实验五 双水相萃取及分配系数的测定
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标准曲线制作：(25℃,10min后测定)
试管编号
012345
120ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
水 （ml）
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
考马斯亮蓝试剂 （ml） 2.5 2.5wk.baidu.com2.5 2.5 2.5 2.5
A595nm
(四)、求分配系数：（蛋白质在上、 下两相中的浓度之比）
三）、蛋白质含量测定：（根据成相情况，每组人员 可选测其中1管）
本实验采用的蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法， 先用标准牛血清蛋白制作标准曲线，然后用分光光度 计分别检测双水相体系中上相和下相在595nm处的吸 光度（方法同标准牛血清蛋白的测定），对照标准曲 线即可得到体系中上相和下相中的蛋白质含量（若测 得吸光度值过高可稀释后再测）。
质量浓度15%
1 PEG1000
原液 1.0290g(1.00ml) 2.0740g(2.00ml) 3.1112g(3.00ml)
2
H2O 4.7304g(4.73ml) 1.4608g(1.46ml) 0.4272g(0.43ml)
43% 硫
（NH4）2SO4 质量浓度10%
（NH4）2SO4 质量浓度20%
实验五 双水相萃取及分配系 数的测定
(Aqueous Two Phase Extraction)
双水相萃取概述
双水相萃取(aqueous two-phase partitioning) 是1896 年Beijerinck 把琼脂和可溶性淀粉或明胶相混合时最早发 现的。1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新发现此体 系并第一次用来提取生物物质。1979年，Kula和Kroner等 人将双水相体系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使 胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于双水相体系的研 究和应用逐步展开并取得很大进展。在提纯有生理活性的 生物物质方面，与其他提取方法相比，它具有许多优势。 现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、 细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化 生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方 面的巨大应用前景。
1.037g/mL。 ⑵ 配制43% 硫酸铵原液（m/V）：（各组共用） 称取430.00g 硫酸铵加水溶解，定容至1000ml，密度为
1.200g/mL。 ⑶ 按质量百分比配制3管（各8g,要求完全溶解，混合均匀）。
添加
顺序 管号
1
2
3
PEG
PEG
PEG
40%
质量浓度5%
质量浓度10%
各种类型的双水相体系
类型
形成上相的聚合物 形成下相的聚合物
聚乙二醇 非离子型聚合物/ 非离子型聚合物
聚丙二醇
葡聚糖 聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
高分子电解质/非离子型聚合物
羧甲基纤维素钠
聚乙二醇
高分子电解质/高分子电解质
葡聚糖硫酸钠
羧甲基纤维素钠
聚合物/ 低分子量化合物 聚合物/ 无机盐
葡聚糖 聚乙二醇
（NH4）2SO4 质量浓度20%
3 酸铵原
液 2.2326g(1.87ml) 4.4652(3.72ml) 4.4652(3.72ml)
（二）、分配平衡及相比测定：
在上述各管中加入500mg/L牛血清蛋白2..00ml，用 旋涡混合器对各管进行充分混合（约2分钟），静置，观 察成相情况，记录上相体积和下相体积，求相比。 小提示：为了加快分层，可在3000r/min下离心3～5 分钟 (可用10ml刻度离心管)，观察成相情况，记录上相体积和 下相体积，求相比。
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
两相区 系线
双节线 均相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体 积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两 相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中 的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
双水相萃取概述
现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内 产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能 对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们 在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃 取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶 束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因 此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、 经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取 技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、 极有前途的新型分离技术。
双水相萃取的基本特点
(2) 与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够在较少的溶 液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品。另外，操 作能够容易、精确地按比例放大，非常适合大规模应用， 可进行连续生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受 到限制。
(3) 聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、pH 以及温度等均能影响被分配物质在两相间的分配，所以操 作容易进行控制，进而达到目的产物的最佳萃取条件。
丙醇 磷酸钾 硫酸铵
双水相萃取的基本特点
(1) 体 系 有 生 物 亲 和 性 。 两 相 中 的 水 分 含 量 通 常 高 达 65%～90% ，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫 酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚 至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机有机两相体系的界面张力要小1～3 个数量级。由于生物 活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质 亲水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术 难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。
1、实验原理
双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶 的盐溶液和高分子溶液组成。常见的双水相系统可分 为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。
双水相萃取法分离提纯蛋白质是利用蛋白质在两
种物质所形成的双水相中的分配系数的不同而进行分
离的。
双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛，最常采用 的双水相体系是PEG/Dex或PEG/低分子盐系统，其中 低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。
(4) 可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加入PEG和无机 盐后再通入珠磨机进行破碎，然后用离心机分相。既节省 了萃取设备和时间，又避免了胞内酶的损失。
双水相萃取的基本特点
(5) 能进行萃取性的生物转化。在一些双水相体系中可将 发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合， 即生物反应在其中一相中进行，同时生成的反应产物被连 续萃取到另一相中。不仅解决了产物反馈抑制作用造成的 产量低的问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳 定，活性更大。因为生物反应和生物产物的提取同时进行， 尤其适于连续生产。
本实验采用PEG/硫酸铵双水相体系研究牛血清 蛋白的分配。
蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法，利 用考马斯亮蓝进行染色，然后检测吸光度，对 照标准曲线即可得到蛋白质含量。
2、实验目的
（1）了解双水相系统成相的原理及分配系数 的测定方法。
（2）探究双水相的形成条件，掌握双水相萃 取法分离技术。
溶于小量蒸馏水中，然后稀释并定容至500ml，配成120 ug/ml蛋白溶液。 3、器具： 离心机、10ml刻度离心管、移液管或可调式移液器、漩涡振荡器、小滴管、
试管、分析天平、恒温水浴锅、容量瓶、分光光度计
三、实验过程
（一）考察组分浓度对形成双水相体系的影响： ⑴ 配制40% PEG1000原液（m/V）：（各组共用） 称取400.00g PEG1000加水溶解，定容至1000ml，密度为
二、试剂及器具
1、材料： 牛血清蛋白 500mg/L 2、试剂： PEG1000，（NH4）2SO4，考马斯亮蓝G—250，牛血清蛋白 ⑴ 考马斯亮蓝溶液配制：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，
加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释并定容至1000ml。 ⑵ 牛血清蛋白溶液配制：精确称取0.060g牛血清蛋白，加入0.526gNaCl，
双水相萃取概述
双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同 一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性， 当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的 两相。
因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都 占很大比例(85％~95％)，活性蛋白或细胞在这种环境中 不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机 溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂 的缺点。
双水相萃取的基本特点
(6) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和萃取专 一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近，造 成其萃取专一性不高。亲和萃取就是将一种和目标蛋白质 有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合，该成相 聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时， 目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所 在相中，其它杂蛋白则进入另一相。此技术已用于乙醇脱 氢酶、丙酮酸激酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、 膜等粒子的提取。
K=C1/C2
思考题：
1、常用双水相体系有哪些？双水相体系形成 的原因是什么？
2、影响双水相成相的因素有哪些？
双水相萃取分配系数K=Ct/Cb为上相和下相的浓度比。
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的 各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生 物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:
lnm=lnme+lnmh+lnml
me，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物
亲和作用对溶质分配系数的贡献。
试管编号
012345
120ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
水 （ml）
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
考马斯亮蓝试剂 （ml） 2.5 2.5wk.baidu.com2.5 2.5 2.5 2.5
A595nm
(四)、求分配系数：（蛋白质在上、 下两相中的浓度之比）
三）、蛋白质含量测定：（根据成相情况，每组人员 可选测其中1管）
本实验采用的蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法， 先用标准牛血清蛋白制作标准曲线，然后用分光光度 计分别检测双水相体系中上相和下相在595nm处的吸 光度（方法同标准牛血清蛋白的测定），对照标准曲 线即可得到体系中上相和下相中的蛋白质含量（若测 得吸光度值过高可稀释后再测）。
质量浓度15%
1 PEG1000
原液 1.0290g(1.00ml) 2.0740g(2.00ml) 3.1112g(3.00ml)
2
H2O 4.7304g(4.73ml) 1.4608g(1.46ml) 0.4272g(0.43ml)
43% 硫
（NH4）2SO4 质量浓度10%
（NH4）2SO4 质量浓度20%
实验五 双水相萃取及分配系 数的测定
(Aqueous Two Phase Extraction)
双水相萃取概述
双水相萃取(aqueous two-phase partitioning) 是1896 年Beijerinck 把琼脂和可溶性淀粉或明胶相混合时最早发 现的。1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新发现此体 系并第一次用来提取生物物质。1979年，Kula和Kroner等 人将双水相体系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使 胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于双水相体系的研 究和应用逐步展开并取得很大进展。在提纯有生理活性的 生物物质方面，与其他提取方法相比，它具有许多优势。 现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、 细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化 生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方 面的巨大应用前景。
1.037g/mL。 ⑵ 配制43% 硫酸铵原液（m/V）：（各组共用） 称取430.00g 硫酸铵加水溶解，定容至1000ml，密度为
1.200g/mL。 ⑶ 按质量百分比配制3管（各8g,要求完全溶解，混合均匀）。
添加
顺序 管号
1
2
3
PEG
PEG
PEG
40%
质量浓度5%
质量浓度10%
各种类型的双水相体系
类型
形成上相的聚合物 形成下相的聚合物
聚乙二醇 非离子型聚合物/ 非离子型聚合物
聚丙二醇
葡聚糖 聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
高分子电解质/非离子型聚合物
羧甲基纤维素钠
聚乙二醇
高分子电解质/高分子电解质
葡聚糖硫酸钠
羧甲基纤维素钠
聚合物/ 低分子量化合物 聚合物/ 无机盐
葡聚糖 聚乙二醇
（NH4）2SO4 质量浓度20%
3 酸铵原
液 2.2326g(1.87ml) 4.4652(3.72ml) 4.4652(3.72ml)
（二）、分配平衡及相比测定：
在上述各管中加入500mg/L牛血清蛋白2..00ml，用 旋涡混合器对各管进行充分混合（约2分钟），静置，观 察成相情况，记录上相体积和下相体积，求相比。 小提示：为了加快分层，可在3000r/min下离心3～5 分钟 (可用10ml刻度离心管)，观察成相情况，记录上相体积和 下相体积，求相比。
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
两相区 系线
双节线 均相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体 积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两 相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中 的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
双水相萃取概述
现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内 产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能 对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们 在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃 取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶 束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因 此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、 经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取 技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、 极有前途的新型分离技术。
双水相萃取的基本特点
(2) 与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够在较少的溶 液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品。另外，操 作能够容易、精确地按比例放大，非常适合大规模应用， 可进行连续生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受 到限制。
(3) 聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、pH 以及温度等均能影响被分配物质在两相间的分配，所以操 作容易进行控制，进而达到目的产物的最佳萃取条件。
丙醇 磷酸钾 硫酸铵
双水相萃取的基本特点
(1) 体 系 有 生 物 亲 和 性 。 两 相 中 的 水 分 含 量 通 常 高 达 65%～90% ，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫 酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚 至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机有机两相体系的界面张力要小1～3 个数量级。由于生物 活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质 亲水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术 难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。
1、实验原理
双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶 的盐溶液和高分子溶液组成。常见的双水相系统可分 为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。
双水相萃取法分离提纯蛋白质是利用蛋白质在两
种物质所形成的双水相中的分配系数的不同而进行分
离的。
双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛，最常采用 的双水相体系是PEG/Dex或PEG/低分子盐系统，其中 低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。
(4) 可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加入PEG和无机 盐后再通入珠磨机进行破碎，然后用离心机分相。既节省 了萃取设备和时间，又避免了胞内酶的损失。
双水相萃取的基本特点
(5) 能进行萃取性的生物转化。在一些双水相体系中可将 发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合， 即生物反应在其中一相中进行，同时生成的反应产物被连 续萃取到另一相中。不仅解决了产物反馈抑制作用造成的 产量低的问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳 定，活性更大。因为生物反应和生物产物的提取同时进行， 尤其适于连续生产。
本实验采用PEG/硫酸铵双水相体系研究牛血清 蛋白的分配。
蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法，利 用考马斯亮蓝进行染色，然后检测吸光度，对 照标准曲线即可得到蛋白质含量。
2、实验目的
（1）了解双水相系统成相的原理及分配系数 的测定方法。
（2）探究双水相的形成条件，掌握双水相萃 取法分离技术。
溶于小量蒸馏水中，然后稀释并定容至500ml，配成120 ug/ml蛋白溶液。 3、器具： 离心机、10ml刻度离心管、移液管或可调式移液器、漩涡振荡器、小滴管、
试管、分析天平、恒温水浴锅、容量瓶、分光光度计
三、实验过程
（一）考察组分浓度对形成双水相体系的影响： ⑴ 配制40% PEG1000原液（m/V）：（各组共用） 称取400.00g PEG1000加水溶解，定容至1000ml，密度为
二、试剂及器具
1、材料： 牛血清蛋白 500mg/L 2、试剂： PEG1000，（NH4）2SO4，考马斯亮蓝G—250，牛血清蛋白 ⑴ 考马斯亮蓝溶液配制：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，
加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释并定容至1000ml。 ⑵ 牛血清蛋白溶液配制：精确称取0.060g牛血清蛋白，加入0.526gNaCl，
双水相萃取概述
双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同 一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性， 当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的 两相。
因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都 占很大比例(85％~95％)，活性蛋白或细胞在这种环境中 不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机 溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂 的缺点。
双水相萃取的基本特点
(6) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和萃取专 一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近，造 成其萃取专一性不高。亲和萃取就是将一种和目标蛋白质 有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合，该成相 聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时， 目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所 在相中，其它杂蛋白则进入另一相。此技术已用于乙醇脱 氢酶、丙酮酸激酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、 膜等粒子的提取。
K=C1/C2
思考题：
1、常用双水相体系有哪些？双水相体系形成 的原因是什么？
2、影响双水相成相的因素有哪些？
双水相萃取分配系数K=Ct/Cb为上相和下相的浓度比。
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的 各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生 物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:
lnm=lnme+lnmh+lnml
me，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物
亲和作用对溶质分配系数的贡献。