实验五 双水相萃取及分配系数的测定
生物分离 双水相萃取试验指导
对全部高中资料试卷电气设备，在安装过程中以及安装结束后进行高中资料试卷调整试验；通电检查所有设备高中资料电试力卷保相护互装作置用调与试相技互术关，通系电1，力过根保管据护线生高0不产中仅工资2艺料22高试2可中卷以资配解料置决试技吊卷术顶要是层求指配，机置对组不电在规气进范设行高备继中进电资行保料空护试载高卷与中问带资题负料2荷试2，下卷而高总且中体可资配保料置障试时2卷，32调需3各控要类试在管验最路；大习对限题设度到备内位进来。行确在调保管整机路使组敷其高设在中过正资程常料1工试中况卷，下安要与全加过，强度并看工且25作尽52下可22都能护可地1关以缩于正小管常故路工障高作高中；中资对资料于料试继试卷电卷连保破接护坏管进范口行围处整，理核或高对者中定对资值某料，些试审异卷核常弯与高扁校中度对资固图料定纸试盒，卷位编工置写况.复进保杂行护设自层备动防与处腐装理跨置，接高尤地中其线资要弯料避曲试免半卷错径调误标试高方中等案资，，料要编试求5写、卷技重电保术要气护交设设装底备备置。4高调、动管中试电作线资高气，敷料中课并设3试资件且、技卷料中拒管术试试调绝路中验卷试动敷包方技作设含案术，技线以来术槽及避、系免管统不架启必等动要多方高项案中方；资式对料，整试为套卷解启突决动然高过停中程机语中。文高因电中此气资，课料电件试力中卷高管电中壁气资薄设料、备试接进卷口行保不调护严试装等工置问作调题并试，且技合进术理行，利过要用关求管运电线行力敷高保设中护技资装术料置。试做线卷到缆技准敷术确设指灵原导活则。。：对对在于于分调差线试动盒过保处程护，中装当高置不中高同资中电料资压试料回卷试路技卷交术调叉问试时题技，，术应作是采为指用调发金试电属人机隔员一板，变进需压行要器隔在组开事在处前发理掌生；握内同图部一纸故线资障槽料时内、，设需强备要电制进回造行路厂外须家部同出电时具源切高高断中中习资资题料料电试试源卷卷，试切线验除缆报从敷告而设与采完相用毕关高，技中要术资进资料行料试检，卷查并主和且要检了保测解护处现装理场置。设。备高中资料试卷布置情况与有关高中资料试卷电气系统接线等情况，然后根据规范与规程规定，制定设备调试高中资料试卷方案。
第五章 双水相萃取
七、双水相萃取的研究进展
1. 2. 廉价双水相体系的研究开发 双水相萃取与其它分离技术的结合
思考题
1. 2. 3. 4. 何谓双水相萃取？ 双水相体系可分为那几类？目前常用的体系有那两 种？ 为什么说双水相萃取适用于生物活性大分子物质分 离？ 影响双水相萃取的因素有那些？当电解质存在，pH 是如何影响双水相萃取的？ 用双水相萃取细胞破碎（匀浆）液时，一般是把目 标产物分布在上相，而细胞碎片、杂蛋白等杂质分 布在下相，为什么？ 何谓双水相亲和萃取？
第五章双水相萃取aqueoustwophaseextraction一概述1定义利用生物物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异进行分离的过程pegdex形成的双水相的组成peg聚乙二醇dextrandex葡聚糖2双水相体系作用力没有强烈的引力或斥力
第五章 双水相萃取
（Aqueous Two-phase Extraction）
5.
6.
2)双水相体系的种类
–
–
两种都是非离子型高聚物（PEG / DEX、聚丙二醇/ DEX等）
其中一种是离子型高聚物（羧甲基纤维素钠/葡聚糖DEX）
–
–
两种都是离子型高聚物（羧甲基纤维素/羧甲基葡聚糖钠）
其中一种是无机盐（磷酸盐、硫酸盐等）
二、双水相系统的相图
三、双水相萃取的分配平衡公式
c1 1 A Z（U 1 U 2） exp c2 KT
一、概述
1、定义——利用生物物质在
互EG——聚乙二醇 Dextran(DEX)——葡聚糖
图1 PEG/DEX形成的双水相的组成
生化分离实验(双水相萃取、人参皂苷提取)
实验一：双水相体系萃取甘草酸盐实验目的：学习双水相体系萃取的原理；掌握双水相体系萃取基本操作技术。
实验原理：双水相萃取与水-有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配。
当萃取体系的性质不同时,物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如疏水键、氢键和离子键等) 的存在和环境因素的影响,使其在上、下相中的浓度不同。
物质在双水相体系中分配系数K可用下式表示：K= C上/ C下其中K为分配系数，C上和C下分别为被分离物质在上、下相的浓度。
分配系数K等于物质在两相的浓度比,由于各种物质的K值不同,可利用双水相萃取体系对物质进行分离。
其分配情况服从分配定律，即，“在一定温度一定压强下，如果一个物质溶解在两个同时存在的互不相溶的液体里，达到平衡后，该物质在两相中浓度比等于常数”，分离效果由分配系数来表征。
实验器材：离心机、粉碎机、烧杯、分液漏斗、天平、烧杯、布氏漏斗、真空泵、吸管、量筒等。
试剂与材料：甘草、氨水、无水乙醇、磷酸氢二钾、浓硫酸等。
操作步骤：取甘草5 0g粉碎至粗粉（40目左右），加400ml2％氨水100℃煎煮30min，滤过，浓缩至1:2（约25ml），称取磷酸氢二钾9g 溶于25ml甘草提取浓缩液中，搅拌使其溶解，并与36ml无水乙醇混合，倒入60ml离心管中，以2000r/min离心3min，形成二相，用分液漏斗将二相分开，分别向二相缓慢逐滴加入浓硫酸至pH＝2，停止加酸，放冰浴冷却10min，使沉淀完全析出，离心（4000r/min，3min），沉淀用无水乙醇洗涤，称重。
结果与讨论：上相结晶主要是甘草单铵盐，重量约在0.25g，下相结晶主要是磷酸盐，重约2.5g。
实验二：心脉康片人参皀苷的提取实验目的：学习吸附色谱法，掌握其原理和操作方法。
实验原理：吸附色谱利用固定相吸附中心对物质分子吸附能力的差异实现对混合物的分离，吸附色谱的色谱过程是流动相分子与物质分子竞争固定相吸附中心的过程。
双水相萃取技术及其应用.doc
双水相萃取技术及其应用.《生物资源开发与利用专题》双水相萃取技术及其应用152310018杨双水相萃取(ATPE)是一种利用不相容的两个水相之间分配系数的差异来萃取物质的方法。
例如:将葡聚糖和聚乙二醇按一定比例与水混合，溶液呈浑浊状，静置平衡后，溶液分为两相，两相互不混溶，上相富含聚乙二醇，下相富含葡聚糖。
当两种聚合物或一种聚合物和一种盐溶解在同一溶剂中时，由于聚合物之间或聚合物和盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐的浓度达到一定值时，它将被分成两个不混溶的相。
因为所用的溶剂是水，所以称为双水相，其中水占很大比例(85%至95%)，活性蛋白质或细胞在这种环境中不会失活，但它可以以不同的比例分布在两相中，克服了有机溶剂萃取中容易失活蛋白质和不溶性强亲水性蛋白质的缺点。
双水相萃取的优点:1.操作条件温和，在常温常压下进行。
它不会导致生物活性物质失活或变性。
2.两相界面张力小，萃取过程中两相高度分散，传质速度快。
3.消除了有毒和易燃有机溶剂的使用，这可以提供温和的水环境，并避免提取组分的脱水和变性。
4.溶质对目标组分具有很强的选择性，大量的杂质可以与所有固体物质一起被除去，从而能够进行分离操作。
5、工艺简化，连续操作容易，处理量大，适合工业化应用。
缺点:该体系易乳化，成相聚合物成本较高，大多数水溶性聚合物粘度较高，不易定量控制，聚合物回收困难。
I:双水相萃取技术的发展趋势目前，用于分离生物物质的双水相体系主要有两种:非离子聚合物/水体系(最常用的是聚乙二醇/葡聚糖)和非离子聚合物/无机盐/水体系(常用的是聚乙二醇/盐体系)是由于在两种类型的双水相体系中使用了无毒聚合物，并且它们的多元醇和多糖结构可以确保生物大分子的稳定性。
然而，在实际应用中，这两种类型的双水相系统有其自身的缺点。
非离子聚合物/水体系能保证生物活性物质的活性，界面吸附少，但所用的高分子材料如葡聚糖价格昂贵，体系粘度大，限制了大规模应用。
与前者相比，非离子聚合物/无机盐/水体系成本低、粘度低，但该体系会导致一些敏感的生物活性物质失活，此外，还会产生大量高浓度含盐废水。
双水相萃取原理
双水相萃取原理
双水相萃取是一种将有机物从水溶液中分离出来的方法。
它基于水和有机溶剂不相溶的性质，通过两相之间的分配系数差异来实现目标物质的选择性提取。
双水相萃取的原理是利用两种互不相溶的溶剂（一般是水和有机溶剂），在某一条件下将目标物质在两相之间分配。
通常情况下，有机物更易溶于有机相，而无机物更易溶于水相。
具体的操作步骤如下：首先将水溶液和有机溶剂混合，形成两相体系。
然后经过搅拌或震荡，让目标物质在两相之间达到平衡分配。
接下来，待两相分离后将有机相和水相分开。
最后，可以通过蒸发或其他方法将目标物质从有机相中提取出来。
双水相萃取的选择性是基于目标物质在两相之间的分配系数差异。
分配系数是指物质在两相之间分配的比例，由物质的溶解度和两相的互溶性决定。
通常情况下，选择合适的有机溶剂和水相条件可以使目标物质在有机相中富集，而其他杂质则大部分留在水相中。
双水相萃取的优点是操作简单、成本低廉，适用于大量样品的初步分离和富集。
但是也存在一些局限性，例如只适用于水溶液中的有机物质，对目标物质的选择性有一定要求。
总之，双水相萃取是一种利用两相体系中的分配差异来实现目标物质提取的方法。
通过选择合适的有机相和水相条件，可以实现对目标物质的选择性富集，从而达到分离和纯化的目的。
双水相萃取
双水相萃取一实训目的掌握双水相萃取的原理及方法。
学习双水相萃取相图的制作。
二实训原理双水相萃取法（aqueous two-phase extraction）是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行萃取的方法。
高聚物PEG和盐（硫酸铵）形成的互不相溶的两相，倒入牛奶中，蛋白质富集在一相中。
三实训仪器和药品试管，离心机，天平，离心管，三角瓶，滴定管，聚乙二醇2000（PEG2000），硫酸铵，牛奶。
四实训步骤1 PEG2000-硫酸铵双水相体系相图的测定（1）取10%PEG2000溶液10mL于三角瓶中；（2）用40%硫酸铵溶液装入滴定管中滴定至三角瓶中溶液出现浑浊，记录硫酸铵消耗的体积。
加入1mL水使溶液澄清，继续用硫酸铵滴定至浑浊，重复7~8次，记录每次硫酸铵消耗的体积，计算每次出现浑浊时体（3）以硫酸铵的浓度（W/V）为横坐标，PEG浓度（W/V）为纵坐标，绘制出PEG2000-硫酸铵双水相体系相图。
2PEG2000-硫酸铵双水相体系的配制自行在相图中双水相区选择一个点，根据该点的PEG2000浓度和硫酸铵浓度，分别量取适量的10%PEG2000溶液和硫酸溶液，混合均匀后以2500rpm/min离心5min后分相，得到双水相体系（总量约3mL）。
3利用PEG2000-硫酸铵双水相体系萃取分离牛奶中的蛋白质取1mL 牛奶装入上述双水相体系中，搅拌均匀，于2500rpm/min 离心5min，静置分层，分别量取上下相的体积。
萃取完成后，如果牛奶中的蛋白质不能被萃取到上相，则证明所选的1PEG2000 与硫酸铵浓度不对，应重新选择。
五结果与讨论1如果正确地绘制相图。
2如何根据相图配制双水相体系，并对混合物进行分离。
2。
双水相萃取详细资料(ppt 44页)
方盼 赵梅
目录
（一）两水相的形成 （二）相图 （三）分配理论 （四）影响分配的参数 （五）应用
Question
• 常用的溶液萃取法能用来提 取生物大分子如蛋白质吗？
Reason
➢大部分萃取采用一个是水相，另一个是有机相 ➢蛋白质遇到有机溶剂，易变形失活 ➢有些蛋白质有极强地亲水性，不能溶于有机溶剂。
使蛋白质易分配于富含该PEG的相中，使分配系数 增大，而葡聚糖的分子量减小，会使分配系数降 低，这是一条普遍规律
这是因为成相聚合物的疏水性对酶等亲 水性物质的分配产生较大的影响。
同一聚合物的疏水性随分子量的增大而 增大，当PEG的分子量增加是，在质量浓 度不变的情况下，其两端羟基数减少，疏 水性增加，亲水性的蛋白质不再向富含 PEG相中聚集，而转向另一相。 那么，分子量降低时，蛋白质就易分配 于富含PEG的相了
结论：加入适当的 盐类，会大大促进 带相反电荷的生物 大分子的分离。
pH
pH值对分配的影响源于两个方面的原因： （一）pH值会影响蛋白质中可以解离基团
的解离度，因而改变蛋白质所带的电荷和 分配系数。
lnKlnK0R FT Z
（二）pH值会影响磷酸盐的解离程度， 改变H2PO4-和HPO42-之间的比例， 而影响分配系数。
双水相系统
PEG = 聚已二醇 Kpi = 磷酸钾 DX = 葡聚糖
双水相萃取:
利用生物大分子在两种水相之间的分配比 例不同而达到分离纯化生物大分子的目的。
（二）相图
两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例 混合时，可形成均相或两相，这种水性两相 的形成条件和定量关系，常用相图来表示， 它是一条双节线。
K=C1/C2 C1代表上相浓度，C2代表下相浓度。当相
双水相体系配制与萃取实验报告。注意事项
双水相体系配制与萃取实验报告。
注意事项
平行试验测定值之差不得超过3%。
四、双水相系统在蛋白酶分离中的应用
利用选择的五个成相体系对蛋白酶进行分离纯化，确定一个最佳分离体系。
1·向干燥的离心管中按比例加入一定质量PEG和盐溶液，先用玻璃棒搅匀，再在混合器上混匀，加入2mlL的酶液，在混合器上混合，调pH，静置15分钟，离心10分钟（2000r/min）o
2·读取上下相体积及总体积，用1mL注射器分别取上、下相ImL，分别定容至100mL，测其酶活力。
3.测原酶液酶活力：用移液管吸取ImL发酵液，定容至100mL，测其酶活力为原酶液酶活力。
双水相萃取实验
三. 选择正确的吸出上、下相操作方法：
1. 吸管小心插入下相，吸出下相
换吸管，吸出上相。
2. 吸管小心吸出上相
插入下相，吸出下相。
3. 吸管小心吸出上相 吸出下相。
将多余上相和少量下相弃去
换吸管，
11
生化物质分离纯化基础实验
四. 可调式移液器（枪）正确的操作方法（是非题）： 1. 要吸取0.4ml液体，可用1000 ~ 5000 μl 规格的枪。 2. 向顺时针方向旋，数值减小；逆时针方向旋，数值增
数g
ml
g
纯(NH4)2SO4 累计量 g
溶液累计 总量 g
PEG
%(g/g)
(NH4)2SO4
%(g/g)
1 0.5 2 0.3 3 0.3 4 0.3 5 0.5 6 0.5 7 0.5
5
生化物质分离纯化基础实验
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
一. 实验原理
1. 糖化酶为生物大分子蛋白，在双水相系统中不同程度地分配，分配 系数 K = C上/ C下。 相比R = V上/ V下
2. 考马斯亮兰（Coomassie Brilliant Blue G-250） 比色法测定两相中 蛋白质浓度：考马斯亮兰G－250是一种染料，酸性溶液中呈棕红 色。与蛋白质通过范德华键结合成兰色复合物，595nm波长有最大 吸收值。 低浓度时，与蛋白质浓度的关系服从比尔定律。
6
生化物质分离纯化基础实验
1 0.1
g / ml
10
生化物质分离纯化基础实验
● 思考和讨论:
一. 加完物料后必须将离心试管沿轴向充分振摇，直至固体全部溶解，原因 是什么？
二. 1. 2.
选择正确的离心操作顺序: 将装有相等体积的两只离心试管(水和样品液)对称放在离心机中。 将两只装有液体的离心试管放入套管中一起称重平衡 对称放在离心机中。
生物分离-双水相萃取实验指导
双水相萃取相图的绘制1．实验目的⑴掌握绘制双水相相图的方法⑵理解双水相形成条件和定量关系2．实验原理双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。
双水相形成条件和定量关系常用相图来表示（见图1）。
成相物质都能与水无限混合，当它们的组成位于曲线的上方时（用M点表示）体系就会分成两相，分别有不同的组成密度，轻相（或称上相）组成用T点表示，重相（或称下相）组成用B点表示，T、B点称为节点。
直线TMB称为系线，是相图的重要特征，关系到相的平衡组成。
所有组成在系线上的点，分成两相后，其上下相组成均分别为T、B，但是其体积比（V T/V B）不同。
相体积比可由相图上线段比（BM/MT）估算，即服从杠杆规则。
本实验绘制PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。
图1 双水相体系相图3．实验材料及仪器PEG1000原液（0.6g/mL，w/w=56.926%，密度1.054）；PEG2000原液（0.4g/mL，密度1.02）；硫酸铵原液（0.43g/mL，密度1.2）。
4．实验方法准确称取2.0mLPEG原液，加入25 mL具塞刻度试管中，然后逐滴加入硫酸铵原液，混合，直至试管中开始出现混浊为止，记录加入硫酸铵量，算出PEG和硫酸铵在系统中的质量百分浓度，再向试管中加入适量水（0.2~0.5~1.0 mL），使体系变澄清，记录加入水的量，并继续加入硫酸铵，使体系再次变混浊，如此反复操作二十几次，计算达到混浊时PEG 和硫酸铵在系统中的质量百分含量，得出不同相对分子量的PEG和硫酸铵的双节线相图节点。
以上述试验所得结点绘制出不同相对分子量的PEG/(NH4)2SO4体系双水相相图。
5．数据处理表1 相图节点数据序号PEG质量（g）体系中盐溶液（mL）盐质量（g）体系加水量（g）体系总质量（g）PEG质量分数（w/w）盐质量分数（w/w）1 02 0.33 0.5……………………n 1.5双水相萃取牛血清白蛋白1．实验目的⑴掌握PEG/无机盐体系双水相萃取蛋白质的方法⑵了解影响蛋白质在双水相体系中分配行为的主要参数2．实验原理双水相是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间在水中以一定的浓度混合而形成互不相容的两相，由于溶质在两相间的分配系数的差异而进行萃取的方法即为双水相萃取。
蛋白质在双水相中分配系数的测定实验流程
蛋白质在双水相中分配系数的测定实验流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
文档下载后可定制修改，请根据实际需要进行调整和使用，谢谢！本店铺为大家提供各种类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，想了解不同资料格式和写法，敬请关注！Download tips: This document is carefully compiled by this editor. I hope that after you download it, it can help you solve practical problems. The document can be customized and modified after downloading, please adjust and use it according to actual needs, thank you! In addition, this shop provides you with various types of practical materials, such as educational essays, diary appreciation, sentence excerpts, ancient poems, classic articles, topic composition, work summary, word parsing, copy excerpts, other materials and so on, want to know different data formats and writing methods, please pay attention!蛋白质在双水相中分配系数的测定实验流程引言蛋白质在生物学研究中起着至关重要的作用，而了解其在双水相体系中的分配行为对于理解其功能和应用具有重要意义。
第5章 双水相萃取
双水相系统的相图可由实验测定： 双水相系统的相图可由实验测定
以此类推， 以此类推，由实验测定一系列双节线上 的系统组成点，以高聚物P浓度对高聚物 的系统组成点，以高聚物 浓度对高聚物 Q浓度作图，即可得到双节线 浓度作图， 浓度作图
28
2.3 常用的双水相体系
29
常用体系
双水相萃取中常采用的双聚合物系 统为PEG/Dex，该双水相的上相富 ， 统为 含PEG，下相富含 ，下相富含Dex。 。
4
概述: §1. 概述
问题的提出： 问题的提出：常规的分离方法 1． 过滤和离心技术 ． 已被广泛地应用于固液分离工程中， 已被广泛地应用于固液分离工程中， 但这两种单元操作依赖于被分离颗粒的 尺寸或密度的差异， 尺寸或密度的差异，因此当希望收集微 生物的细胞器、分离去除细胞碎片、 生物的细胞器、分离去除细胞碎片、提 取和浓缩胞内物质时，普通的过滤和离 取和浓缩胞内物质时， 心技术就不合适。 心技术就不合适。
36
(1)高聚物的分子量 高聚物的分子量
在高聚物浓度保持不变的前提下， 在高聚物浓度保持不变的前提下，降 低该高聚物的分子量， 低该高聚物的分子量，被分配的可溶性 生物大分子如蛋白质或核酸， 生物大分子如蛋白质或核酸，或颗粒如 细胞或细胞碎片和细胞器， 细胞或细胞碎片和细胞器，将更多的分 配于该相。 体系而言， 配于该相。对PEG – Dcxtran体系而言， 体系而言 Dextran分子量减小，分配系数会减小； 分子量减小， 分子量减小 分配系数会减小； PEG 的分于量减小，物质的分配系数会 的分于量减小， 增大(见表 见表2-13)，这是一条普遍规律。 增大 见表 ，这是一条普遍规律。
7
双水相萃取技术的优点： 双水相萃取技术的优点：
两水相系统中蛋白质分配系数的测定
两水相系统中蛋白质分配系数的测定一、实验目的和要求了解蛋白质在两水相系统中分配系数的测定方法二、实验原理1、两水相的形成高聚物与无机盐在水中会形成两个相，如PEG与硫酸盐或碱性磷酸盐，这是由于盐析作用。
两种亲水性高聚物在水中会形成两个相，这是由于聚合物的不相容性。
但是只有达到一定的浓度时，才能形成两相；两水相形成的定量关系可用相图来表示；相图是研究双水相萃取的基础。
2、两水相系统的优点（1）生物大分子活性物质（蛋白）不易受到破坏；（2）两相中水分占很大比例；（3）两水相的相间张力小,相分离过程温和。
（4）两水相之间的传质过程和平衡过程快速，可以实现快速分离；（5）易于放大3、在两水相系统中，生物物质与成相组分之间通过疏水键、氢键和离子键等相互作用而不同程度地分配在两相中。
（1）分配系数：当萃取达到平衡时，蛋白质在上、下两相中的浓度之比称为分配系数，分配系数K = C上/ C下;（2）相比：上下相体积比称为相比R = V上/ V下三、实验器材与试剂1. 器材天平，台式离心机，10 mL刻度离心管，移液管，容量瓶，试管等。
2. 试剂糖化酶，聚乙二醇400，硫酸铵和考马斯亮蓝等。
四、操作方法1、蛋白质在两相中的分配在10 mL刻度离心管中，用电子天平称取硫酸铵固体1.30 g，聚乙二醇400液体2.00 g，用吸管加入已稀释的糖化酶液2.00 mL，然后加水，直到总量为8.00g，用橡皮塞塞紧试管口，用力振摇数分钟，使硫酸铵完全溶解，并使两相充分混合，以便酶在两相中的分配达到平衡，然后，用台式离心机离心3 min，转速调节至3000 r/min，分别读出上、下相的体积，求相比R，并用考马斯亮蓝比色法测定两相中的蛋白质浓度，求出分配系数。
2、考马斯亮蓝比色法测定蛋白质含量制作标准曲线。
样品测定方法如下：上相液：吸取上相液0.5 mL，用水稀释定容到50 mL，取1 mL稀释液于试管中，按标准曲线相同的方法加入考马斯亮蓝溶液并比色测定。
分配系数的测定实验报告
分配系数的测定实验报告
实验名称：分配系数的测定实验
实验目的：
1、了解液体与液体之间的相互作用力。
2、学习利用分配系数来进行有机物的提取和分离。
3、掌握测定物质分配系数（K值）的方法。
实验原理：
分配系数K值（K=浓度在有机相中的浓度/浓度在水相中的浓度）
是描述物质在两种液体中分配均相的程度的指标，该指标可以用来描
述两种液体之间的相互作用力。
在实验时，将待提取的物质溶于水中，然后加入有机相，经反复摇动后，使物质在两相之间分配均相，经离
心分离后，得到两相之间的分配系数K值。
实验器材：
滴定管、计量瓶、量筒、试管、取样瓶、离心机
实验步骤：
1、取一定量的石油醚加入试管中，加入待提取物溶液（如苯环）。
2、摇匀，均相分配后放置一段时间离心分离。
3、取上层有机相并装入烘干皿进行烘干。
4、称量所得有机相质量，计算分配系数K值。
实验结果：
在实验中，成功分离了异丙基苯磺酸盐和苯乙二酮。
测定结果如下：
样品溶剂 K值
苯环石油醚 0.36
苯石油醚 2.38
分析和讨论：
实验结果与文献数据表明，不同物质的分配系数具有很大差异，这主要是由于它们分子之间相互作用力的差异所导致的。
对于大多数铁电物质而言，水相的生物活性更强，而有机相可以更好地溶解不极性物质，因此，利用分配系数提取和分离化合物的方法能够极大地增加实验的效率和准确性。
结论：
通过此次实验，我们学会了利用分配系数来进行有机物的提取和分离，并掌握了测定物质分配系数的方法，积累了实验经验，对学习后续实验和专业的学习有积极的指导意义。
分配系数的测定
分配系数（Partition Coefficient. P)代表药物分配在油相和水相中的比例， 是药物制剂中设计处方、开发新药以及临 床应用时的重要参数之一。
C油相 在油相中药物的质量浓度 Ｐ＝ ＝ C水相 在水相中药物的质量浓度
测定分配系数的意义
反映了溶质在两相中的迁移能力及分离效能，是 描述物质在两相中行为的重要物理化学特征参数。 分配系数代表药物分配在油相和水相中的比例， 是药物制剂中设计处方、开发新药以及临床应用 时的重要参数之一。 。
影响分配系数的因素 1.组分 2.温度 3.压力
二、实验内容
配试液做什么？
1.水杨酸试液的配制 精密称取水杨酸标准品0.050g，置 50ml容量瓶溶解定容。计算出精确百分 含量。
2.标准曲线的绘制 精密称取约0.015g的水杨酸，置 100ml容量瓶中溶解定容，再分取2.0， 4.0，6.0，8.0，10.0ml配制成25ml溶 液，以硫酸铁铵为显色剂（10ml水杨酸 溶液＋2ml显色剂），蒸馏水为空白，在 530nm波长处测其吸收度，将吸收度对 浓度回归得标准曲线回归方程
实验二
分配系数的测定
遵义医学院药剂学教研室
一、实验目的 通过实验掌握药物在互不相溶的两液 相中的分配系数测定方法。
•[实验原理]
温度、压力一定时，在两种彼此接触 而又互不相溶的溶剂之间，溶质可按一定 比例分别溶解。 当分配达到平衡时，两种溶液平衡浓 度的比值是一个常数。
•[实验原理]
P越大说明什 么？
What is the 3.分配系数的测定 solution？ 精密吸取25ml水杨酸试液，置分液漏斗中, 再精密加入等体积(25ml)的氯仿，时时振摇 30min，静置10min，如此反复两次，静置分 层后弃去下层。精密吸取上层溶液2.5ml配成 25ml溶液（稀释10倍）。取10ml溶液+2ml 硫酸铁铵，530nm处测A，代入方程计算浓度， 乘以稀释倍数，即得萃取后的C水，计算P值。
分离技术实验
分离技术实验实验⼀: 双⽔相萃取⽜⾎清蛋⽩⼀.实验⽬的1.了解双⽔相系统的成相原理和⽅法；2.了解制作双⽔相系统相图的⽅法，加深对相图的认识；3.掌握双⽔相溶液配制与双⽔相萃取的操作；4.掌握分配系数和萃取收率的计算⽅法。
⼆. 实验原理双⽔相系统是由两种互不相溶的聚合物（如聚⼄⼆醇（PEG）与葡聚糖（DX））或者互不相溶的聚合物溶液和盐溶液（如PEG与（NH4）2SO4）组成。
双⽔相系统的制备⼀般是将两种溶质分别配制成⼀定浓度的⽔溶液，然后将两种溶液按照不同的⽐例混合，静⽌⼀段时间，当两种溶质的浓度超过某⼀浓度范围时，就会产⽣两相。
相图是研究双⽔相萃取的基础，双⽔相形成条件和定量关系常⽤相图来表⽰。
图1是典型的⾼聚物-⾼聚物双⽔相体系的直⾓坐标相图，两种聚合物A、B 以适当⽐例溶于⽔就会分别形成有不同组成的两相，上相组成⽤T点表⽰，下相组成⽤B点表⽰，由图1可知上下相所含⾼聚物有所偏重，上相主要含B，下相主要含A。
曲线TCB称为结线，直线TMB称为系线。
结线上⽅是两相区，下⽅为单相区，若配⽐取在曲线上，则混合后，溶液恰好从澄清变为混浊。
组成在系线上的点，分为两相后，其上下相组成分别为T和B，T、B量的多少服从相图的杠杆定律。
即T和B相质量之⽐等于系线上MB与MT的线段长度之⽐。
⼜由于两相密度相差很⼩，故上下相体积之⽐也近似等于系线上MB与MT线段长度之⽐。
图1 A-B双⽔相体系相图双⽔相萃取与有机溶剂萃取原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配原则。
当物质进⼊双⽔相体系后，由于表⾯性质、电荷作⽤和各种⼒（如憎⽔性、氢键、离⼦键等）的存在，使得待分离的物质在上、下相中的浓度不同。
对于某⼀物质，只要选择合适的双⽔相体系，控制⼀定的条件就可以得到合适的分配系数，从⽽达到分离纯化的⽬的。
本实验选择PEG-硫酸铵双⽔相系统萃取⽜⾎清蛋⽩。
双缩脲反应是指蛋⽩质在碱性溶液中与⼆价铜离⼦结合⽣成紫⾊络合物的反应。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
1.200g/mL。 ⑶ 按质量百分比配制3管（各8g,要求完全溶解，混合均匀）。
添加
顺序 管
PEG
PEG
40%
质量浓度5%
质量浓度10%
丙醇 磷酸钾 硫酸铵
双水相萃取的基本特点
(1) 体 系 有 生 物 亲 和 性 。 两 相 中 的 水 分 含 量 通 常 高 达 65%～90% ，所用的PEG、dextran等高聚物或磷酸盐、硫 酸盐等无机盐对蛋白质、核酸等生物活性物质无毒害，甚 至还有稳定保护作用，而且相界面张力比水-有机或有机有机两相体系的界面张力要小1～3 个数量级。由于生物 活性物质在有机溶剂中易变性，再加上有的生物活性物质 亲水性很强，不溶于有机溶剂，有机溶剂萃取等分离技术 难以在生物活性物质的分离中发挥其效能。
K=C1/C2
思考题：
1、常用双水相体系有哪些？双水相体系形成 的原因是什么？
2、影响双水相成相的因素有哪些？
双水相萃取概述
现代生物技术中，基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内 产品，需经细胞破碎后才能提取、纯化，细胞颗粒尺寸的 变化给固-液分离带来了困难，同时这类产品的活性和功能 对pH值、温度和离子强度等环境因素特别敏感。由于它们 在有机溶剂中的溶解度低并且会变性，因此传统的溶剂萃 取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶 束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。因 此基因工程产品的商业化迫切需要开发适合大规模生产的、 经济简便的、快速高效的分离纯化技术。其中双水相萃取 技术(又称水溶液两相分配技术)是近年来出现的引人注目、 极有前途的新型分离技术。
双水相萃取的基本特点
(2) 与常用的亲和层析相比，双水相萃取能够在较少的溶 液量和较短的操作时间内获得较高产量的产品。另外，操 作能够容易、精确地按比例放大，非常适合大规模应用， 可进行连续生产。而亲和层析由于操作难于放大，应用受 到限制。
(3) 聚合物的浓度和分子质量、无机盐的种类和浓度、pH 以及温度等均能影响被分配物质在两相间的分配，所以操 作容易进行控制，进而达到目的产物的最佳萃取条件。
各种类型的双水相体系
类型
形成上相的聚合物 形成下相的聚合物
聚乙二醇 非离子型聚合物/ 非离子型聚合物
聚丙二醇
葡聚糖 聚乙烯醇 聚乙二醇 聚乙烯吡咯烷酮
高分子电解质/非离子型聚合物
羧甲基纤维素钠
聚乙二醇
高分子电解质/高分子电解质
葡聚糖硫酸钠
羧甲基纤维素钠
聚合物/ 低分子量化合物 聚合物/ 无机盐
葡聚糖 聚乙二醇
双水相萃取的基本特点
(6) 亲和萃取(亲和分配) 可大大提高分配系数和萃取专 一性。由于目标蛋白质与其他杂蛋白的理化性质相近，造 成其萃取专一性不高。亲和萃取就是将一种和目标蛋白质 有很强亲和力的配基与一种成相聚合物共价结合，该成相 聚合物与另一种成相聚合物形成双水相体系进行萃取时， 目标蛋白质专一性地进入结合有配基的那种成相聚合物所 在相中，其它杂蛋白则进入另一相。此技术已用于乙醇脱 氢酶、丙酮酸激酶和核酸内切酶等酶以及细胞、细胞器、 膜等粒子的提取。
溶于小量蒸馏水中，然后稀释并定容至500ml，配成120 ug/ml蛋白溶液。 3、器具： 离心机、10ml刻度离心管、移液管或可调式移液器、漩涡振荡器、小滴管、
试管、分析天平、恒温水浴锅、容量瓶、分光光度计
三、实验过程
（一）考察组分浓度对形成双水相体系的影响： ⑴ 配制40% PEG1000原液（m/V）：（各组共用） 称取400.00g PEG1000加水溶解，定容至1000ml，密度为
a 系线 两相区
双节线 均相区
b
两相区 系线
双节线 均相区
临界点
在系线上各点处系统的总浓度不同，但均分成组成相同而体 积不同的两相。两相的体积近似服从杠杆规则，即
系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两 相间的性质差别越大，反之则越小。当系线长度趋向于零时， 即在图b的双节线上K点，两相差别消失，任何溶质在两相中 的分配系数均为1，因此K点称为临界点(critical point)。
二、试剂及器具
1、材料： 牛血清蛋白 500mg/L 2、试剂： PEG1000，（NH4）2SO4，考马斯亮蓝G—250，牛血清蛋白 ⑴ 考马斯亮蓝溶液配制：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，
加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释并定容至1000ml。 ⑵ 牛血清蛋白溶液配制：精确称取0.060g牛血清蛋白，加入0.526gNaCl，
质量浓度15%
1 PEG1000
原液 1.0290g(1.00ml) 2.0740g(2.00ml) 3.1112g(3.00ml)
2
H2O 4.7304g(4.73ml) 1.4608g(1.46ml) 0.4272g(0.43ml)
43% 硫
（NH4）2SO4 质量浓度10%
（NH4）2SO4 质量浓度20%
实验五 双水相萃取及分配系 数的测定
(Aqueous Two Phase Extraction)
双水相萃取概述
双水相萃取(aqueous two-phase partitioning) 是1896 年Beijerinck 把琼脂和可溶性淀粉或明胶相混合时最早发 现的。1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新发现此体 系并第一次用来提取生物物质。1979年，Kula和Kroner等 人将双水相体系用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使 胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于双水相体系的研 究和应用逐步展开并取得很大进展。在提纯有生理活性的 生物物质方面，与其他提取方法相比，它具有许多优势。 现在双水相萃取已被广泛用于蛋白质、酶、核酸、病毒、 细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化 生产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方 面的巨大应用前景。
双水相萃取分配系数K=Ct/Cb为上相和下相的浓度比。
生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的 各种相互作用，其中主要有静电作用、疏水作用和生 物亲和作用等。因此，分配系数是各种相互作用的和:
lnm=lnme+lnmh+lnml
me，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物
亲和作用对溶质分配系数的贡献。
(4) 可与细胞破碎相结合，即细胞悬浮液中加入PEG和无机 盐后再通入珠磨机进行破碎，然后用离心机分相。既节省 了萃取设备和时间，又避免了胞内酶的损失。
双水相萃取的基本特点
(5) 能进行萃取性的生物转化。在一些双水相体系中可将 发酵生产过程中的生物转化与下游处理的第1步相结合， 即生物反应在其中一相中进行，同时生成的反应产物被连 续萃取到另一相中。不仅解决了产物反馈抑制作用造成的 产量低的问题，而且酶在高聚物溶液中比在缓冲液中更稳 定，活性更大。因为生物反应和生物产物的提取同时进行， 尤其适于连续生产。
标准曲线制作：(25℃,10min后测定)
试管编号
012345
120ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
水 （ml）
0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
考马斯亮蓝试剂 （ml） 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5 2.5
A595nm
(四)、求分配系数：（蛋白质在上、 下两相中的浓度之比）
双水相萃取概述
双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同 一溶剂时，由于聚合物之间或聚合物与盐之间的不相容性， 当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成不互溶的 两相。
因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都 占很大比例(85％~95％)，活性蛋白或细胞在这种环境中 不会失活，但可以不同比例分配于两相，这就克服了有机 溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂 的缺点。
本实验采用PEG/硫酸铵双水相体系研究牛血清 蛋白的分配。
蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法，利 用考马斯亮蓝进行染色，然后检测吸光度，对 照标准曲线即可得到蛋白质含量。
2、实验目的
（1）了解双水相系统成相的原理及分配系数 的测定方法。
（2）探究双水相的形成条件，掌握双水相萃 取法分离技术。
1、实验原理
双水相是由两种互不相溶的高分子溶液或者互不相溶 的盐溶液和高分子溶液组成。常见的双水相系统可分 为两类，即双聚合物体系和聚合物/盐体系。
双水相萃取法分离提纯蛋白质是利用蛋白质在两
种物质所形成的双水相中的分配系数的不同而进行分
离的。
双水相萃取技术在萃取胞内酶中应用广泛，最常采用 的双水相体系是PEG/Dex或PEG/低分子盐系统，其中 低分子盐最常采用的是硫酸铵、磷酸钾和硫酸镁。
（NH4）2SO4 质量浓度20%
3 酸铵原
液 2.2326g(1.87ml) 4.4652(3.72ml) 4.4652(3.72ml)
（二）、分配平衡及相比测定：
在上述各管中加入500mg/L牛血清蛋白2..00ml，用 旋涡混合器对各管进行充分混合（约2分钟），静置，观 察成相情况，记录上相体积和下相体积，求相比。 小提示：为了加快分层，可在3000r/min下离心3～5 分钟 (可用10ml刻度离心管)，观察成相情况，记录上相体积和 下相体积，求相比。
三）、蛋白质含量测定：（根据成相情况，每组人员 可选测其中1管）
本实验采用的蛋白质含量测定方法为考马斯亮蓝法， 先用标准牛血清蛋白制作标准曲线，然后用分光光度 计分别检测双水相体系中上相和下相在595nm处的吸 光度（方法同标准牛血清蛋白的测定），对照标准曲 线即可得到体系中上相和下相中的蛋白质含量（若测 得吸光度值过高可稀释后再测）。