低温菌及其在环境工程中的应用_韩晓云

低温菌及其在环境工程中的应用1)韩晓云 姜安玺 何丽蓉(哈尔滨工业大学,哈尔滨,150080)摘 要 综述了国内外对低温菌在适冷性、冷活性酶及分子生物学方面的研究进展,同时探讨了嗜冷菌和耐冷菌在低温环境下对污染物的生物降解作用,认为低温微生物在环境工程中具有非常广阔的应用前景。

关键词 低温微生物;适冷机制;环境工程分类号 Q939.97Cold-adapted Microorganisms and Its Applications to Environmental Engineering/Han Xiaoy un,Jiang Anx i,He L irong(School o f M unicipal and Environmental Eng ineering,Harbin Institute of T echnolo gy,Harbin150080,P.R. China)//Jour nal of Nor theast For estr y U niversity.-2003,31(2).-33~35T his paper describes the general situations of researching on cold adapted microor ganisms in cold-adaptation,cold -enzyme and microbiolog y.I n addition,makes further discussion on psychrotrophs and psychro phlies s bio-treatment for pollutants in low temperature environment.T hese cold-adapted microo rganisms have great potential in envir onmen-tal eng ineering.Key words Cold-adapted microorg anism;Cold-adaptation mechanism;Enviro nmental engineering温度是微生物生命活动中重要的环境因子。

根据生长温度特性,微生物大致可分为3类:高温菌、中温菌和低温菌。

根据M or ito的定义,其中低温菌通常又被细分为两类:一类是必须生活在低温条件下,其最高生长温度不超过20 ,在0 可生长繁殖的微生物称嗜冷菌(Psy chrophilies);另一类其最高生长温度高于20 ,在0~5 可生长繁殖的微生物称为耐冷菌(Psy chrotrophs)。

研究低温微生物不仅有重要的理论意义,而且在生产实际和环境保护方面具有重要的应用价值,同时这类微生物是生物技术的重要基因资源。

国内外对低温菌及其应用已有了较系统的研究,而国内对这项工作的研究还不多见。

为此,本文综述了低温微生物的生态分布、适冷机制、冷活性酶、嗜冷菌的分子生物学以及在环境工程中的应用等的研究进展。

1 低温微生物的生态分布Forster于1887年首次从冻贮的鱼身上分离出有生命的低温菌,自此之后,很多学者相继从土壤、深海、冰川和积雪等低温环境中分离出低温微生物。

嗜冷菌主要分布于常冷的环境中,耐冷菌则分布范围较广,从常冷到不稳定的低温环境中均可分离到。

已发现的低温微生物有真细菌、蓝细菌、酵母菌、真菌及藻类等多种微生物类群。

在真细菌中,有自养的和异养的,好氧的和厌氧的,光合自养型和非光合自养型等。

尽管分离到的低温细菌种类繁多,但是革兰氏阴性低温菌的种类和数量大大超过革兰氏阳性菌。

2 低温微生物适应性的分子机制2.1 细胞膜和养分摄取通过对嗜冷菌、中温菌和嗜热菌的对比研究发现:只有嗜冷菌能在2 运转葡萄糖。

中温微生物在低于5 时不能代1)黑龙江省自然科学基金资助项目(E01-22)。

第一作者简介:韩晓云,女,1970年11月生,哈尔滨工业大学市政环境工程学院,讲师。

收稿日期:2002年10月15日。

责任编辑:李金荣。

谢外源物质。

微生物能否在低温条件下生长,限制因素之一是在低温时细胞是否具有转运外源营养物质进入细胞的能力。

细胞膜中脂类的组成提供了膜流动和相结构的前提条件,从而保证了膜中镶嵌的蛋白质发挥正常的功能,如离子和营养的吸收、电子转移等。

因此,当温度改变时,微生物必须调节脂类的组成,从而调节膜的流动性和相结构,以适应环境温度的变化。

最重要的膜脂质的改变是脂肪酸组成,这种改变包括含有不饱和脂肪酸比例的增加。

生长温度的降低有助于短链形成、脂肪酸甲基分支的增加、支链脂肪酸比例的增加和环状脂肪酸比例的减少。

在37 生长的E.coli的酰基脂中有15%~20%的脂肪酸是不饱和的,而且当温度低时这个百分比增加。

耐冷菌M icr ococus cry op hilus膜的脂相在温度低至-30 还保持流体。

M ur ata[1]在日本的研究组提出:蓝细菌A nacystis nidu-lans对冷的敏感程度可以通过引入克隆C12去饱和酶基因提高它的合成不饱和脂肪酸的能力来得到增加。

因此,当温度突然下降时,膜脂质通过大比例改变脂肪酸组成来恢复它的流动特性。

例如对一些杆菌随温度变化的反应说明:随温度降低的最早变化是去饱和酶的引入改变了膜脂质的不饱和性;随后有一个更漫长的反应,是脂肪酸合成改变了它的产物模式,使脂肪酸的链长和甲基支链发生变化。

这些变化对于低温时维持膜的流动性具有重要意义。

革兰氏阴性菌倾向于改变饱和度和甲基链长度,而革兰氏阳性菌更多是改变甲基链的类型和数目[2]。

2.2 低温菌的蛋白质合成中温菌,尤其是嗜热菌是冷不稳定的,它们在低温下活性降低甚至失去活性。

经研究认为造成这种不稳定的原因是:嗜热蛋白质的蛋白内部具有多余的疏水键,有利于其在高温下形成相对疏松而有弹性的结构,而当温度降低,蛋白质 紧密在一起 ,从而失去活性。

已经证实疏水键在高温下是稳定的,因此推测氢键和离子键更象是低温蛋白稳定的原因。

通过对嗜冷菌乳酸脱氢酶基因的克隆及分析已经证实了这一点[3]。

另一方面,嗜冷菌中的蛋白质是以单体和多聚物形式存在的,例如,嗜冷菌V ibr o sp.的异柠檬酸脱氢酶的单聚体第31卷第2期东 北 林 业 大 学 学 报V ol.31N o.2 2003年3月JOU RN AL OF N ORT HEA ST F OREST RY U N IVERSIT Y Mar.2003明显是嗜冷性的,它在15 以上失活,而当温度降至0 时又快速恢复活性[4]。

此外,温度还通过影响核糖体上蛋白质的翻译速率或是通过影响某种专一mRNA翻译的起始或翻译的速率,来影响合成蛋白总量或特定蛋白的相对量[5]。

K ra-jewska和Szer[6]证实:在嗜冷性假单孢杆菌中蛋白合成同中温菌和嗜热菌相比,在同样低温下有非常低的错配率。

因此很明显,低温菌的一个适应性就是在它们的翻译机理中,具有在低温下保持有效启动的特殊能力,而在中温菌和嗜热菌系统中没有。

据报道,当嗜冷性微生物生长在它们底线温度时,蛋白质含量增多。

Vckovski[7]的研究组用中温菌E.coli通过放射性标记细胞蛋白来判断生长在不同温度下的细胞蛋白的分离程度,发现当生长温度接近上限和下限时,蛋白组成有一些差异。

这些蛋白在生长范围的中间部分是很稳定的,但当温度接近13.5 和46 时,蛋白质水平有所改变。

3 冷活性酶生物的一切活动,如吸收、代谢、生长、繁殖等,都离不开酶的作用。

中温菌所产生的酶一般要求较高反应温度,而来自冷适应微生物细胞中的酶必须适应低温环境。

研究冷活性酶最早的是M orita,他报道了海产弧菌苹果酸脱氢酶在低于20 时具有催化活性,温度超过20 时则很快失活[8]。

中科院从南极的嗜冷酵母中分离纯化的琥珀酸脱氢酶,其最适反应温度为20 ,在0 能保持最大活性的60%。

但当温度升高时冷活性酶即表现出对热的敏感性。

如海洋弧菌细胞中的苹果酸脱氢酶于30 处理10min,酶活力完全丧失;丙酮酸脱羧酶在35 处理30min,酶活力损失90%[9]。

通过对淀粉酶、乳糖脱氢酶、脂酶和枯草杆菌蛋白酶等冷活性酶的空间结构和来自中温菌的相应酶进行比较,发现冷活性酶的分子适应机制似乎是氨基酸残基之间相互作用较弱,从而形成较伸展的分子结构,这种结构可在低耗能的情况下发挥催化作用[10]。

Zuber{7}及其同事从耐冷菌Bacillus psychr osaccharoly ticus中分离出乳酸脱氢酶(L DH),随后进行了克隆及序列化,并将耐冷乳酸脱氢酶基因序列同中温菌、嗜热菌比较,证明耐冷L DH具有更多的极性、带电残基、更多的疏水表面及离子配对残基,这些变化使酶的活性中心更具柔韧性,并且在低温下更稳定。

G erday[11]的课题组对耐冷淀粉酶、蛋白酶和脂酶进行了分析,并同相应的中温序列进行比较,得到了相同的结果。

辛明秀[7]等认为嗜冷菌细胞中的代谢酶类在低温(0~ 30 )范围内表现出最大活性,与中温菌的相对酶类比较,嗜冷菌细胞中的代谢酶类在温度活性范围内偏向低温,如嗜冷酵母的己糖激酶、醛缩酶和琥珀酸脱氢酶与中温的酿酒酵母细胞中同类酶相比,其最大活性温度分别降低5、5~10和20 ,嗜冷菌细胞中的有些代谢酶类在低温下具有较强的底物亲和力。

自然环境中的大多数生物转化发生在相对低温下,因此低温菌群代表了一种潜在的酶资源,它在低温生物技术工艺上比中温酶和嗜热酶发挥更有效的作用。

4 嗜冷菌的分子生物学研究4.1 基因的克隆同嗜热菌相比较,对嗜冷菌的分子基因研究很少。

耐冷性酶 -淀粉酶、蛋白酶、脂酶、乳酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶和 -半乳糖苷酶等几种耐冷酶的基因已经被克隆并序列化[12~15]。

日本的M urata[16]的研究小组证实了蓝细菌C12去饱和酶的活性和耐冷菌在低温下生长之间的关系,他们从耐冷菌Synechocystis还克隆了C12去饱和酶desA基因,并且把它转到常温菌A nacy stis nidulans中,使它具有活性去合成饱和脂肪酸(主要是C9、C12),同时能适应低温环境。

甲苯降解质粒从嗜热菌P.p utide中转移到耐冷菌P.p utide中后,甲苯降解基因在低温下能够表达,在0 可以生物降解甲苯[17]。

至今为止,分子生物学研究的方向是分离出足够的蛋白,测序并进行蛋白晶体的研究。

关于耐冷蛋白的生成和翻译规则方面还有待进一步的研究。

4.2 冷激蛋白当温度突然降低,细胞中会产生一种冷休克反应,即一种特殊形式的基因表达使细胞适应这一急剧降低的低温环境。

Jores[18]观察到将大肠杆菌从37 突然转移到10 时,会产生一种冷休克蛋白,主要的冷休克蛋白是CSPA,它结合于本身基因的启动子上,作为转座因子对冷诱导基因的表达起作用。