏｅａｅｕｎｅＡｎｌｓｓｏｆＳｇｅｔ１ｆＲｉｅＣｌｎｎｄＳｑｅｃａｙｉｅｍｎ０ｏｃ
Ｂｌｃ．ｔｅｋｄＤｗａｆＦｊｖｒｓｉｉｎｓａｋＳｒａｅｒｉｉｕｎＪａｇｕｉ
ｗａｅＯｉｏｕａｅｓｕｓｄｔｎｃｌｔｄｍａｉｅｔｒａａｅｔｉｕＩｐｏｅｉｌｉｅｍｐｉｉａｉｎｔｃｎｑｅｚＯｐｏｐｇｔｈｅｖｒｓｍｒｖｄｓｎｇｅｐｒｍｒａｌｆｔｏｅｈｉｕｃｗａｄｐｅＯｃｏｎｈｉａｅｏｉｓｓａｏｔｄｔｌｅｔｅｖｒ１ｇｎｍｃｄＲＮＡＯｆｒｓｑｅｃｅｅｍｉａｉｎＳＩｏｅｕｎｅｄｔｒｎｔｏＴｈｅｕｔｓｗｅｔｅｅｒｓｌｈｏｄ：ｈｆｌｌｎｈｏ０ｓ１０１ｐａｄａｈｅａｒｎｚｔｏｉｈｕｌｅｇｔｆＳ１ｉ８ｂｎｈｓｔｓｍｅｏｇａｉａｉｎｗｔＭＲＤＶｎＩａｙａｄｉｔｌｎＲＢＳＤＶｉｎ

普通水稻黑条矮缩病毒的RT-PCR检测方法[发明专利]

专利名称：普通水稻黑条矮缩病毒的RT-PCR检测方法专利类型：发明专利
发明人：高必达
申请号：CN200910254294.X
申请日：20091209
公开号：CN101713000A
公开日：
20100526
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种普通水稻黑条矮缩病毒(rice black streaked dwarfvirus，RBSDV)的RT-PCR检测方法，所使用的一对引物是RBSDV第一段RNA特异的，是利用病毒核苷酸序列进化的保守性，从NCBI 搜索并下载RBSDV第一段RNA及相近病毒第一段RNA的核苷酸序列，运用MEGA4.0软件对这些序列进行比对，从mas文件中找出不同研究者报告的RBSDV核苷酸序列所共有而其它病毒序列均与之不同的引物候选区。

经BLAST结果表明，与引物1和引物2能100％覆盖且100％相同序列的全部是RBSDV 核苷酸序列。

用这对引物对RBSDV与SRBSDV病毒作RT-PCR，能将RBSDV与SRBSDV两种病毒准确的区分开来。

申请人：湖南农业大学
地址：410128 湖南省长沙市芙蓉区农大路1号
国籍：CN
代理机构：长沙正奇专利事务所有限责任公司
代理人：何为
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水稻瘤矮病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其检测方法[发明专利]

专利名称：水稻瘤矮病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其检测方法
专利类型：发明专利
发明人：沈建国,高芳銮,蔡伟,闫诚
申请号：CN201210194281.X
申请日：20120613
公开号：CN102676702A
公开日：
20120919
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明涉及一种水稻瘤矮病毒荧光定量RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，专用于水稻瘤矮病毒的检测。

该试剂盒包括：反转录酶、RNA酶抑制剂、5×RT Buffer、dNTPs、2×Buffer、正向引物、反向引物、荧光探针、水稻瘤矮病毒的阳性对照样品、不含水稻瘤矮病毒的阴性对照样品和RNase-free ddHO。

利用该试剂盒检测水稻瘤矮病毒，具有操作简便、灵敏度高、特异性强和准确度好的显著优点，可有效应用于口岸检疫及农业生产上水稻瘤矮病毒的快速检测，应用前景十分广泛。

申请人：福建出入境检验检疫局检验检疫技术中心
地址：350001 福建省福州市湖东路312号国检广场
国籍：CN
代理机构：福州智理专利代理有限公司
代理人：丁秀丽
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应用RT2PCR,斑点杂交法和SDS2PAGE检测水稻黑条矮缩病毒

应用RT 2PCR 、斑点杂交法和SDS 2PAGE检测水稻黑条矮缩病毒王朝辉1　周益军23　范永坚2　薛宝娣1　吴淑华2　程兆榜2　张文荟2(1南京农业大学植保学院,南京210095;2江苏省农业科学院植物保护研究所,南京210014)摘要:用RT 2PCR 技术、PCR 标记的探针点杂交和S DS 2PAGE 检测了生产上严重危害玉米和水稻的水稻黑条矮缩病毒(R BS DV )。

由RT 2PCR 扩增的R BS DV 第7片段第921～1411碱基作探针,用PCR 法DIG 标记后点杂交,可以从100ng 玉米病叶中检测到R BS DV ,灵敏度是RT 2PCR 的1/10;10%S DS 2PAGE 只能检测到从1g 玉米病叶中提取的病毒dsRNA ,但对江苏玉米田间分离的不同的R BS DV 样品电泳发现,该病毒基因组dsRNA 有差异,表明该技术是研究R BS DV 基因组多样性的简单有效的方法。

关键词:水稻黑条矮缩病毒;检测;RT 2PCR ;斑点杂交;S DS 2PAGE中图分类号:S4351111149 文献标识码:A 文章编号:1000Ο2030(2001)04Ο0024Ο05Detection of rice black 2streaked dw arf Fijivirus by RT 2PCR,dot 2blot hybridization and SDS 2PAGEWang Zhaohui 1,Zhou Y ijun 23,Fan Y ongjian 2,Xue Baodi 1,Wu Shuhua 2,Cheng Zhaobang 2and Zhang Wenhui 2(1C ollege of Plant Protection ,Nanjing Agric Univ ,Nanjing 210095,China ;2Institute of Plant Protection ,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences ,Nanjing 210014,China )Abstract :The purpose of this study was evaluation of RT 2PCR technique ,dot 2blot hybridization with PCR 2generated probe and S DS 2PAGE for the detection of rice black 2streaked dwarf Fijivirus (R BS DV ).The cDNA probe labeled with dig oxigenin by PCR ,complementary to the region between 921and 1411nucleotides of segment 7of R BS DV from Jiangsu ,was used.In dot 2blot hybridization the probe could detect the viral RNA from 100ng diseased maize leaves ,which is ten times less sensitive than RT 2PCR.10%S DS 2PAGE only could de 2tect the viral dsRNA extracted from 1g diseased maize leaves ,but this technique was found to be simple and effective to study the genomic diversity of R BS DV is olated in fields.K ey w ords :Rice black 2streaked dwarf Fijivirus (R BS DV );detection ;RT 2PCR ;dot 2blot hybridization ;S DS 2PAGE水稻黑条矮缩病毒(Rice black 2streaked dwarf Fijivirus ,RBS DV )属于呼肠孤病毒科(Reoviridae )斐济病毒属(Fijivirus ),基因组由10条双链RNA (dsRNA )组成,主要经灰飞虱(L aodelphax striatellus Fall n )以持久性方式传播[1]。

一种快速同步检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法

一种快速同步检测水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒的方法季英华;高瑞珍;张野;程兆榜;周彤;范永坚;周益军【期刊名称】《中国水稻科学》【年(卷),期】2011(025)001【摘要】水稻黑条矮缩病毒和南方水稻黑条矮缩病毒是近年来在水稻上危害日益严重的两种病毒,由于两者同属于呼肠孤病毒科斐济病毒属,在症状、粒体形状、传播介体及寄主等方面非常相似,由此也给诊断及鉴定造成了困难.针对这一问题,通过设计简并引物,并优化体系,建立了一种快速、简便、灵敏、特异的方法,为这两种病毒的检测及鉴别提供了方便.%Rice black-streaked dwarf virus and southern rice black-streaked dwarf virus are two important viruses in rice, which cause great losses in local rice production in recent years. The two viruses belong to Fijivirus. They share many similar characters, such as symptoms, virus particles, vectors, host range etc. , causing difficulty in discrimination of the two viruses.Three degenerate primers were designed and a simple, rapid, efficient method was described.【总页数】4页(P91-94)【作者】季英华;高瑞珍;张野;程兆榜;周彤;范永坚;周益军【作者单位】江苏省农业科学院,植物保护研究所,江苏,南京,210014;江苏省农业科学院,植物保护研究所,江苏,南京,210014;扬州大学,园艺与植物保护学院,江苏,扬州,225009;江苏省农业科学院,植物保护研究所,江苏,南京,210014;江苏省农业科学院,植物保护研究所,江苏,南京,210014;江苏省农业科学院,植物保护研究所,江苏,南京,210014;江苏省农业科学院,植物保护研究所,江苏,南京,210014;江苏省农业科学院,植物保护研究所,江苏,南京,210014【正文语种】中文【中图分类】Q93-331;S435.111.4+9【相关文献】1.双重RT-PCR法同时快速检测南方水稻黑条矮缩病毒和水稻黑条矮缩病毒 [J], 孙晓棠;崔汝强;贺浩华;欧阳林娟;胡丽芳;彭小松;陈小荣;朱昌兰2.从单头灰飞虱中检测水稻黑条矮缩病毒简单快速的方法 [J], 王朝辉;周益军;范永坚;程兆榜;张文荟3.水稻黑条矮缩病毒RT-LAMP快速检测方法的建立 [J], 周彤;杜琳琳;范永坚;周益军4.一种快速同步检测小麦黄花叶病毒和中国小麦花叶病毒的方法 [J], 缪倩;季英华;任春梅;魏利辉;周益军;程兆榜5.南方水稻黑条矮缩病毒快速检测 [J], 周倩;朱俊子;梁晋刚;陈欣怡;高必达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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收稿日期:2008-07-21基金项目:国家科技支撑计划重大项目(2006BAD O2A03);江苏省自然科学基金项目(BK2006159);江苏省农业科技自主创新基金项目(CX[07]603);江苏省农业科学院基金项目(6110703;6510806)作者简介:杨杰(1969-),男,四川南部人,博士,副研究员,主要从事水稻遗传育种研究。

通讯作者:仲维功(1954-),男,江苏兴化人,研究员,主要从事水稻遗传育种研究。

江苏水稻黑条矮缩病病毒的RT -PCR分析和快速检测杨杰1,王军1,周彤2,陈志德1,仲维功1(1.江苏省农业科学院粮食作物研究所,江苏南京 210014;2.江苏省农业科学院植物保护研究所,江苏南京 210014)摘要:为了明确江苏新发生的矮缩病害为水稻黑条矮缩病,采用RT -PCR 和序列测定方法对其病原进行了精确鉴定。

根据水稻黑条矮缩病病毒基因组序列的信息,设计扩增RNA 聚合酶基因、外壳蛋白基因和RNA 沉默抑制子基因以及核心蛋白基因部分编码区的4对引物,提取感染水稻黑条矮缩病病毒的水稻植株总RNA 并进行RT -PCR 扩增,可以在感病植株中分别扩增出水稻黑条矮缩病病毒基因组特有的4个条带,测序结果表明,来源于江苏南京的分离物的4个基因部分编码片段与已登录的对应基因片段核苷酸序列同源性达99%以上,共发现7个碱基的突变。

经生物信息学分析发现7个单碱基突变都是同义突变,氨基酸序列没有改变。

根据以上结果确认该病病原为水稻黑条矮缩病病毒。

利用该方法可以对水稻和其他寄主进行早期病毒检测。

关键词:水稻黑条矮缩病;RT -PCR;病毒检测中图分类号:S432.4+1 文献标识码:A 文章编号:1000-7091(2008)06-0087-06Detecting and Analysis of Rice Black Stripe Dwarf Virus(RBSDV)onRice in Jiangsu Province with RT -PCRYANG Jie 1,WANG Jun 1,Z HO U Tong 2,CHEN Zh-i de 1,Z HONG We-i gong 1(1.Institute of Food Crops,Jiangsu Academy of Agriculture Sciences,Nanjing 210014,China;2.Institute of Plant Protection,Jiangsu Academy of Agriculture Sciences,Nanjing 210014,China)Abstract:To determine the pathogen of rice dwarf disease which has caused yield loss in Jiangsu Province in recent years was caused by rice black stripe dwarf virus(RBSDV).Four pairs of primers to a mplify RNA dependent RNA poly -merase and the coat protein and core protein and silencing suppressor of RBSDV were designed.Four bands with about 200bp to 300bp were obtained in infected rice plants by RT -PCR,respectively.The separate segment was ligated to pGE M -T -easy vector,then sequenced with M13primers.Their identities to rice black -streaked dwarf virus were higher than 99%and seven synonymous substitution were found.The results showed that the virus which causes rice dwarf dis -ease in Jiangsu is RB SDV.The identification of RBSDV in the small bro wn planthopper(Laodelphax striatellus ),rice and other host plants is of great importance for the disease forecasting.This approach can be used for early detection of RBS -DV in infected rice and other host plants.Key words:Rice black stripe dwarf virus disease;RT -PCR;Virus detection 水稻黑条矮缩病毒(Rice black -streaked dwaf virus,RBSDV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)斐济病毒属(Fijivirus)[1],全基因组测序工作已经完成,总长29141bp,由10条dsRNA 组成,按分子量大小命名为S1-S10;RNA 依赖的RNA 聚合酶、外壳蛋白、沉默抑制子等重要基因的功能已经基本明确[2-10]。

水稻黑条矮缩病毒病是一种以灰飞虱为主要介体进行传播的病毒病,主要侵染禾谷类作物和禾本科杂草。

水稻黑条矮缩病毒病的病株症状为浓绿矮缩,叶片僵直,不抽穗或穗小,叶背的叶脉和茎杆上有短条瘤状突起,该突起在发病初期呈腊白色,后变为黑华北农学报#2008,23(6):87-92褐色。

发病田块一般减产10%~40%,重病田甚至颗粒无收[11-14]。

水稻黑条矮缩病毒病曾于20世纪60年代中期在我国华东诸省市不少地区广泛发生。

近年来,随着灰飞虱的大爆发,该病又迅速回升流行[15]。

由于江淮流域近几年灰飞虱虫量基数大,而且田间杂草和禾本科作物是RBSDV的寄主[16-21],通过灰飞虱的食毒和传毒,该病有可能在江淮流域大发生,对水稻生产构成新的威胁。

该病毒只能由特定的昆虫(以灰飞虱为主)带毒传播,在该病毒的科学研究和生产预测预报中,测定介体昆虫灰飞虱带毒率和水稻植株被感染率显得十分必要。

已有研究表明,RBSDV必须由灰飞虱在带毒的寄主植物食毒后才能带毒和传播病毒[11]。

因此,鉴定寄主植物的带毒情况对于水稻黑条矮缩病的预测预报及其防治提供非常有价值的借鉴。

反转录PC R(RT-PCR)技术已经是成熟的技术,这一技术与免疫法相比,具有快速、灵敏和特异性强的优点,而且不需要制备抗血清,适于普及应用[22,23]。

本研究利用RT-PCR技术方法对采自江苏省病区的水稻黑条矮缩病病株进行了病毒检测,并经测序证明,为建立水稻植株和越冬寄主植物水稻黑条矮缩病病毒率的检测体系奠定了基础。

1材料和方法1.1植物材料采集江苏省农业科学院试验田2007年田间自然发病株叶片,液氮迅速冷冻,-80e保存。

1.2菌株及载体大肠杆菌DH5A由江苏省优质水稻工程中心保存,pGEM-T easy、Trizol、酶等购买自Tiangen公司。

1.3总RNA提取和cDNA合成所用的玻璃、瓷器、铁器均采用干热(180e)灭菌4h以上;配试剂等均用011%DEPC处理水。

试验步骤如下:取50~100mg病株组织加入液氮充分研磨,待样品冻融之前加1mL Trizol,样品体积不能超过Trizol的10%,继续研磨直至完全溶解,吸入离心管,12000r/min离心10min(4e),取上清,15~ 30e5min;加012mL氯仿异戊醇(氯仿B异戊醇= 20B1)溶液,用力摇15s,15~30e静置2~3min,4e 10000r/min离心15min,上层液相约为总体积的60%;取上清,加015m L异丙醇,混匀,15~30e静置10min,4e12000r/min10min;去上清,加75%乙醇l mL(011%DEPC水配制),振荡,4e7500 r/min5min;去乙醇,空气干燥,用011%DEPC处理的水溶解,于-70e冷冻保存。

逆转录反应体系(25L L):先将总RNA1L L(2 L g),Oligo dT(15)引物2.5L L和纯水混合,70e变性5min后,迅速冰上冷却;然后再依次添加其他成分。

包括5@Buffer2.5L L,dNTP(10mmol/L)2.5L L, RNasin015L L,逆转录酶(AMV)1L L,纯水12.5L L。

42e,1h;95e加热5min终止反应。

1.4RBSDV特异引物设计根据已测序的RB SDV的基因组序列设计引物。

分别设计合成RBSDV的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase,RdRP)、核心蛋白(Core protein)、沉默抑制基因(Putative silencing sup-pressor)、外壳蛋白(C oat protein)编码基因的4对引物。

用于本研究RT-PCR的黑条矮缩病病毒的4个片段所在基因组位置及片段大小见表1(详情请登陆:/dsRNA virus-pro-teins/Fijivirus.htm)。

S1-For:5c-GGTGGAACGAAAGTTC AGTAGATC-3cS1-Rev:5c-AATTTGGAC TACAC TTGGACGAA-3cS2-For:5c-AGAGCGAC AAGAAGAATCGAAA-3cS2-Rev:5c-C AAAAGTAGTTGTGTAAGCGGG-3cS6-For:5c-CTC GAATCATCC GTCAC TTCTGAGT-3cS6-Rev:5c-GGAC AAAACC TTTCC AATTATCGAG-3cS10-For:5c-GGAAACATTAC TTTGAAGCCC-3cS10-Rev:5c-CCACC ATAATGTGTAAC ATCCGTA-3c表1RdRp(S1)、核心蛋白(S2)、沉默抑制子基因(S6)和外壳蛋白(S10)基因所在基因组信息Tab.1Genome data of RdRp(S1),Core protein(S2),Silencing suppressor(S6),C oat protein(S10)o f RBSDV基因组/bp Genome segment 开放阅读框/bpORFs蛋白分子量/kDaProtei n sizeaaGenBank登录号Accessionnu mbers功能特征Functions andpropertiesRT-PCR扩增位置RT-PCRlocus参考文献Refe-renceS1(4501)36~44271464(168.8)AJ294757RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)38~252[3] S2(3812)46~37231226(141.5)AJ409145功能未知117~415[3] S6(2645)82~2457792(8919)AJ409148沉默抑制子202~478[7,8] S10(1801)22~1695558(63.3)AF459813外壳蛋白Coat protein472~728[4,9]引物合成由Invitrogen公司完成。